Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mätning ran peptid toxicitet i C. elegans

Published: April 30, 2020 doi: 10.3791/61024
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Upprepade-associerade icke-ATG-beroende translationella produkter är nya patogena funktioner i flera upprepa expansion-baserade sjukdomar. Målet med det protokoll som beskrivs är att utvärdera toxicitet orsakad av dessa peptider med hjälp av beteendemässiga och cellulära analyser i modellsystemet C. elegans.

Abstract

C. elegans används ofta för att modellera åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar som orsakas av upprepade expansionsmutationer, såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS) och Huntingtons sjukdom. Nyligen upprepade expansion-innehållande RNA visade sig vara substratet för en ny typ av protein översättning kallas upprepa-associerade icke-AUG-beroende (RAN) översättning. Till skillnad från kanonisk översättning kräver RAN-översättning inte en startkodon och inträffar endast när repetitionerna överskrider en tröskellängd. Eftersom det inte finns någon startkodon för att bestämma läsramen sker RAN-översättning i alla läsramar från både sense- och antisense RNA-mallar som innehåller en upprepningsexpansionssekvens. Därför utökar RAN översättning antalet möjliga sjukdomsrelaterade toxiska peptider från en till sex. Hittills har RAN översättning dokumenterats i åtta olika upprepa expansion-baserade neurodegenerativa och neuromuskulära sjukdomar. I varje enskilt fall är dechiffrera vilka RAN-produkter som är giftiga, liksom deras mekanismer för toxicitet, ett kritiskt steg mot att förstå hur dessa peptider bidrar till sjukdomens patofysiologi. I detta dokument presenterar vi strategier för att mäta toxiciteten hos RAN-peptider i modellsystemet C. elegans. Först beskriver vi förfaranden för att mäta RAN peptid toxicitet på tillväxt och motilitet att utveckla C. elegans. För det andra beskriver vi en analys för att mäta postdevelopmental, åldersberoende effekter av RAN peptider på motilitet. Slutligen beskriver vi en neurotoxicitet analys för att utvärdera effekterna av RAN peptider på neuron morfologi. Dessa analyser ger en bred bedömning av RAN peptid toxicitet och kan vara användbara för att utföra storskaliga genetiska eller små molekyler skärmar för att identifiera sjukdomsmekanismer eller terapier.

Introduction

Den olämpliga expansionen av DNA-repetitionssekvenser är den genetiska grunden för flera neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS), frontotemporal demens (FTD) och Huntingtons sjukdom (HS)1. Även om det finns etablerade cellulära och djurmodeller för dessa sjukdomar, mekanismer bakom dessa villkor är inte väl definierade. Till exempel orsakas HD av expansioner av en CAG-upprepningssekvens i kodningssekvensen för Huntingtin-proteinet Htt2. Eftersom CAG kodar aminosyran glutamin, CAG upprepa expansion resulterar i införandet av en polyGlutamin, eller polyQ, sekvens inom Htt. Expanderade polyQ proteiner bildar längd- och åldersberoende proteinaggregat som är associerade med toxicitet3,4. Överraskande, två nyligen genomförda studier tyder på att längden på polyQ sekvensen inte är den viktigaste drivkraften för HS sjukdom debut, vilket tyder på att polyQ-oberoende faktorer kan också bidra till sjukdomen5,6.

En möjlig polyQ-oberoende mekanism innebär en nyupptäckt typ av proteinöversättning som kallas Repeat Associated Non-AUG-beroende (RAN) översättning7. Som namnet antyder inträffar RAN-översättningen endast när en utökad upprepad sekvens är närvarande och inte kräver en kanonisk start kodon. Därför förekommer RAN-översättning i alla tre läsramarna i upprepningen för att producera tre distinkta polypeptider. Dessutom, eftersom många gener också producerar en antisense avskrift som innehåller den omvända komplement av den utökade upprepa sekvensen, RAN översättning förekommer också i alla tre läsramar av antisense avskrift. Tillsammans utökar RAN översättning antalet proteiner som produceras från en utökad upprepad DNA-sekvens från en peptid till sex peptider. Hittills har RAN översättning observerats i minst åtta olika upprepade expansionsstörningar8. RAN peptider observeras i postmortem patientprover och endast i de fall där patienten bär en utökad upprepa9,10. Medan dessa peptider är tydligt närvarande i patientceller, deras bidrag till sjukdomen patofysiologin är oklart.

För att bättre definiera den potentiella toxicitet som förknippas med RAN peptid, flera grupper har uttryckt varje peptid i olika modellsystem, såsom jäst, flugor, möss, och vävnadsodling celler11,12,13,14,15,16. I stället för att använda upprepningssekvensen för uttryck använder dessa modeller en kodonvariationsmetod där upprepningssekvensen elimineras men aminosyrasekvensen bevaras. Översättning inledande sker genom en kanonisk ATG och peptid är vanligtvis smält till ett fluorescerande protein vid antingen N- eller C-ändstation, varav ingen verkar störa RAN peptid toxicitet. Därför överuttrycker varje konstruktion en enda RAN peptid. Modellering av de olika RAN-produkterna i en flercellig organism med enkla analyser för att mäta RAN-peptidtoxicitet är oerhört viktigt för att förstå hur de olika RAN-produkterna från varje sjukdomsframkallande upprepad expansion bidrar till cellulär dysfunktion och neurodegeneration.

