Dieser Artikel stellt eine effiziente Methode zur Durchführung von Myokard-Ischämie und anschließender chronischer Reperfusion bei Ratten mit einem minimal-invasiven Ansatz dar. Darüber hinaus wird die linksventrikuläre hämodynamische Funktion von Ratten durch Echokardiographie und isolierte Arbeitsherzmethoden beurteilt.
Der Myokardinfarkt (MI) ist nach wie vor der Hauptverursacher von Morbidität und Mortalität weltweit. Daher ist die Forschung zu diesem Thema obligatorisch. Ein leichtes und hochreproduzierbares MI-Induktionsverfahren ist erforderlich, um weitere Erkenntnisse und ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden pathologischen Veränderungen zu erhalten. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um die Wirkung oder Wirksamkeit neuer und vielversprechender Behandlungen (als Medikamente oder Interventionen) bei akutem MI, anschließender Umgestaltung und Herzinsuffizienz (HF) zu bewerten. Nach intubation und präoperativer Vorbereitung des Tieres wurde ein Anästhetikum mit Isofluran durchgeführt und der chirurgische Eingriff wurde schnell durchgeführt. Mit einem minimalinvasiven Ansatz wurde die linke vordere absteigende Arterie (LAD) von einer Ligatur lokalisiert und versperrt. Die Okklusion kann bei nachfolgender Reperfusion akut durchgeführt werden (Ischämie/Reperfusionsverletzung). Alternativ kann das Schiff dauerhaft geligat werden, um die Entwicklung von chronischem MI, Umbau oder HF zu untersuchen. Trotz gemeinsamer Fallstricke sind die Abbrecherquoten minimal. Verschiedene Behandlungen wie die ferne ischämische Konditionierung können auf ihr kardioprotektives Potenzial vor-, peri- und postoperativ untersucht werden. Die postoperative Genesung war schnell, da die Anästhesie genau kontrolliert wurde und die Dauer der Operation kurz war. Postoperative Analgesie wurde drei Tage lang verabreicht. Das minimalinvasive Verfahren reduziert das Infektions- und Entzündungsrisiko. Darüber hinaus erleichtert es eine schnelle Erholung. Die “Arbeitsherz”-Messungen wurden ex vivo durchgeführt und ermöglichten eine präzise Steuerung von Vorspannung, Nachlast und Durchfluss. Dieses Verfahren erfordert spezielle Ausrüstung und Schulungen für eine angemessene Leistung. Dieses Manuskript bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Einführung für die Durchführung dieser Messungen.
Obwohl die Inzidenz kontinuierlich abnimmt, ist akuter Myokardinfarkt (MI) immer noch der Hauptverursacher von Morbidität und Mortalität weltweit1. Es gibt Einschränkungen bei der Bewertung der Wirksamkeit potenzieller Behandlungen als Medikamente oder chirurgische Verfahren, die akutes MI verhindern und behandeln. Bevor ihre Wirkungen beim Menschen untersucht werden können, müssen diese Behandlungen im Voraus auf Risiken getestet werden, einschließlich In-vivo-Untersuchungen an Tieren. Es gibt keine bessere Gelegenheit, eine Pathologie zu studieren als unter in vivo Bedingungen. Daher ermöglicht die MI-Induktion bei Ratten oder Mäusen und sogar großen Tiermodellen (Schweine oder Schafe) die Untersuchung von kurz-(akuten) und langfristigen (chronischen) Veränderungen aufgrund von Ischämie in den Herzkranzgefäßen und dem umgebenden Myokard sowie systemischen Veränderungen aufgrund einer eingeschränkten Herzfunktion. Infarktgröße war früher das Hauptziel, aber in jüngerer Zeit sind nachfolgende Herzumbauprozesse bei akutem MI oder Ischämie/Reperfusionsverletzungen sowie bei aufeinander folgender Herzinsuffizienz (HF) von großem Interesse geworden. Daher ist eine vergleichbare und leicht reproduzierbare Methode erforderlich, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
Während die Verwendung von Kryo-Ablation, um MI zu gewinnen,2berichtet wurde, baut unsere Methode auf anderen Studien auf, in denen Die Forscher die linke vordere absteigende Arterie (LAD) durch eine einzige Stichligation verschließen. Im Vergleich zu (Hemi-)Sternotomie-Verfahren ermöglicht der minimalinvasive Ansatz, der in diesem Artikel vorgestellt wird, eine schnellere postoperative Genesung und reduziert die Betriebszeit deutlich. Ein häufiger Schritt anderer chirurgischer Eingriffe ist das Abheben des Herzens aus dem Thorax, um den Herzstich3durchzuführen. Der Ansatz dieser Methode macht diesen Schritt überflüssig. Je nach Protokoll können zwei verschiedene Verfahren durchgeführt werden: eine temporäre Okklusion mit einem Tourniquet, um Ischämie/Reperfusion über einen definierten Zeitraum zu induzieren; oder eine dauerhafte Okklusion der Arterie durch Fixierung der Ligatur. Der Erfolg der Okklusion kann mit dem Elektrokardiogramm (EKG) und den makroskopischen Veränderungen im linken Ventrikel (LV) sowie dessen Verblüben bewertet werden.
Ein weiterer wichtiger Schritt vor der Operation ist die Intubation. Während in den meisten Fällen die Intubation über Tracheotomie oder durch orale Insertion der Röhre unter Demsicht durch einen Hautschnitt am Hals durchgeführt wird, beschreibt dieses Protokoll die endotracheale Intubation des anästhesierten Tieres, die Atembeschwerden oder Infektionen postoperativ reduziert4,5. Um postoperative Komplikationen zu vermeiden, wird die Luft aus dem Thorax über eine Spritze entfernt, bevor die Brust geschlossen wird.
Die zweite Aufgabe dieses Artikels ist die Bewertung der hämodynamischen Funktion über ein isoliertes Arbeitsherz-Experimentalmodell, wie es in anderen Projekten innerhalb unseres Instituts6,7verwendet wird. Während Echokardiographie, Kardiale Magnetresonanztomographie (MRT) und invasive Quantifizierung von Druck-Volumen-Schleifen bekannte und weit verbreitete Methoden zur Beurteilung der Herzfunktion in vivo sind, sind sie bekannt, einige Einschränkungen zu haben. Invasive Ansätze, wie z. B. die Verwendung von Kathetern zur Untersuchung der globalen Funktion oder spezifischer Parameter des Herzens, werden häufig verwendet und stellen den Goldstandard von Herzmessungen dar. Im Gegensatz dazu wird der ex vivo arbeitende Herzapparat aufgrund seiner Komplexität und Kosten nur selten verwendet. Es gibt viele wichtige Aspekte, von der Mischung der Perfusate bis zur angemessenen Cannulation des Herzens, die für eine erfolgreiche Bewertung entscheidend sind. Der isolierte Arbeitsherzapparat wurde erstmals 18978 von Oskar Langendorff beschrieben und in den letzten Jahrzehnten umgebaut9. Heute kommen zwei Modelle zum Einsatz: der Langendorff (LD) Modus und der Working Heart (WH) Modus. In unserer Studie wird der LD-Modus verwendet, um das Herz an seine neue Umgebung zu akklimatisieren (ca. 15 min). In diesem Modus wird das Herz über die Aorta kanüliert und die Herzkranzgefäße werden anterogradely durchblutet, wodurch das Myokard ausreichend versorgt wird. Im LD-Modus führt das Herz keine Druckvolumenarbeit durch. Im WH-Modus hingegen wird das linke Atrium über eine Lungenvene kanüliert, durch die die Perfusate in das linke Atrium eintritt. Das Herz pumpt diese Perfusate dann physiologisch gegen eine vordefinierte Nachlast. Durch die Erhöhung der Nachlast im Laufe der Zeit kann die Herzfunktion kontinuierlich gemessen werden. Parameter wie Koronarfluss, Herzleistung (CO), Hubvolumen (SV) und Arbeit, Vorhoffluss und LV-Systol- und Diastolische Drücke können gemessen werden. Die Auswirkungen verschiedener Behandlungen direkt und ausschließlich auf das Herz können untersucht werden6,10. Ein Review von Liao und Podesser9 zeigte die weit verbreitete Anwendung dieser Methode bei der Bewertung pharmakologischer Wirkungen auf die Herzfunktion und den Stoffwechsel sowie bei der Erforschung verschiedener Krankheiten wie MI, HF, Adipositas und Diabetes.
Zusammenfassend stellt dieses Protokoll eine reproduzierbare Methode zur Durchführung von MI- oder Myokard-Ischämie/Reperfusion (MIR)-Verletzung in vivo dar. Darüber hinaus ermöglicht es die Charakterisierung der LV (Dys-)Funktion auf einem isolierten Rattenherz nach MI. Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Kombination von Behandlung und Analyse dar.
Die negative Umgestaltung nach dem MI gilt als Schlüsselmechanismus bei der Entwicklung von Herzinsuffizienz. Um die Kontinuität der kardiovaskulären Forschung zu gewährleisten, sollten daher experimentelle Verfahren und Techniken reproduzierbar sein. Ein verständliches und klar definiertes Versuchsprotokoll ist ein grundlegendes Element der Reproduzierbarkeit. Reproduzierbarkeit bezieht sich auf Ergebnisse, die von mehreren Wissenschaftlern wiederholt und im Labor validiert werden. Diese Studie zielte darauf ab, eine semi-minimal-invasive Methode zu präsentieren, um chronische oder re-perfundierte MI zu induzieren und die kardiale hämodynamische Funktion bei Ratten zu bewerten.
Diese Ergebnisse und weitere veröffentlichte Daten zeigen die hohe Wirksamkeit dieser chirurgischen Methode und ihre Bedeutung in der Forschung an MI, Remodeling und HF. Während Ischämie/Reperfusionsverletzungen verwendet werden können, um die Veränderungen im MI mit anschließender Reperfusion zu verstehen, ermöglicht die permanente Okklusion ein besseres Verständnis der kurz- und langfristigen Umbauprozesse des Myokards. Andere chirurgische Ansätze verursachen mehr Gewebeschäden und Tiere weisen ein höheres Risiko für infektionen und Pneumothorax auf, was zu höheren Abbrecherquoten führt. Im Gegensatz dazu zielt dieses Verfahren darauf ab, die Sterblichkeit durch spezifische Verbesserungen in der Einrichtung und Handhabung zu senken. Darüber hinaus zeigen sie Variationen in der fibrotischen Narbenausdehnung aufgrund instabiler LAD-Okklusion.
Unser Protokoll bietet eine einfache Methode für die Intubation, die einer der kritischsten Schritte des gesamten Verfahrens ist. Im Gegensatz zu einigen anderen Publikationen12wird die Tracheotomie in unserem Verfahren nicht durchgeführt. Dies verbessert das Erwachen und die Rehabilitation der Tiere postoperativ, was zur Entwicklung der pathophysiologischen Veränderungen führt, die durch diesen chirurgischen Eingriff beabsichtigt sind, bevor die Tiere postoperativen Messungen unterzogen werden. Offensichtlich, wenn es ein Nicht-Überlebensprotokoll ist, wird tracheotomy unter Sicht durchgeführt und ist daher einfacher durchzuführen. Darüber hinaus ist das Schließen der Tracheotomie in einem Überlebensprotokoll nicht anwendbar. Wenn der Thorax geöffnet wird, ist es obligatorisch, die Lunge zu belüften, um einen Kollaps zu verhindern. Daher werden die Ratten vor dem chirurgischen Eingriff intubiert. Der minimalinvasive Ansatz schneidet weder die Rippen noch das Brustbein, wodurch die Kompaktheit und Stabilität des Thorax erhalten bleibt. Folglich wird die Erholung der Tiere verbessert, und das Risiko einer spontanen Pneumothorax oder Blutung ist relativ gering.
Wie bereits erwähnt, während die Intubation von klarem Vorteil ist, ist es schwierig durchzuführen und kann zu Beginn der Experimente zu einer höheren Abbrecherrate führen. Dieses Problem kann durch Training und etwas anatomisches Wissen gemildert werden. Es ist wichtig, das Rohr im rechten Winkel einzufügen und den Körper des Tieres so lange zu dehnen, bis das Licht durch die Stimmlippen scheint, nach dem das Rohr sanft nach vorne geschoben werden kann. Achten Sie darauf, die Stimmlippen nicht zu schädigen, da dies Schwellungen, nachfolgende Okklusion der Glottis und Erstickung verursachen kann.
Wichtig ist auch, dass der LAD korrekt geligat wird. Das kleine operationschirurgische Fenster, das schnell schlagende Herz und die belüftete Lunge (vermeiden Sie es so weit wie möglich zu berühren, da jeder Kontakt zu Blutungen in der Lunge führen kann) machen das Gefäß nicht deutlich sichtbar. Daher ist anatomisches Wissen unverzichtbar. Die linke Aurikel ist unentbehrlich, um sowohl den gefährdeten Bereich zu standardisieren als auch die Ligation um den LAD zu positionieren. Der Stich muss intramural und nicht transmural im LV durchgeführt werden, da dies zu einer Verringerung des LV-Kammerdurchmessers und des Volumens führen kann, was nicht auf die pathologischen Prozesse zurückzuführen ist. Erfolgreiche Okklusion ist mit Zyanose des gefährdeten Myokardbereichs und Der Erhöhung des ST-Segments auf EKG verbunden. Die Hauptbeschränkung dieses Verfahrens ist die korrekte Positionierung der Naht. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, müssen die Stiche auf dem gleichen Niveau sein und ähnliche Mengen an Gewebe verwenden. Dies erfordert ein hohes Maß an Ausbildung und die unterschiedlichen Gewichte der Tiere müssen berücksichtigt werden. Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt ist die angemessene Entfernung des Pneumothorax vor der Schließung des interkostalen Raumes. Wenn dies nicht genau durchgeführt wird, werden die Tiere Schwierigkeiten beim Atmen aufweisen, da die Inflation der linken Lunge durch einen Pneumothorax behindert wird. Wie bereits erwähnt, kann dies durch die Verwendung einer Spritze gemildert werden, um Restluft aus dem Thorax zu entfernen.
Derzeit ist dieses MI-Verfahren eine häufig verwendete Methode, die vergleichbare Ergebnisse und eine hohe Überlebensrate garantiert, wenn die kritischen Schritte mit hoher Präzision durchgeführt werden. Zukünftige Projekte zu verschiedenen Behandlungen, Geräten oder Medikamenten in MI, HF oder Herzumbau können mit dieser minimalinvasiven Technik bewertet werden.
Die WH-Messungen werden, wie bereits erwähnt, nicht häufig verwendet, da ihre Wartung und Handhabung spezifische Ausrüstung und Wissen erfordert. Um repräsentative und vergleichbare Daten zu erhalten, müssen Fallstricke vermieden werden. Die wichtigsten Schritte sind die Montage des Herzens und der Wechsel vom D-Modell in den WH-Modus. Wenn das Herz nicht ausreichend ausgeschnitten wird, kann die Montage schwierig sein, da eine ausreichende Aortengewebelänge erforderlich ist, um das Herz am Gerät zu fixieren. Bald nach der Verbindung mit dem LD-Modus kann die Herzfrequenz aufgrund des Waschens im Kalten Puffer, der Trennung seiner physiologischen Reize im Körper oder der Reperfusion mit Blut von einer anderen Spezies durch das Gerät abnehmen. In solchen Fällen muss ein Herzschrittmacher angewendet werden, um die physiologische Frequenz wiederherzustellen und zu erhalten. Dies gewährleistet vergleichbare Ergebnisse bei allen Tieren. Da das Blutvolumen innerhalb des Geräts ein Vielfaches des physiologischen Volumens bei Ratten ist, werden rinderrote Blutkörperchen in einer Krebs-Henseleit-Puffersuspension verwendet.
Der Wechsel vom LD-Modus in den WH-Modus ist gleichbedeutend mit einem Wechsel von passiver zu aktiver Herzarbeit. Der LD-Modus wird verwendet, um das Herz an seine neue Umgebung zu gewöhnen. Im WH-Modus muss das Herz seine physiologischen Auswurffunktionen ausführen. Daher ist vor der Bewertung eine kurze Anpassungsphase an die neuen Gegebenheiten durch Erhöhung der Nachlast erforderlich.
Ein weiterer kritischer Schritt, der allgemein vergessen wird, ist die angemessene Vorbereitung und Wartung des Geräts und des Perfusaten. Das genaue Volumen jeder Verbindung muss gemischt und die Temperatur innerhalb des Systems gesteuert und eingestellt werden. Dennoch ist das WH eine elegante Methode zur gleichzeitigen Beurteilung von Herzleistung, Schlaganfallvolumen, linksventrikulärem systolischem Druck und koronaren Fluss.
Dieses hochreproduzierbare Verfahren zur Induziert von MI und die vom WH-Gerät erfassten repräsentativen Daten beweisen ihre Fähigkeiten selbst. Der semi-minimalinvasive Ansatz, der Grad der LAD-Okklusion und Intubationsmethode ermöglichen eine schnelle Genesung und geringe Variabilität in Derinfarktgröße. Darüber hinaus liefert die Herzfunktionsanalyse in isolierten Arbeitsherzen wertvolle hämodynamische Ergebnisse.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken dem Operationstheater-Team und Technikern des Zentrums für Biomedizinische Forschung für ihren Beitrag, ihre technische Hilfe, ihren wertvollen Input und ihre Beratung. Die Projekte werden vom Ludwig Boltzmann Institut, Cluster for Cardiovascular Research (REM-Projekt) gefördert.
ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
INTUBATION | |||
Air | |||
Oxygen (pure) | |||
Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
PREPARATION | |||
Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
Shaver | |||
SURGICAL INSTRUMENTS | |||
Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
Mensur | MTI | 29-260/25 | |
Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
Needleholder thin | Martin | ||
Round hook | BT-190 | ||
Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
Surgical scissors | |||
SUTURES | |||
PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |