Summary
Эта статья представляет собой эффективный метод для выполнения ишемии миокарда и последующего хронического реперфузии у крыс с использованием минимально инвазивного подхода. Кроме того, левая желудочковая гемодинамическая функция крыс оценивается эхокардиографией и изолированными методами работы сердца.
Abstract
Инфаркт миокарда (МИ) остается основным фактором заболеваемости и смертности во всем мире. Поэтому исследования на эту тему являются обязательными. Легко и высоко воспроизводимой процедуры индукции MI требуется для получения дальнейшего понимания и лучшего понимания основных патологических изменений. Эта процедура также может быть использована для оценки последствий или потенции новых и перспективных методов лечения (как лекарства или вмешательства) при остром ИК, последующей реконструкции и сердечной недостаточности (HF). После интубации и предоперационных приготовлений животного был проведен анестетический протокол с изофлураном, и хирургическая процедура была проведена быстро. Используя минимально инвазивный подход, левая передняя нисходящая артерия (LAD) была расположена и окклюзия лигатурой. Окклюзия может быть выполнена остро для последующего реперфузии (ишемия / реперфузия травмы). Кроме того, судно может быть перевязывать постоянно для изучения развития хронических ИМ, реконструкции или HF. Несмотря на распространенные подводные камни, показатели отсева минимальны. Различные методы лечения, такие как удаленные ишемической кондиционирования могут быть рассмотрены для их кардиопротекторных потенциал предварительно, пери- и после оперативно. Послеоперационное восстановление было быстрым, так как анестезия была точно контролируется, а продолжительность операции была короткой. Послеоперационная анальгезия вводилась в течение трех дней. Минимально инвазивная процедура снижает риск инфекции и воспаления. Кроме того, он способствует быстрому выздоровлению. Измерения "рабочего сердца" были выполнены ex vivo и позволили точно контролировать предзагрузку, после нагрузку и поток. Эта процедура требует специального оборудования и подготовки для адекватной работы. Данная рукопись содержит подробное пошаговое представление для проведения этих измерений.
Introduction
Хотя заболеваемость постоянно снижается, острый инфаркт миокарда (МИ) по-прежнему является основным фактором заболеваемости и смертности во всем мире1. Существуют ограничения на оценку эффективности потенциальных методов лечения в качестве лекарств или хирургических процедур, которые предотвращают и лечат острый ИМ. Прежде чем их эффекты могут быть рассмотрены в организме человека, эти методы лечения должны быть проверены на риски заранее, в том числе in vivo обследований у животных. Нет лучшей возможности изучать патологию, чем в условиях in vivo. Поэтому индукция МИ у крыс или мышей и даже крупных моделей животных (свиней или овец) позволяет проводить исследования краткосрочных (острых) и долгосрочных (хронических) изменений из-за ишемии в коронарных артериях и окружающей миокарде, а также системных изменений из-за нарушения сердечной функции. Infarct размер был ранее основной целью, но в последнее время последующие процессы сердечной реконструкции в острой ИК или ишемии / реперфузии травмы, а также в последовательных сердечной недостаточности (HF) стали представлять большой интерес. Поэтому для достижения согласованных результатов необходим сопоставимый и легко воспроизводимый метод.
Хотя использование крио-абляции для получения MI было сообщено2, наш метод основывается на других исследованиях, в которых исследователи окклюзии левой передней нисходящей артерии (LAD) на один перевязку стежка. По сравнению с (геми-) процедурами стернотомии, минимально инвазивный подход, который будет представлен в данной статье, позволяет быстрее послеоперационного восстановления и заметно сокращает время работы. Общим шагом других хирургических процедур является подъем из сердца из грудной клетки для выполнения стежка сердца3. Подход этого метода делает этот шаг ненужным. В зависимости от протокола можно выполнить две различные процедуры: временное окклюзию с использованием турникета для исцемии/реперфузии в течение определенного времени; или постоянное окклюзии артерии путем фиксации лигатуры. Успех окклюзии можно оценить с помощью электрокардиограммы (ЭКГ) и макроскопических изменений в левом желудочке (LV), а также его бледности.
Другим важным шагом перед операцией является интубация. В то время как в большинстве случаев, интубация выполняется через трахеотомию или через устную вставку трубки под зрением разрезом кожи в горле, этот протокол описывает эндотрахеальную интубацию обезболивающего животного, что уменьшает затрудненное дыхание или инфекции послеоперационно4,5. Чтобы избежать послеоперационных осложнений, воздух удаляется из грудной клетки через шприц перед закрытием грудной клетки.
Вторая задача этой статьи является оценка гемодинамической функции с помощью изолированной рабочей модели сердца экспериментальных, как она используется в других проектах в рамках нашего института6,7. В то время как эхокардиография, сердечная магнитно-резонансная томография (МРТ) и инвазивная количественная количественная оценка петель давления хорошо известны и широко используются методы оценки сердечной функции in vivo, они, как известно, имеют некоторые ограничения. Инвазивные подходы, такие как использование катетеров для изучения глобальной функции или конкретных параметров сердца, широко используются и представляют собой золотой стандарт сердечных измерений. В отличие от этого, ex vivo рабочий сердечный аппарат редко используется из-за его сложности и стоимости. Есть много важных аспектов, от смеси перфузии до адекватной каннуляции сердца, которые имеют решающее значение для успешной оценки. Изолированный рабочий аппарат сердца был впервые описан Оскаром Лангендорфом в 18978 и был изменен в течение последних десятилетий9. Сегодня используются две модели: режим Langendorff (LD) и режим рабочего сердца (WH). В нашем исследовании, режим LD используется для акклиматизации сердца к своей новой среде (около 15 мин). В этом режиме сердце консервируется через аорту, а коронарные артерии антероградели проливаются, адекватно снабжая миокард. В режиме LD сердце не выполняет никакой работы по объему давления. В отличие от этого, в режиме WH, левое предсердие наклоняется через легочную вену, через которую перфузиат попадает в левое предсердие. Затем сердце перекачивает это перфузию физиологически против предопределенной после загрузки. Увеличивая послезавостановку с течением времени, сердечная функция может быть непрерывно измерена. Можно измерить такие параметры, как коронарный поток, сердечный выброс (CO), объем инсульта (СВ) и работа, предсердий и систолическое и диастолическое давление. Влияние различных методов лечения непосредственно и исключительно на сердце может быть исследовано6,,10. Обзор Ляо и Podesser9 представил широкое использование этого метода в оценке фармакологического воздействия на сердечную функцию и метаболизм, а также в исследовании различных заболеваний, таких как И.В., HF, ожирение и диабет.
Таким образом, этот протокол представляет воспроизводимый метод для выполнения ИМИ или ишемии миокарда / реперфузии (MIR) травмы in vivo. Кроме того, он позволяет характеристику LV (дис-)функции на изолированном сердце крысы после MI. Этот протокол представляет собой уникальное сочетание лечения и анализа.
Protocol
Экспериментальный протокол, в котором приводятся результаты, описанные в этой статье, был одобрен региональным комитетом по этике лабораторных экспериментов на животных в Медицинском университете Вены и Австрийским федеральным министерством образования, науки и исследований (BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016). Все эксперименты соответствуют Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованному Национальными институтами здравоохранения США (NIH Публикация No 85-23, пересмотренный 1996).
ПРИМЕЧАНИЕ: используются 10-12-недельные самцы крысы Sprague Dawley весом тела 250–300 г. В качестве следующих процедур и процедур выполняются в стерильной среде операционной (ИЛИ), носить скрабы, перчатки, маски и капюшоны при обращении с животными. Перед входом в OR, убедитесь, что руки промывают и дезинфицируются. Если намерение состоит в том, чтобы работать на нескольких животных в хирургическом сеансе, либо мыть и дезинфицировать, или автоклав инструментов в период между операциями. Эти гигиенические рекомендации действительны для всех процедур, представленных в разделе протокола.
1. Предоперационная подготовка и анестезия
- Инициировать предоперационную анестезию путем введения смеси ксилазина (4 мг/кг BW) и кетамина (100 мг/кг BW) интраперитонально.
- Интубировать крыс с 14 G трубки и объемом контролируемой вентиляции со смесью O2, воздуха и изофлуран (1-2,5%) при 75–85 ударах/мин, 100 мл/инсульт/BW(рисунок 1A). При необходимости, для лучшего зрения во время интубирования: нанесите Xylocain через наконечник ватной шерсти на нижней глотке для достижения местного расслабления.
- Поместите крыс на нагретый операционный стол в положении на спине и зафиксизните передние конечности лентой(рисунок 1B).
- Измерьте температуру прямой кишки с помощью зонда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Он должен поддерживаться между 37,5-38,5 градусов по Цельсию. - Пошеветь грудную клетку и очистить операционную зону с помощью антисептического раствора йода поседон. Нанесите глазную мазь на крысу, чтобы предотвратить высыхание глаз.
- Администрирование интраоперационной анальгезии путем введения пиритрамида (0,1 м/кг BW) интраперитонально.
- Поместите зонды ЭКГ подкожно в конечности животного.
- Проверьте рефлексы хвоста и ног перед началом хирургической процедуры.
2. Хирургическая процедура -индукция ишемии миокарда
- Выполните разрез кожи с помощью скальпеля. Обеспечьте старт 2 мм парастеральной на левой грудной клетке на уровне 3-го межреберного пространства и продолжайте переднюю подмышечную линию на уровне 5-го межреберного пространства(рисунок 1С).
- Заменить поверхностные мышцы осторожно, чтобы сделать ребра видимыми (Рисунок 1D).
- В случае незначительного кровотечения, используйте прижигатель, чтобы уничтожить или отключить окружающие ткани.
- Выполните торакотомию на уровне 4-го межреберного пространства и вставьте втягиватель, чтобы получить видимость сердца и легких(Рисунок 1E). Осторожно откройте плевру, чтобы избежать кровотечения.
- Временно окклюзия LAD с помощью турникета, чтобы вызвать ишемию / реперфузии (MIR) в течение определенного времени; или постоянно (MI) окклюзии его, сделав 6'7 узлов с помощью 6-0 шов, чтобы закрыть перевязку(рисунок 1F, G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Правое место для окклюзии LAD расположено около 2–3 мм под левой ушной раковиной на вентральной/левой боковой окраине сердца. Успешное окклюзия связана с изменениями ЭКГ (высота ST-сегмента) и макроскопическими изменениями в LV как бледнеющие. - В случае ишемии / реперфузии модели, вновь LAD путем удаления турникета после 30 мин окклюзии.
- Закройте грудную клетку тремя однокнопными швами, используя 4-0 однородный шов(рисунок 1H). Перед ужесточением последнего шва, удалить любой остаточного воздуха из грудной клетки с 10 мЛ шприц, чтобы предотвратить пневмоторакс(рисунок 1I).
- Перепозиционирование мышц и выключите летучую анестезию.
- Шов кожи с непрерывным швом с помощью 4-0 шва(рисунок 1J).
- Администрирование антисептического спрея для защиты от инфекций и укусов шва крысами.
3. Послеоперационное лечение и критерии исключения
- Держите крыс на отопительном столе, пока они не проснутся. Extubate крыс, как только они начинают дышать спонтанно.
- Положите extubated крыс в клетку под нагревательной лампой, чтобы предотвратить их от охлаждения.
- Возвращение крыс в дома животных в стандартизированных условиях, когда они начинают вести себя нормально снова.
- Добавьте 2 ампулы пиритрамида и 30 мл 5% глюкозы до 250 мл воды для послеоперационной анальгезии в течение трех дней.
- Проверьте пригодность и поведение крыс с контрольным списком и критериями исключения (Таблица 1). Наблюдайте за животными два раза в день в течение следующей недели, затем два раза в неделю.
ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с международными стандартами, представить любые страдания животных, или животных, которые получают до 6 баллов в оценке с контрольным списком, ветеринары, чтобы сделать терапии, связанные с решениями. Любые животные, набравшие 7 или более баллов, должны быть немедленно принесены в жертву при передозировке кетамина и ксилазина.
| Экспертизы | Наблюдения | Оценка по |
| Вес тела | Стабильной | 0 |
| 10% убыток | 4 | |
| 15% потери за 48 ч | 7 | |
| 18% убытка | 7 | |
| нормальный (пальто плоский и блестящий) | 0 | |
| Внешний вид | пилоэрекция | 1 |
| гематома | 2 | |
| раны кожи/порезы/следы укусов | 2 | |
| сильно сокращенный уход | 4 | |
| (отверстия нечистые/ свернутые или влажные) | 7 | |
| тяжелые раздражения кожи или раны | 7 | |
| сгорбившись осанку | 7 | |
| значительное растяжение брюшной полости (асцит) | 7 | |
| Поведение | нормальный (спящий, любопытный, социальные контакты, реакция при прикосновении) | 0 |
| необычное поведение, например, нарушение активности | 2 | |
| самоизоляция, выраженная гиперактивность или стереотипия | 4 | |
| летаргия для Зтт;6 ч | 4 | |
| летаргия от 6 ч до 8 ч | 7 | |
| апатии | 7 | |
| стереотипы непрерывный для | 7 | |
| признаки боли при прикосновении | 7 | |
| автомутиляция | 7 | |
| Пищеварения | Нормальной | 0 |
| диарея (мягкие фекалии) | 3 | |
| диарея для 72 ч или водянистые | 7 | |
| кровавый стул | 7 |
Таблица 1: Контрольный список и критерии исключения. Эта таблица содержит экзамены, которые должны соблюдаться и соответствующий балл. Соответственно, послеоперационное лечение животного должно быть адаптировано, или ветеринар должен быть проконсультироваться.
4. Измерения эхокардиографии
ПРИМЕЧАНИЕ: Эхокардиография обычно выполняется дважды, до индукции ИВ и до сбора органов.
- Впрысните крыс смесь ксилазина (4 мг/кг BW) и кетамина (100 мг/кг BW) интраперитонально.
- Поместите крыс в положение на спине на подносе для отопления. Нанесите эхо-гель на грудь, что помогает ультразвуковым волнам лучше путешествовать и уменьшает помехи сигнала.
- Получить парастеральные короткие виды оси полости LV на уровне папиллярной мышцы.
- Выполните эхокардиографию M-режима для измерения фракции выброса левого желудочка и морфологии.
5. Сбор органов (без рабочего сердца)
- Администрирование ксиламина (4 мг/кг BW) и кетамина (100 мг/кг BW) внутриперитонально до сбора органов. Убедитесь, что рефлексы являются отрицательными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не требуется интубация, так как процедура не длится дольше 1 мин. - Используйте скальпель, чтобы сделать разрез кожи под сифоид и продлить его параллельно ребра с обеих сторон с помощью ножниц.
- Вырезать ребра в лобной подмышечной линии и захватить xiphoid поднять грудь вверх (Рисунок 2A).
- Удалите анатомические или фиброзные ткани спайки, тщательно разрывая ткани с двумя парами щипцов.
- Возьмите образцы крови (для оценки газа крови или молекулярного анализа) из вены кавы уступает с 5 мЛ шприц.
- Выполните иссечение всего сердца на уровне входов и выходов(Рисунок 2B). При необходимости приступаем к оценке рабочего сердца, как описано в разделе 6.
- Урожай органов, шок заморозить их в жидком азоте и хранить в -80 градусов по Цельсию для дальнейшего молекулярного анализа, или в формальдегид для гистологических целей.
6. Ex vivo гемодинамические измерения с помощью рабочей системы сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая настройка и компоненты аппарата были ранее описаны11. Следующий протокол описывает обращение с сердцем животного и необходимые шаги для оценки функции LV.
- Анестезировать крыс, как описано в шаге 5.1 и вводить 200 МЕ гепарина внутривенно (бедренная вена).
- Откройте грудную клетку через разрез под дорогой аркой скальпелем и расширьте ее как на передние подмышечные линии ножницами, так и поднимите грудину.
- Вырезать большие сосуды вблизи их розетки или вход в сердце, чтобы акциз его(Рисунок 2B).
- Погрузите сердце в ледяной буфер Кребс-Хенселейт и смонтировать его на эритроцитов проникнуты изолированной сердечной системы через cannulating аорты (Рисунок 3A).
- Начните с режима LD с постоянной послезарядной нагрузкой 60 мм рт. ст. (период стабилизации).
- После 15 мин режима LD переключитесь в режим WH. Таким образом, каннулте левое предсердие через легочную вену(рисунок 3B). Затем измените направление потока в системе, открыв клип, который закрывает предсердную канюлю. Это приводит к перфузии левого предсердия и физиологического кровотока в левом сердце11.
- Запись гемодинамических измерений в течение 20 минут в режиме WH.
- Собирайте капли крови корониров с помощью шприца 2 мЛ для измерения коронарного потока (CF, mL/min) каждые 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: CF измеряется как разница между левым предсердным потоком (LAF) и аортального потока (AF). - Выполните непрерывные измерения LAF (эквивалент сердечного выброса) и AF с зондом потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд вставляется через аппарат WH в LV. Все данные постоянно регистрируются. - Если текущий протокол просит, вставьте высокоточной катетер ретроградно через аортальный клапан в LV и измерить левый желудочек систолическое давление (LVSP).
- Для оценки работы по объему давления и объема, выполняемой в минуту, вычислить объем инсульта, как сердечный выброс, разделенный на частоту сердечных сокращений.
- Рассчитайте внешнюю работу сердца (EHW) по следующей формуле: CO x LVSP(g x m/min), нормализованное для веса сердца.
Representative Results
Следующие результаты были опубликованы Pilz et al.6. С помощью этой точной хирургической процедуры, кардиопротекторное действие удаленного ишемического вмешательства (RIPerc) может быть исследовано. Это потенциально новое лечение для пациентов, страдающих от острого ИМ или МИР и последующей желудочковой реконструкции, которая во многих случаях приводит к последовательным HF. Имитация патофизиологических изменений MI / MIR является обязательным шагом в оценке лечения, как in vitro или ex vivo исследования не обеспечивают физиологической среды. В этом протоколе, животные были подвергнуты 30 мин окклюзии LAD с последующим реперфузией (т.е. MIR).
Чтобы доказать воспроизводимость процедуры, были выполнены гистологические порезы и пятна(рисунок 4A). Было ясно, что фиброзный шрам в мироритическом животных был сопоставим с рубцовым образованием шамовых животных, в то время как сравнение фиброза между группами Шама и МИР было значительным(рисунок 4B). Кроме того, в лечении животных МИРЗРИПерк наблюдалось значительное снижение фиброза по сравнению с животными, обработанными МИР. Тем не менее, представитель гистологических изображений прояснить потенцию этой хирургической процедуры, как инфаркт явно поддерживается в группе MIR(Рисунок 4A). Использование in vivo echography, фракция выброса, LV энд-диастолические и конечные систолические диаметры (LVEDD и LVESD) были измерены и показали значительно сниженную сердечную функцию за счет лечения MIR в то время как гемодинамические параметры были сохранены RIPerc(Рисунок 4CF). Ex vivo гемодинамические данные продемонстрировали эффективность процедуры, как группа MIR показали значительное снижение LVSP, сердечный выход (CO), объем инсульта (SV), а также внешней работы сердца (EHW) (Рисунок 5A'G).
Поиск литературы об этой хирургической процедуре не сообщил никаких негативных или неудовлетворительных комментариев и результатов, когда она была надлежащим образом выполнена. Тем не менее, подводные камни, упомянутые во введении, и обсуждение необходимо предотвратить, и профессиональная подготовка является обязательной для получения стабильного уровня производительности и получения сопоставимых результатов.
Рисунок 1: Предоперационная подготовка и хирургическая процедура. (A) Интубация животного с помощью 14 G трубки. (B) Supine позиционирования и дезинфекции хирургического поля. (C) Разрез кожи (2 мм парастерна на левой грудной клетке на уровне 3-го межреберного пространства). Разрез должен достичь передней подмышечной линии на уровне 5-го межреберного пространства. (D)Смести мышцы, чтобы сделать ребра видимыми. (E) Открытие грудной клетки. (F) Постоянное окклюзии LAD с использованием 6-7 узлов. (G) Переходный окклюзии LAD с помощью турникета. (H) Закрытие грудной клетки после ишемии миокарда и реперфузии путем размещения трех одноузловых швов вокруг ребер. (I) Правильное закрытие грудной клетки. Используйте шприц 10 мЛ, чтобы удалить любой остаточный воздух из грудной клетки перед фиксацией последнего узла плотно. Это является неотъемлемой частью для предотвращения пневмоторакса. (J)Кожа шва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Сбор органов. (A) Откройте грудь с суб-xiphoidal сокращений и расширить их в обоих середине аксилярных линий. Дальнейшие прорезывы через ребра выполняются для облегчения подъема грудины. (B)Excision сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Изолированный аппарат сердца. (A) Режим Лангендорфа. Сердце крепится к аппарату WH через каннуюцию аорты. (B) Режим работы сердца. Система может быть переключена на модель WH для оценки сердечной функции путем консервирования левого предсердия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Влияние дистанционного ишемического кондиционирования на образование рубцов, функцию левого желудочка и реконструкцию. ()Гистологические LV ломтики собраны на 14 день пост-миокарда реперфузии. (B) Количественные результаты фиброза в барных графиках. (C) Представитель M-режим эхокардиограммы. (D) Фракция выброса (EF) количественно в барных графиках. (E) LV конец систолического диаметра (LVESD) количественно в барных графиках. (F) LV конца диастолического диаметра (LVEDD) количественно в барных графиках. МИР, ишемия-реперфузия миокарда; RIPerc, дистанционное ишемическое переусловие. Данные выражены как средние - SEM. х/л; 0,05; Зп хт; 0,01; р Зтт; 0,001. Перепечатано с Pilz et al.6 с разрешения Elsevier. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Влияние RIPerc на Гемодинамическую функцию LV. (LVсистолическое давление (LVSP),( B) сердечный выход (CO), и (C) объем инсульта (SV) результаты были получены из изолированного рабочего сердца на 14 день после реперфузии миокарда. (D) CO изображается как функция после загрузки; (F) внешний сердце работы в качестве функции после нагрузки, количественные результаты в бар график (E и G). Данные выражены как средние - SEM и n 4-7 на группу. Зп хт; 0,05; Зп хт; 0,01; р Зтт; 0,001. МИР, ишемия миокарда/реперфузия; RIPerc, дистанционное ишемическое предварительное условие; EHW, внешняя работа сердца; SV, объем инсульта; AUC, область под кривой. Перепечатано с Pilz et al.6 с разрешения Elsevier. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Неблагоприятная реконструкция пост-МИ считается ключевым механизмом развития сердечной недостаточности. Поэтому для обеспечения непрерывности сердечно-сосудистых исследований должны быть воспроизведены экспериментальные процедуры и методы. Понятный и четко определенный экспериментальный протокол является основополагающим элементом воспроизводимости. Воспроизводимость относится к результатам, которые могут быть повторены несколькими учеными и проверяются в лабораториях. Это исследование было направлено на представление полу-минимально инвазивный метод, чтобы вызвать хронические или повторно проникнуты ИК и оценить сердечную гемодинамическую функцию у крыс.
Эти результаты и дальнейшие опубликованные данные показывают высокую потенцию этого хирургического метода и его важность в исследованиях по ИМ, реконструкции и HF. В то время как ишемия / реперфузия травмы могут быть использованы для понимания изменений в ИК с последующим реперфузии, постоянное окклюзия позволяет дальнейшее понимание краткосрочных и долгосрочных процессов реконструкции миокарда. Другие хирургические подходы вызывают больше повреждений тканей и животные показывают более высокий риск развития инфекций и пневмоторакса, что приводит к более высоким показателям отсева. В отличие от этого, эта процедура направлена на снижение смертности за счет конкретных улучшений в установке и обработке. Кроме того, они показывают различия в фиброзных шрамов расширения из-за нестабильной окклюзии LAD.
Наш протокол обеспечивает простой метод интубации, который является одним из наиболее важных шагов всей процедуры. В отличие от нескольких других публикаций12, трахеотомия не выполняется в нашей процедуре. Это усиливает пробуждение и реабилитацию животных после операции, что приводит к развитию патофизиологических изменений, которые предназначены этой хирургической процедурой до того, как животные проходят послеоперационные измерения. Очевидно, что если это не выживший протокол, трахеотомия выполняется под зрением и, таким образом, легче выполнять. Кроме того, закрытие трахеотомии в протоколе выживания не применяется. Если грудная клетка открыта, необходимо проветрить легкое, чтобы предотвратить коллапс. Таким образом, крысы интубируются до хирургической процедуры. Минимально инвазивный подход не режет ребра или грудину, сохраняя тем самым компактность и стабильность грудной клетки. Следовательно, восстановление животных улучшается, и риск спонтанного пневмоторакса или кровотечения является относительно низким.
Как уже упоминалось выше, в то время как интубация имеет явное преимущество, это трудно выполнить и может привести к более высокой скорости отсева в начале экспериментов. Эта проблема может быть смягчена с обучением и некоторые анатомические знания. Важно вставить трубку под прямым углом и растянуть тело животного, пока свет не просвечивает через вокальные губы, после чего трубку можно мягко отодвинуть вперед. Позаботьтесь, чтобы не повредить вокальные губы, как это может вызвать отек, последующее окклюзии glottis и удушья.
Важно также, чтобы LAD был правильно передетан. Небольшое хирургическое окно, быстро бьющееся сердце и проветриваемое легкое (избегайте прикосновения к нему как можно больше, так как каждый контакт может привести к кровотечению в легких) сделать сосуд не ясно видимым. Поэтому анатомические знания необходимы. Левая ушной раковина необходима для стандартизации как зоны риска, так и для размещения перевязки вокруг LAD. Стежок должен быть выполнен внутримурно, а не трансмурально в LV, так как это может привести к уменьшению диаметра камеры LV и объема, который не из-за патологических процессов. Успешная окклюзия связана с цианозом области миокарда с риском и возвышением ST-сегмента на ЭКГ. Основным ограничением этой процедуры является правильное расположение шва. Для достижения сопоставимых результатов, стежки должны быть на том же уровне и должны использовать аналогичные количества ткани. Это требует высокого уровня подготовки и различные веса животных должны быть рассмотрены. Еще один момент, который следует рассмотреть, - адекватное удаление пневмоторакса до закрытия межреберного пространства. Если это точно не выполняется, животные будут проявлять трудности в дыхании, как инфляция левого легкого будет препятствовать пневмоторакс. Как уже упоминалось выше, это может быть смягчено с помощью шприца для удаления остаточного воздуха из грудной клетки.
В настоящее время эта процедура MI является широко используемым методом, который гарантирует сопоставимые результаты и высокую выживаемость, если критические шаги выполняются с высокой точностью. Будущие проекты по различным методам лечения, устройств или лекарств в ИВ, HF или кардиореконструкторинге могут быть оценены, выполняя этот минимально инвазивный метод.
Измерения WH, как уже упоминалось выше, обычно не используются, так как их техническое обслуживание и обработка требуют специального оборудования и знаний. Для получения репрезентативных и сопоставимых данных следует избегать ловушек. Наиболее важными шагами являются монтаж сердца и переключение с модели D на режим WH. Если сердце не вырезано должным образом, монтаж может быть трудно, как достаточная длина аорты ткани требуется, чтобы исправить сердце к аппарату. Вскоре после подключения к режиму LD частота сердца может уменьшиться из-за мытья в холодном буфере, отключения его физиологических стимулов в организме или реперфузии с кровью от другого вида аппаратом. В таких случаях кардиостимулятор должен применяться как для восстановления, так и для сохранения физиологической частоты. Это обеспечивает сопоставимые результаты у всех животных. Поскольку объем крови в аппарате является кратным физиологического объема у крыс, используются красные кровяные тельца крупного рогатого скота в буферной подвеске на основе Кребса-Хенселейта.
Переход из режима LD в режим WH является синонимом перехода от пассивной к активной работе сердца. Режим LD используется для приучания сердца к новой среде. В режиме WH сердце должно выполнять свои физиологические функции выброса. Таким образом, перед оценкой требуется короткий этап адаптации к новым обстоятельствам путем увеличения послезарядки.
Другим важным шагом, который обычно забывают, является адекватная подготовка и обслуживание аппарата и перфузии. Точный объем каждого соединения должен быть смешан, а температура в системе должна контролироваться и корректироваться. Тем не менее, WH является элегантным методом для оценки сердечного выброса, объема инсульта, левого желудочкого систолического давления и коронарного потока одновременно.
Эта высоковоспроизводимая процедура, чтобы побудить MI и представляющие данные, полученные аппаратом WH, сами доказывают их способность. Полумамально инвазивный подход, уровень окклюзии и интубации LAD способствуют быстрому восстановлению и низкой изменчивости в размерах инфаркта. Кроме того, анализ сердечной функции в изолированных рабочих сердцах дает ценные гемодинамические результаты.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят оперативную команду театра и техников Центра биомедицинских исследований за их вклад, техническую помощь, ценный вклад и советы. Проекты финансируются Институтом Людвига Больцмана, Кластером сердечно-сосудистых исследований (проект REM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
| Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
| Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
| Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
| INTUBATION | |||
| Air | |||
| Oxygen (pure) | |||
| Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
| 14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
| PREPARATION | |||
| Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
| Shaver | |||
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
| Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
| Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
| Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
| Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
| Mensur | MTI | 29-260/25 | |
| Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
| Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
| Needleholder thin | Martin | ||
| Round hook | BT-190 | ||
| Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
| Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
| Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
| Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
| Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
| Surgical scissors | |||
| SUTURES | |||
| PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
| Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
| Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
| COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
| PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
| EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
| Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
| Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
| Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
| Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
| Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
| PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |
References
- WHO. Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015. World Health Organization. , (2016).
- Jaquet, K., et al. Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism. Stem Cells and Development. 14 (3), 299-309 (2005).
- Liu, P., Xu, B., Cavalieri, T. A., Hock, C. E. Age-related difference in myocardial function and inflammation in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion. Cardiovascular Research. 56 (3), 443-453 (2002).
- Kolk, M. V. V., et al. LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments. (32), e1438 (2009).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery. Journal of Visualized Experiments. (150), e59591 (2019).
- Pilz, P. M., et al. Remote ischemic perconditioning attenuates adverse cardiac remodeling and preserves left ventricular function in a rat model of reperfused myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 285, 72-79 (2019).
- Santer, D., et al. In vivo and ex vivo functional characterization of left ventricular remodelling after myocardial infarction in mice. ESC Heart Failure. 2 (3), 171-177 (2015).
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugetierherzen II. Über den Einfluss von Wärme und Kälte auf das Herz der warmblütigen Tiere. Pflügers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 66 (67-68), 355-400 (1897).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Podesser, B. K., et al. The erythrocyte-perfused "working heart" model: hemodynamic and metabolic performance in comparison to crystalloid perfused hearts. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 9-15 (1999).
- Kiss, A., et al. Argon preconditioning enhances postischaemic cardiac functional recovery following cardioplegic arrest and global cold ischaemia. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 54 (3), 539-546 (2018).
- Kiss, A., et al. Vagal nerve stimulation reduces infarct size via a mechanism involving the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor and downregulation of cardiac and vascular arginase. Acta Physiologica. 221 (3), 174-181 (2017).