Liksom andra modellsystem erbjuder C. elegans en flexibel och effektiv experimentell plattform som möjliggör studier av nya sjukdomsmekanismer, såsom RAN-peptidtoxicitet. Maskar erbjuder flera unika experimentella attribut som för närvarande inte finns i andra modeller av RAN peptid toxicitet. För det första är C. elegans optiskt transparent från födseln till döden. Detta möjliggör enkel visualisering av RAN peptid uttryck och lokalisering, samt in vivo analys av neurodegeneration hos levande djur. För det andra är transgena metoder för att generera RAN peptiduttrycksmodeller billiga och snabba. Med tanke på C. elegansskorta tredagars livscykel kan stabila transgena linjer som uttrycker en given RAN-peptid på ett specifikt celltypssätt produceras på mindre än en vecka. För det tredje kan enkla fenotypiska utgångar kombineras med genetiska screeningmetoder, såsom kemisk mutagenesis eller RNAi screening, för att snabbt identifiera gener som är väsentliga för RAN peptidtoxicitet. Slutligen, den korta livslängden på C. elegans (~ 20 dagar) tillåter utredare att avgöra hur åldrande, som är den största riskfaktorn för de flesta upprepade expansionssjukdomar, påverkar RAN peptid toxicitet. Tillsammans är denna kombination av experimentella attribut oöverträffad i alla andra modellsystem och erbjuder en kraftfull plattform för studier av RAN peptidtoxicitet.

Här beskriver vi flera analyser som utnyttjar de experimentella fördelarna med C. elegans för att mäta toxiciteten hos RAN-peptider och för att identifiera genetiska modifierare av denna toxicitet. Den kodon-varierade ATG-initierade RAN peptider är märkta med GFP och uttryckt individuellt i antingen muskelceller under myo-3 promotorn eller i GABAergic motor nervceller under unc-47 promotorn. För uttryck i muskelceller är det viktigt att giftiga RAN-peptider är märkta med grönt fluorescerande protein (GFP), eller andra fluorescerande protein (FP) tagg som kan riktas med en RNAi utfodring vektor. Detta beror på att giftiga RAN peptid uttryck blockerar vanligtvis tillväxt, vilket gör sådana stammar nonviable. Användningen av gfp (RNAi) inaktiverar villkorligt RAN peptid uttryck och tillåter stam underhåll, genetiska kors, etc. För analyser avlägsnas dessa djur från gfp(RNAi),vilket möjliggör uttryck av RAN-peptiden och de resulterande fenotyperna. Förutom den molekylära strategin för att utforma codon-varierade RAN peptid uttryck konstruktioner, beskriver vi analyser för att mäta utvecklingsmässiga toxicitet (larvmotilitet och tillväxt analys), post-developmental åldersassocierade toxicitet (förlamning analys), och neuron morfologiska defekter (commissure analys).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generera kodon-varierade RAN peptid uttryck konstruktioner

  1. Designa den individuella RAN peptidkodningssekvensen med synonyma kodon för att eliminera den grundläggande repetitiva DNA/RNA-strukturen men bevara den överliggande aminosyrasekvensen.
  2. Beställ de anpassade kodonsekvenserna kommersiellt vid de upprepningslängder som behövs för studierna (vanligtvis 5–100 repetitioner). Inkludera en hindIII begränsning plats vid 5's och en BamHI begränsning plats vid 3 för att underlätta kloning i C. elegans uttryck vektorer, såsom pPD95.79.
    OBS: Om syntesen av större konstruktioner visar sig vara svår, kan mindre byggstenssekvenser syntetiseras och sedan byggas in i större repetitioner med hjälp av en riktningsligeringsstrategi17.
  3. Subclone peptidsekvensen till en C. elegans uttryck vektor med hjälp av standard T4 ligering metoder.
  4. Subclone en cell typ-specifika promotorn sekvens som genereras av PCR framför RAN peptid sekvens för att driva vävnad-specifika RAN peptid-GFP uttryck.
  5. Microinject RAN peptid konstruera i gonad av vild typ C. elegans att generera transgena stammar som innehåller extrachromosomal arrayer med standardmetoder18. För en co-injektion markör, muskel-specifika RFP reporter(myo-3p::RFP (pCFJ104)) användes, även om andra markörer kan användas också.
  6. Integrera ett stabilt transgen i genomet med standard C. elegans integration screening metoder19.
  7. Om RAN-peptiden är giftig och transgena djur inte överlever, mata djur gfp (RNAi) som uttrycker bakterier före och efter injektionen för att tysta uttrycket av det giftiga proteinet.
    OBS: Avlägsnande av djur från gfp (RNAi) möjliggör RAN peptid uttryck för fenotypiska analyser med hjälp av de analyser som beskrivs nedan.

2. Mätning av utvecklingstoxiciteten hos RAN-peptider efter RNAi-baserad genut knockdown: Videohastighetsanalysprotokoll

  1. Häll standard nematod tillväxtmedium (NGM) RNAi 24 väl plattor med 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) och 25 μg/mL karbensillin.
  2. Strimla ut RNAi-matningskloner i HT115-bakterier som ska testas på Luria-buljong (LB) + karbatikillin (25 μg/ml) agarplattor och odla bakterier vid 37 °C för 24 h. Inkludera tom vektor (RNAi) som den positiva kontrollen för toxicitet och gfp(RNAi) som negativ kontroll.
  3. För varje klon, plocka en enda koloni i 1 ml LB + karbatikillin flytande media och odla bakterier över natten i 18 timmar vid 37 ° C medan skakar vid 250 rotationer per minut (RPM).
  4. Fläck fyra individbrunnar av NGM RNAI 24 brunnar med 20 μL av efter natten bakterie- kulturer: kolonn 1 brunnar = gfp(RNAi); kolumn 2 brunnar = (EV)RNAi; kolumnerna 3–6 brunnar = RNAi mot gener som ska testas. Låt RNAi-bakterier inducera dsRNA-produktion över natten vid rumstemperatur (RT).
  5. Isolera ägg från dag ett vuxen C. elegans som uttrycker den integrerade RAN-peptidregen med hjälp av standardhypokloritmetoden och frö ~30 C. elegans ägg i varje brunn av NGM RNAi 24 brunnsplattan.
  6. Inkubera de 24 brunnarna vid 20 °C i 7 dagar.
    OBS: Denna inkubationstid gäller stammar som uttrycker giftiga C9orf72 RAN-dippeptider, såsom PR50 eller GR50. Andra stammar kan kräva kortare inkubationstider för att förhindra utmattning av bakteriekällan och efterföljande svält.
  7. Skaffa videor med överfört ljus med hjälp av ett Leica MZ16FA-stereodissekterande mikroskop utrustat med en DFC345FX-svartvit kamera ansluten till en Windows-kompatibel dator som kör Leica AF-programvara för videoinsamling (version 2.6.0.7266).
    1. Skaffa två videor från två separata brunnar för varje RNAi-villkor med hjälp av konsekventa videoförvärvinställningar mellan brunnar. För varje video, förvärva 10 sekunder med 800 x 600 pixel upplösning och 13,16 bilder per sekund (tid voxel dimension = 0,076 sekunder) med 18,6 X förstoring (1,49 zoominställning i AF-programvara). Ställ in bildexponeringstiden på 4 millisekunder. Märk varje video omedelbart med stammen, RNAi skick, och väl antal.
  8. Förblinda experimentören till genotypen som är associerad med varje videofil genom att randomisera ordningen på videorna och ändra namnet på videorna till siffror. Spara den här gruppen videoklipp som en ny fil. Avblinda experimentören när analysen är klar.
  9. Mät "tillryggalagda avstånd" och längden på varje djur för 20 olika djur från varje video, undersöker totalt ~ 40 maskar för varje RNAi villkor.
    1. I programvaran väljer du knappen för anteckningsverktyg och sedan rita textverktyget. Klicka på en punkt i mitten av masken som mäts i den första bildrutan av videon och markera den som ett nummer. För videon till slutet medan du visuellt spårar maskens rörelsebana. I den sista bildrutan klickar du på en punkt i mitten av masken som mäts och markerar nästa motsvarande nummer. Rita sedan en linje från det första talet till det andra numret med verktyget Rita vågbar om du använder verktyget Rita skala.
    2. Tillryggalagda avstånd är avståndet mellan de två centroidpunkterna. Detta avstånd visas intill mätlinjen. Spela in den här mätningen i ett kalkylblad. Upprepa denna mätning för 19 andra maskar i videon samtidigt som varje enskild mätning bevaras i analysfönstret.
  10. Gör mätningar från djur som uppvisar den mest robusta rörelsen för att undvika att djuren inte utsätts för någon rörelse och för att förlama uppgifterna mot förlamning. När mätningarna är klara ska du ta en ögonblicksbild av den slutliga videoramen som illustrerar alla mätlinjer så att data kan spåras tillbaka till det djur från vilket de har sitt ursprung.
  11. Analysera data med hjälp av ett kalkylblad med fyra kolumner. Kolumn ett är masken "identifierare", kolumn två är den tillryggalagda sträckan / tiden (hastighet).
    1. Tiden för varje video kan hittas genom att högerklicka på videon under experimentet och gå till egenskaperna hos videon.
  12. Normalisera hastighetsmätningen genom att hitta längden på varje djur genom att välja Kvantifiera, sedan Statistik över programvaran. Om du klickar på anteckningsverktygets ikon på videovisningen bör det göra det möjligt att använda verktyget "Rita polyline". Detta verktyg kan sedan användas för att fritt spåra C. elegans från videon från spetsen på huvudet till spetsen av svansen. Radens längd registreras under statistiken.
    1. Ta en ögonblicksbild av den slutliga videoramen som illustrerar alla polyline används för dimensionering av C. elegans så att uppgifterna kan spåras tillbaka till det djur som de har sitt ursprung.
  13. Analysera data genom att lägga till ytterligare två kolumner i kalkylbladet. Kolumn tre är "Animal Length", och kolumn fyra är "Normaliserad hastighet" (hastighet / djur längd). Analysera de normaliserade hastighetsdata med hjälp av en enkelriktad ANOVA med post-hoc-testning kontra tom vektor(RNAi).

3. Mätning av utvecklingstoxicitet av RAN-peptid: Tillväxtanalys

  1. Plocka ~30 dräktiga djur till en 50 μL fläck av hypokloritlösning (10 ml blekmedel, 2,5 ml 10 N NaOH, 37,5 ml dH2O) på antingen en gfp(RNAi), (EV)RNAi eller (genspecifik) 6 cm RNAi-platta.
  2. Efter 24 h, flytta sex transgena avkomma som har kröp ut ur hypoklorit lösning plats till en ny 6 cm RNAi plattan identisk med RNAi villkor på plattan där de utsattes för hypoklorit lösning behandling. Sätt dessa avkomma (F1) vid 20 °C för att växa och reproducera.
  3. Efter 24–48 timmar, plocka 10 transgena L4 djur på 6 cm RNAi som matchar RNAi villkor som djuren har vuxit på. Låt djuren pulsera lägga ägg i 24 timmar i en 20 °C-inkubator.
  4. Efter 24 timmar, ta bort de vuxna djuren och kasta dem. Räkna antalet ägg och L1 larver som läggs under 24 h perioden med hjälp av en mekanisk handhållen räknare. Detta är den totala kullstorlek.
  5. Räkna antalet djur som når L4 eller äldre scenen under de kommande 72 h. När varje djur räknas, ta bort det från plattan.
  6. Kvantifiera "Procenttillväxt" som andelen djur som når L4 eller äldre skede av den totala kullstorlek.
  7. Utför en 2 x 2 Fishers exakta test jämfört med tom vektor (RNAi) för att avgöra om den procentuella tillväxten är statistiskt signifikant. Kategorierna för jämförelse är "Tillväxt" (# av djur som nådde L4 eller äldre skede i 72 h) och "Ingen tillväxt" (total kullstorlek minus antalet djur som når L4 eller äldre stadium i 72 h).

4. Post-developmental RAN peptid förlamning analys

  1. Håll integrerade C. elegans transgena stammar som uttrycker RAN peptid-GFP i muskeln på gfp(RNAi) genom att placera 4–6 transgena L4's på en 6 cm gfp(RNAi) platta och odla maskarna vid 20 °C.
  2. Om experimentet använder RNAi för att testa för genetiska effekter på RAN peptid toxicitet, flytta 10 transgena gravida vuxna från en unstarved platta till var och en av två 6 cm tom vektor(RNAi) (positiv kontroll för förlamning, negativ kontroll för genetiska effekter), gfp (RNAi) (negativ kontroll för förlamning, positiv kontroll för genetiska effekter), gen-specifika(RNAi) (dvs. 1 gravid gravid vuxna per 6 cm platta).
  3. Om mutanter används för att analysera genetiska effekter på RAN-peptidtoxicitet, placera 10 dräktiga WT- eller muterade djur som uttrycker samma RAN-transgen på var och en av två 6 cm tomma vektorplattor(RNAi) eller gfp(RNAi). Odla maskarna vid 20 °C i 48 timmar.
  4. Plocka 10 uppsättningar av 10 transgena L4:er från RNAi-plattorna på 6 cm och placera varje uppsättning på en 3 cm RNAi-platta (dvs. n = 100 djur för varje genotyp). Se till att L4:s valda för analysen alla har ytligt normal motilitet. Placera plattorna i en dragkedja förvaringspåse för att behålla fukt.
  5. Placera påsplattorna med L4 i 25 °C-inkubatorn.
  6. Ta bort djuren 24 timmar senare från 25 °C-inkubatorn en stam i taget för att minimera den tid de är ute vid RT.
  7. Knacka på plattorna på dissekering mikroskop för att kontrollera förflyttning. Om djuren rör sig mer än en kroppslängd, räkna djuret som mobil och överföra det till en ny 3 cm RNAi-platta. Använd en platina plocka för att peka på de återstående maskar på huvudet eller svansen. Om djuret rör sig mer än en kroppslängd, räkna djuret som mobil och överföra det till en ny 3 cm RNAi platta.
    OBS: Överskrid inte 10 maskar per platta vid överföring. Var noga med att undvika att flytta avkomma till den nya RNAi-plattan eftersom analysen endast beror på efter äldre djur.
  8. Gruppera alla maskar som inte rör sig tillsammans så att rörelse av mer än en kroppslängd lätt kan upptäckas. Ge djuret minst en minut att flytta mer än en kroppslängd. Om det fortfarande inte rör sig, är det förlamad, säckar (dvs larver kläckts inuti mor), eller döda.
  9. Censurera djur som uppvisar uppsamlare, torka på sidorna av plattan, uppvisar extruderade tarmar, håla, försvinner eller dör av analysen vid detektionstillfället. Förlamade maskar räknas, lämnas på den gamla RNAi plattan, och kasseras.
  10. Betygsätta djuren för förlamning varje dag i 5–7 dagar enligt beskrivningen i steg 4.6–4.9.
  11. Analysera förlamningsdata med ett log-rank-test identiskt med det som används för att analysera livslängden. I denna statistiska analys görs rörliga maskar som "Alive", förlamade maskar som "Dead", och döda, säckar, gut extruderad, uttorkad, grävde, grävda, eller på annat sätt förlorade maskar poängsätts som "Censurerade".
    I den här analysen anger "Procent vid liv"-talet djuren "Procentflyttning". Den omvända representerar "Procent förlamad". Använd onlineanalysverktyget OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/) för att utföra log-rank statistiska analyser.

5. Mätning av neuronpatologi: Commissure-analys

  1. Generera transgen C. elegans som uttrycker RAN-peptiden av intresse för GABAergic-nervcellerna med hjälp av promotorn unc-47. Också uttrycka unc-47p::GFP eller unc-47p::RFP att avslöja cellulärmorfologi av GABA nervceller.
  2. Plocka 50 transgena L4 djur och placera dem på en 6 cm OP50 platta vid 25 °C för 24 h.
  3. Överför de 50 transgena djuren till en ny OP50-platta på 6 cm vid 25 °C i 24 timmar.
  4. Gör agarose kuddar för bildbehandling djuren under widefield mikroskopi.
    1. Placera två tejpdelar ovanpå två mikroskopbilder. Placera en rengjord bild utan tejp i mitten av de två tejpade bilderna.
    2. Fördela ~100 μL (1 droppe från en engångsplast Pasteur pipett) på 3% smält agarrose på den mellersta bilden med en disponibel steril överföring pipett.
    3. Placera omedelbart en andra ren bild över droppen av smält agaros så att den vilar på tejpade diabilder och skapar ett tunt och jämnt lager av agaros mellan bilderna.
    4. När agaroset har svalnat och stelnat, ta försiktigt bort de två bilderna med lagret av agaros mellan dem, utan att separera dem, och placera dem i en plastpåse med ett fuktigt papper under dem. Gör en bild per 10 maskar som ska undersökas tillsammans med tre extra diabilder.
  5. Ta bort den transgena C. elegansen från 25 °C-inkubatorn och plocka 10 transgen C. elegans i en 100 μL droppe 10 mM levamisole i en glasdepressionsrutschbana. Inkubera i 10 min eller tills djuren är förlamade.
  6. Ta bort ett skjutpar från plastpåsen och separera dem försiktigt. Märk bilden med agarose med genotypen och tillsätt 2 μL av 10 mM levamisole till mitten av agarose. Flytta de 10 djuren till levamisole på agarose pad. Täck djuren med en #1 tjocklek täckslip.
  7. Bilddjur där vulva är orienterad så att den är på höger sida av djuret. Om vulva är på vänster sida av huvudet, kommer commissures av motoriska nervceller vara under djuren och inte lika tydligt synliga, vilket gör exakt kvantifiering svårt. Utelämna kvantifiering från dessa djur. I denna riktning, commissures av motoriska nervceller är närmast coverslip och är tydligt synliga på en inverterad widefield fluorescens mikroskop. Visualisera neuron commissures uttrycker GFP med en Leica DMI4000B inverterad widefield fluorescens mikroskop med en 63X 1.4X NA olja nedsänkning lins och en Leica L5 GFP filteruppsättning (Ex480/40nm; Em527/30nm). Om neuron commissures express RFP istället för GFP, använda en Leica TX2 RFP filteruppsättning (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Visualisera neuron commissures uttrycker GFP med en inverterad widefield fluorescens mikroskop med en 63x 1.4x NA olja nedsänkning lins och en GFP filteruppsättning (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Om neuron commissures uttrycka RFP istället för GFP, utnyttja en röd fluorescerande protein (RFP) filteruppsättning (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. Bild av maskarna inom 45 minuter efter att ha placerat täcket på maskarna för att minimera toxicitet från immobilisering.
  9. För varje mask, räkna antalet synliga commissures. Det finns 16 synliga commissures i vilda djur. Räkna också antalet commissures som har stora pärlor (dvs. blebs) i commissures samt antalet commissures som är trasiga. För att bekräfta att commissure är bruten, följ commissure från dorsala sladden till ventrala sladden genom att justera fokalplanet.
    OBS: Commissures där unc-47p::GFP fluorescens uppvisar en lucka anses bruten. En bruten commissure har vanligtvis en bleb på vardera sidan av rasten, vilket hjälper till att visa att commissures är bruten. Räkna mängden blebbing och raster för 20 maskar.
  10. Beräkna fraktionen av commissures med blebs eller avbrott över det totala antalet observerade commissures för varje djur. Det absoluta antalet commissures som räknas per djur (inklusive vilda typer, blebbed och trasiga händelser) kan också mätas.
  11. För varje kategori beräkna medelvärdet ± SD och analysera statistiskt med antingen en students t-test för jämförelse mellan två populationer eller en enkelriktad ANOVA för jämförelser mellan 3 eller fler populationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi använde de analyser som beskrivs här för att utvärdera effekten av olika genhämningar på toxiciteten av RAN dipeptider som finns i ALS patienter med en G4C2 upprepa expansion. Med hjälp av tillväxtanalys för att mäta utvecklingsmässiga toxicitet, analyserade vi effekterna av flera genetiska knockout mutanter identifieras i ett genom-hela RNAi skärm suppressors av muskel-uttryckt PR50-GFP toxicitet. Även uttryck för PR50-GFP ensam resulterade i en helt penetrerande tillväxt gripande, förlust av funktion mutationer i flera gener undertryckta PR utvecklingstoxicitet från 12-94% (Figur 1A).

Vi mätte också effekten av specifika gen knockdowns på utvecklingsmässiga motilitet pr50-uttrycker djur med hjälp av video hastighet analysmetod. Som väntat resulterade gfp(RNAi) i en stor ökning av motilitet jämfört med tom vektor (RNAi) på grund av hämning av PR50-GFP uttryck. Vi upptäckte också att RNAi mot proteasome subunit rpn-7 resulterade i en betydande ökning av PR50 motility (Figur 1B).

ALS, liksom många neurodegenerativa sjukdomar, förekommer hos vuxna. Därför analyserade vi vuxna fenotyper med hjälp av åldersberoende förlamningsanalys. PR50-GFP uppvisade upp till 80% förlamning av 5 dagars ålder. RNAi riktar sig dock mot genen cul-6 kraftigt fördröjd förlamning, vilket tyder på att cul-6 krävs för PR50-GFP toxicitet (figur 1C). Denna effekt var specifik för cul-6 (RNAi) eftersom cul-1 (RNAi) inte förändrade PR50-GFP toxicitet.

Neurodegenerativa proteiner, såsom giftiga RAN peptider, är vanligen modelleras i kroppsväggen av C. elegans4,20,21,22. Emellertid, Det är också viktigt att avgöra om RAN proteiner orsaka neuropatologi när de uttrycks i C. elegans nervceller, eftersom neuron-specifik toxicitet är ett vanligt inslag i många neurodegenerativa sjukdomar. Vi undersökte neuron-specifik toxicitet med hjälp av commissure analysen. I dag 2 vuxna, PR50-GFP uttryck i motoriska nervceller ledde till en betydande ökning av motor neuron blebbing. Denna neuropatologi undertrycktes signifikant av en mutation i insulin/IGF-receptorgenen homolog daf-2 som försenar de toxiska egenskaperna hos flera neurodegenerativa proteiner23 (figur 2B).

Figure 1
Figur 1: Analyser för att utvärdera toxiciteten hos muskelbetryckt RAN-peptider. (A)RAN peptidtillväxtanalys. De indikerade mutanter korsades in i drIs34 (myo-3p::PR50-GFP)genetisk bakgrund under gfp (RNAi) villkor. Siffror ovanför varje genotyp anger antalet avkommor som poängsätts för tillväxt. Alla genotyper har p < 0,05 med Fishers exakta test jämfört med vild typ. (B)Video hastighetsanalys för att mäta RAN peptid toxicitet under utveckling. drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) djur odlades under GFP (RNAi), tom vektor (RNAi), eller rpn-7 (RNAi) villkor och sedan poäng för motilitet som beskrivs. Hastigheten normaliserades till gfp (RNAi) behandlade djur. Data som visas är medelvärde ± SD, n = 40 för varje genotyp. **-p < 0.01, ***- p < 0.001, enkelriktad ANOVA med Tukey efter testet. C)Förlamningsanalys för att mäta åldersuppfällighet. drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) djur odlades på tom vektor (RNAi) ("WT"), cul-1 (RNAi), eller cul-6 (RNAi) och förlamning gjordes som beskrivs varje 24 h. ***-p < 0.001, log-rank test med Bonferroni efter testet korrigering vs WT. n = 100 djur per genotyp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Analys för mätning av neuropatologi av motorneuron uttryckt RAN peptider. (A) Bilder av vuxna C. elegans som uttrycker unc-47p::GFP motor neuron reporter i vild typ eller unc-47p::PR50-GFP uttrycker djur. Bilderna för vild typ illustrerar normal commissure morfologi. Bilder representerar tillplattade Z-serien stackar som erhållits genom widefield fluorescensmikroskopi. PR50-djur visar exempel på commissure brott och blebbing. (B)Effekten av daf-2 (e1370) på PR50 commissure blebbing. Poäng representerar procent blebbing commissures från ett enda djur, med medelvärdet och SD visas. n = 20 djur per genotyp **-p < 0,01, enkelriktad ANOVA med Dunns post-hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här rapporterar vi metoder som kan användas för att analysera RAN peptid toxicitet modelleras i muskeln eller i nervceller i C. elegans. Medan neurodegenerativa proteiner har en ålder debut fenotyp hos mänskliga patienter, de kan också uppvisa utvecklingsmässigt toxicitet när överuttrycks i modellsystem. Överuttryck har betydande tolkningsbegränsningar, men det ger också en kraftfull utgångspunkt för genetiska eller farmakologiska skärmar som syftar till att identifiera gener eller läkemedel som kan vända giftiga fenotyper. Detta är särskilt viktigt med tanke på att de flesta exakta djurmodeller av sjukdomen har antingen ingen fenotyp eller svaga fenotyper som inte lämpar sig för opartisk screening metoder24,,25,26. Våra C. elegans RAN peptidmodeller och analyser utgör en kraftfull, kompletterande metod för andra RAN peptidmodellsystem, såsom jäst och Drosophila, för att förstå de cellulära vägar som är viktiga för toxiciteten hos dessa nyligen beskrivna proteiner.

Villkorlig toxicitet hos muskeluttryckda RAN-peptider
Mätning ran peptid toxicitet kräver en jaktperiod för eliminering av effekterna av gfp (RNAi). Tiden mellan avlägsnandet från gfp(RNAi) och uppkomsten av fenotyper kan dock vara inkonsekvent om man inte tar hänsyn till exakt tid för inledandet av experiment, val av iscensatta djur, temperaturväxlingar etc. Som vi har blivit mer erfarna med dessa analyser, timing och penetrance av RAN peptid fenotyper har blivit relativt konsekvent. Ett av de mest kritiska stegen i dessa analyser är den korrekta förskjutningen av djur till 25 °C. Utan denna förändring uppvisar RAN-peptider signifikant svagare toxicitet. Djur kan dock inte ständigt odlas vid 25 °C eftersom de inte växer och förökar sig, förmodligen på grund av högre baslinjeuttryck av RAN-peptiden. Detta är inte olikt situationen i jäst eller Drosophila där stammar som uttrycker giftiga RAN peptider hålls under tillåtande förhållanden (dvs. låg temperatur) men sedan akut flyttas till restriktiva förhållanden (dvs högre temperatur) före analysen13,15 för att förbättra peptid uttryck. I sådana system för villkorade uttryck kan genetiska tillstånd som förbättrar eller undertrycker toxicitet bero på förändringar i peptiduttrycksnivåer. För att avgöra om genetiska modifierare av RAN peptid toxicitet agera via förändringar i transgen uttryck nivåer, vi tar två metoder. För det första uttrycker många av våra transgena stammar en andra RFP-reporter under kontroll av samma promotor som används för att driva uttryck för RAN-peptiden. Förändringar i promotorns aktivitet som orsakar minskat eller ökat RAN-peptiduttryck orsakar liknande minskningar eller ökningar av RFP-nivåer. Vi anser mutanter eller RNAi villkor som avsevärt ändra RFP nivåer att agera ospecifikt. För det andra utför vi kvantitativa PCR och västra blotting för att avgöra om nivåerna av RAN peptid mRNA eller protein ändras mellan villkor. Emellertid, Västra-baserade upptäckt av RAN peptid kan ibland visa sig svårt eller omöjligt, som vi och andra har observerat med C9orf72-härledda RAN peptid PR50-GFP. I sådana fall kvantifierar vi in vivo GFP-nivåer för att avgöra om proteinuttryck ändras mellan de villkor som jämförs.

Utvecklingstoxicitet: Fördelar och begränsningar
Påtvingad överuttryck av giftiga RAN-peptider i muskeln leder ofta till utvecklingsgripargrip i C. elegans. Även om detta uppenbarligen inte efterliknar mänskliga sjukdomar patologi, det ger en kraftfull utgångspunkt för genetiska suppressor skärmar, eftersom RAN toxicitet suppressors är lätt identifieras som djur som växer och reproducerar i avsaknad av gfp (RNAi). Vissa suppressors kommer att underlätta tillväxten på grund av minskning av transgenuttryck. För att skilja mellan dessa möjligheter, inkluderar vi i allmänhet en andra RFP reporter drivs av samma promotor i vår RAN peptid transgen stam. Suppressorer som minskar eller tystar transgenuttryck uppvisar också reducerade RFP-uttrycksnivåer. Å andra sidan, suppressors som uppvisar normala eller förhöjda RFP nivåer är osannolikt att fungera via minskning av transgen uttryck. Ungefär som användningen av jäst tillväxt eller Drosophila öga morfologi13,15,27, dessa metoder, medan inte exakt modellering aspekter av sjukdomen hos människor, ger en kraftfull screening verktyg för den första identifieringen av RAN peptid modifierare.

Toxicitet efter utveckling (analys av förlamning): Fördelar och begränsningar
Fördelen med förlamningsanalysen är att ett relativt stort antal djur (50–100) kan mätas med verktyg som finns i alla masklabb. Förlamning är också en allvarlig fenotyp som lätt detekteras. Den huvudsakliga begränsningen av denna analys är som är okänslig för rörelsedefekter som inte orsakar fullständig förlamning. Sådana fel kan kräva känsligare och mer kvantitativa metoder för att mäta, såsom strykanalyser eller kinematiska rörelseanalyser28. Förlamningsanalyser bör utföras förblindade för genotyp om möjligt och försiktighet bör iakttas för att säkerställa att maskar inte genomgår någon annan typ av stress (t.ex. kontaminering, svält), som avsevärt kan påverka analysresultaten. C. elegans uttrycker giftiga RAN peptider ibland misslyckas med att uppvisa en robust förlamning fenotyp. Detta beror sannolikt på att ihållande effekter av gfp(RNAi) fortsätter att undertrycka RAN peptid uttryck. I dessa fall, om vi inte observerar betydande förlamning (>10%) i den tomma vektor (RNAi) kontroll djur efter dag 2, avslutar vi vanligtvis analysen och initiera en annan replikat. En ändring av denna analys kan innebära användning av alternativa inducible RAN peptid uttryckssystem. Det enda andra vanliga inducerbara uttryckssystemet för C. elegans är värmechockspromotorn. Den nödvändiga värmechocken kan dock orsaka stressreaktioner som kan påverka proteinernas toxicitet. Den framtida tillämpningen av andra system för villkorsuttryck, såsom det auxin-inducerbara degron (AID) systemet29, kan avsevärt öka vår förmåga att studera RAN peptid toxicitet.

Neurodegeneration/commissure-analys: Fördelar och begränsningar
Motor neuron commissures i C. elegans representerar axon av en motor neuron passerar mellan ventrala och dorsala nervösa sladdar. Blebbing och brott kan lätt upptäckas i de isolerade commissures, så att neurodegeneration snabbt kvantifieras i levande djur (figur 2). Medan undersöka djuren, Det är viktigt att de inte ruvar i levamisole under en längre tid eftersom detta kan orsaka för tidig djurdöd, vilket leder till neuronal blebbing och brott i avsaknad av giftiga RAN peptid. I vissa fall är commissures helt urartade och inte längre synliga. Därför kan de inte poängsättas för neuropatologiska funktioner eftersom vår analys mäter procentsatserna av commissures bruten eller blebbing av det totala antalet observerade commissures. I dessa fall kan commissure-analysen underskatta effekten av RAN-peptiden.

Sammanfattningsvis är de analyser som beskrivs i detta dokument användbara för att mäta toxicitet orsakad av RAN-peptider i C. elegans. Med hjälp av gfp(RNAi) för att reglera uttrycket av proteiner gör det möjligt att observera fenotyper efter utveckling. Våra metoder kan enkelt anpassas för att utföra storskaliga genetiska skärmar för suppressorer eller förstärkare av toxicitet. Sekundära analyser, såsom förlamningsanalys och commissure analys kan bekräfta att toxicitet undertrycks post-utvecklingsmässigt och testa om mekanismen för undertryckande bevaras i nervceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

NIH R21NS107797

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile CELLTREAT Scientific Products 50-202-036 Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM BD DIAGNOSTIC SYSTEMS DF0145070 Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURE LIFE TECHNOLOGIES 16500500 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP26485 Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK THERMO SCI ERIE 12542B Imaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242952008 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK THERMO SCI ERIE 125485C Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides THERMO SCI ERIE 12-550-15 Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone  Gibco  DF0118-17-0 Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700 SIGMA-ALDRICH INC H8898-50ML Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP162010 Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software Leica Microsystems LAS-AF Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil) W NUHSBAUM INC NC9547002 Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100 Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242956003 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS		 CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC FB0875713A Nematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS CORNING LIFE SCIENCES DL 87721 Nematode growth plates and RNAi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

Tags

Biologi Nummer 158 neurodegeneration ALS Huntingtons sjukdom C9orf72 proteotoxicitet upprepade expansionsstörningar
Mätning ran peptid toxicitet i <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N.,… More

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans. J. Vis. Exp. (158), e61024, doi:10.3791/61024 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter