Summary
تقدم هذه المقالة طريقة فعالة لأداء نقص تروية عضلة القلب و ما يليها من تهويات مزمنة في الفئران باستخدام نهج طفيفة التوغل. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تقييم وظيفة البطين البطينية البطينية للفئران بواسطة تخطيط صدى القلب وأساليب قلب العمل المعزولة.
Abstract
لا يزال احتشاء عضلة القلب هو المساهم الرئيسي في الاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. ولذلك، فإن البحث في هذا الموضوع إلزامي. مطلوب إجراء التعريفي MI بسهولة وبشكل كبير من أجل الحصول على مزيد من البصيرة وفهم أفضل للتغيرات المرضية الكامنة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه العملية لتقييم آثار أو فاعلية العلاجات الجديدة والواعدة (كدواء أو تدخلات) في MI الحادة، وإعادة عرض لاحقة وفشل القلب (HF). بعد النوباض وإعداد ما قبل الجراحة للحيوان ، تم إجراء بروتوكول تخدير مع isoflurane ، وأجريت العملية الجراحية بسرعة. باستخدام نهج الحد الأدنى من الغازية، تم تحديد موقع الشريان الأمامي الأيسر (LAD) وانسداده بواسطة ربطة عنق. يمكن إجراء انسداد حاد ل-reperfusion اللاحقة (إصابة الإقفاريات/ reperfusion). بدلا من ذلك، يمكن أن يكون ليغا السفينة بشكل دائم للتحقيق في تطوير MI المزمنة، إعادة عرض أو HF. وعلى الرغم من المزالق الشائعة، فإن معدلات التسرب من الدراسة ضئيلة. يمكن فحص العلاجات المختلفة مثل تكييف الإقفاري عن بعد لاحتمالاتها في ما قبل ، شبه العملية ، وما بعد الجراحة. وكان التعافي بعد الجراحة سريعًا حيث تم التحكم في التخدير بدقة وكانت مدة العملية قصيرة. تم إعطاء مسكن ما بعد الجراحة لمدة ثلاثة أيام. الحد الأدنى من التدخل الجراحي يقلل من خطر العدوى والالتهاب. وعلاوة على ذلك، فإنه ييسر الانتعاش السريع. وقد أجريت قياسات "القلب العامل" بعد ذلك مما مكن من التحكم الدقيق في التحميل المسبق والتحميل والتدفق. ويتطلب هذا الإجراء معدات محددة وتدريباً لأداء ملائم. تقدم هذه المخطوطة مقدمة مفصلة خطوة بخطوة لإجراء هذه القياسات.
Introduction
على الرغم من أن الإصابة في انخفاض مستمر، احتشاء عضلة القلب الحاد (MI) لا يزال المساهم الرئيسي في الاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم1. هناك قيود على تقييم فعالية العلاجات المحتملة كدواء أو إجراءات جراحية تمنع وعلاج مرض الـ "مي" الحاد. قبل أن يمكن فحص آثارها في البشر، يجب اختبار هذه العلاجات للمخاطر مقدما، بما في ذلك في فحوصات الجسم الحي في الحيوانات. لا توجد فرصة أفضل لدراسة علم الأمراض من تحت في ظروف الجسم الحي. لذلك، التعريفي MI في الفئران أو الفئران وحتى نماذج الحيوانات الكبيرة (الخنازير أو الأغنام) يسمح التحقيق في التغيرات قصيرة الأجل (الحادة) والطويلة الأجل (المزمنة) بسبب نقص التروية في الشرايين التاجية و عضلة القلب المحيطة بها، فضلا عن التغيرات النظامية بسبب اختلال وظيفة القلب. حجم infarct كان سابقا الهدف الرئيسي، ولكن في الآونة الأخيرة في وقت لاحق عمليات إعادة تشكيل القلب في الوفيات الحادة أو إصابة نقص التروية / reperfusion وكذلك في فشل القلب على التوالي (HF) أصبحت ذات أهمية كبيرة. ولذلك، يلزم اتباع طريقة مماثلة وسهلة التكاثر للوصول إلى نتائج متسقة.
في حين أن استخدام الاستئصال بالتبريد للحصول على MI قد تم الإبلاغ عن2، فإن طريقتنا تبني على دراسات أخرى يقوم فيها المحققون بانسداد الشريان الأمامي الأيسر المنحدر (LAD) عن طريق ربط غرزة واحدة. بالمقارنة مع (هيمي-) إجراءات القص، والنهج طفيفة الغازية التي سيتم تقديمها في هذه المقالة، يسمح أسرع الانتعاش بعد العملية الجراحية ويقلل بشكل ملحوظ من وقت العملية. خطوة شائعة من العمليات الجراحية الأخرى هي رفع القلب من الصدر لأداء غرزة القلب3. يجعل النهج هذا الأسلوب هذه الخطوة غير ضرورية. اعتمادا على البروتوكول, اثنين من الإجراءات المختلفة يمكن أن يؤديها: انسداد مؤقت باستخدام tourniquet للحث على نقص التروية /reperfusion على مدى وقت محدد; أو انسداد دائم من الشريان عن طريق تحديد الرباط. يمكن تقييم نجاح الانسداد باستخدام تخطيط القلب (ECG) والتغيرات المجهرية في البطين الأيسر (LV) بالإضافة إلى الخفقان.
خطوة أخرى مهمة قبل الجراحة هي النوبات. بينما في معظم الحالات، يتم إجراء النوبات عن طريق القصبة الهوائية أو عن طريق الإدراج عن طريق الفم من الأنبوب تحت الرؤية عن طريق شق الجلد في الحلق، ويصف هذا البروتوكول الاحتضان endotracheal من الحيوان تخدير مما يقلل من صعوبات في التنفس أو التهابات بعد الجراحة4،5. لتجنب مضاعفات ما بعد الجراحة، يتم إزالة الهواء من الصدر عن طريق حقنة قبل إغلاق الصدر.
المهمة الثانية لهذه المادة هو تقييم وظيفة هيموديناميك عن طريق معزولة تعمل في القلب نموذج تجريبي، وكيف يتم استخدامه في مشاريع أخرى داخل معهدنا6،7. في حين أن تخطيط صدى القلب، والتصوير بالرنين المغناطيسي القلبي (MRI) والتدين الحجمي الغازي لحلقات حجم الضغط هي طرق معروفة ومستخدمة على نطاق واسع لتقييم وظيفة القلب في الجسم الحي، ومن المعروف أن لديهم بعض القيود. يشيع استخدام الأساليب الغازية، مثل استخدام القسطرة لفحص الوظيفة العالمية أو معلمات محددة للقلب، وهي تمثل المعيار الذهبي لقياسات القلب. في المقابل، ونادرا ما يستخدم جهاز القلب العامل السابقين العامل بسبب تعقيده وتكلفته. هناك العديد من الجوانب الهامة، من خليط من الزبيب إلى التكميم الكافي للقلب، والتي هي حاسمة لنجاح التقييم. تم وصف جهاز القلب العامل المعزول أولاً من قبل أوسكار لانغيندورف في 18978 وتم تعديله على مدى العقود الأخيرة9. اليوم، هناك نموذجان يستخدمان: وضع لانغيندورف (LD) ووضع القلب العامل (WH). في دراستنا، يتم استخدام وضع LD لتأقلم القلب مع بيئته الجديدة (حوالي 15 دقيقة). في هذا الوضع، يتم قنينة القلب عن طريق الشريان الأورطي والشرايين التاجية يتم perterogradely بشكل صحيح، تزويد الكافي عضلة القلب. في وضع LD، القلب لا يؤدي أي عمل حجم الضغط. على النقيض من ذلك ، في وضع WH ، يتم قذف الأذين الأيسر عن طريق الوريد الرئوي ، والذي يدخل من خلاله perfusate الأذين الأيسر. ثم يضخ القلب هذا التخبط من الناحية الفسيولوجية ضد حمولة لاحقة محددة مسبقًا. من خلال زيادة ما بعد التحميل مع مرور الوقت، وظيفة القلب يمكن قياسها باستمرار. يمكن قياس المعلمات مثل تدفق الشريان التاجي، والإخراج القلبي (CO)، وحجم السكتة الدماغية (SV) والعمل، وتدفق الأذينية والضغوط الانقباضي والانبساطي LV. يمكن التحقيق في تأثير العلاجات المختلفة مباشرة وعلى القلب فقط6,10. وعرضت مراجعة أجراها لياو وPodesser9 الاستخدام الواسع النطاق لهذه الطريقة في تقييم الآثار الدوائية على وظيفة القلب والتمثيل الغذائي وكذلك في استكشاف مختلف الأمراض مثل MI و HF والسمنة والسكري.
باختصار، يقدم هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لإجراء إصابة الإقفار أو هضم عضلة القلب (MIR) في الجسم الحي. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح توصيف LV (ديسس)وظيفة على قلب الفئران المعزولة بعد MI. يقدم هذا البروتوكول مزيجًا فريدًا من العلاج والتحليل.
Protocol
البروتوكول التجريبي الذي قدم النتائج المذكورة في هذه المقالة قد تمت الموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات الإقليمية للتجارب الحيوانية المختبرية في جامعة فيينا الطبية ووزارة التعليم والعلوم والبحوث الاتحادية النمساوية (BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016). وتتفق جميع التجارب مع دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، الذي نشرته المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (منشور المعاهد القومية للصحة رقم 85-23، المنقح في عام 1996).
ملاحظة: يتم استخدام ذكور ذكور يبلغ من العمر 10-12 أسبوعًا من الجرذان التي يبلغ وزن الجسم 250−300 غرام. كما يتم تنفيذ الإجراءات التالية والعلاجات في بيئة معقمة من غرفة العمليات (OR)، وارتداء الدعك، والقفازات، وأقنعة الوجه وأغطية عند التعامل مع الحيوانات. قبل الدخول إلى غرفة العمليات، تأكد من غسل اليدين وتطهيرها. إذا كان القصد هو إجراء عملية على عدة في جلسة جراحية، إما غسل وتطهير، أو الأوتلاف الأدوات في ما بين العمليات. هذه المبادئ التوجيهية الصحية صالحة لجميع الإجراءات الواردة في قسم البروتوكول.
1. الإعداد قبل الجراحة والتخدير
- بدء التخدير قبل الجراحة عن طريق حقن خليط من الزيلازين (4 ملغم / كغم من الأسلحة البيولوجية) والكيتامين (100 ملغم / كجم من الأسلحة البيولوجية) داخل الرحم.
- الجرذان مع 14 G أنبوب وتنفس التي تسيطر عليها وحدة التخزين مع خليط من O2, الهواء وisoflurane (1-2.5%) في 75−85 السكتات الدماغية / دقيقة، 100 مل / السكتة الدماغية / BW(الشكل 1A). إذا لزم الأمر، للحصول على عرض أفضل أثناء التنم: تطبيق Xylocain عبر طرف القطن والصوف على البلعوم السفلي لتحقيق الاسترخاء المحلي.
- ضع الفئران على طاولة تشغيل ساخنة في موقف غير ابخ ثم قم بإصلاح الـ forelimbs مع الشريط (الشكل 1B).
- قياس درجة حرارة المستقيم مع مسبار.
ملاحظة: ينبغي الحفاظ عليها بين 37.5-38.5 درجة مئوية. - حلق الصدر وتنظيف منطقة التشغيل مع محلول اليود بوفيدون مطهر. تطبيق مرهم العين على الفئران لمنع جفاف العينين.
- إدارة التاثير داخل العملية عن طريق حقن بيريتراميد (0.1 مل / كغ من BW) intraperitoneally.
- مكان مسبار ECG تحت الجلد في أطراف الحيوان.
- تحقق من ردود الفعل التيل وأص القدم قبل البدء في العملية الجراحية.
2. الإجراء الجراحي - تحريض على نقص التروية عضلة القلب
- إجراء شق الجلد باستخدام مشرط. تأكد من بدء 2 مم باراسترينالي على الصدر الأيسر على مستوى الفضاء الوربي الثالث والاستمرار في خط الإبط الأمامي على مستوى الفضاء الوربي الخامس (الشكل 1C).
- استبدال العضلات السطحية بلطف لجعل الأضلاع مرئية (الشكل 1D).
- في حالة النزيف البسيط ، استخدم الكيوتر لطمس أو فصل الأنسجة المحيطة.
- قم بإجراء استئصال الصدر على مستوى الفضاء الوربي الرابع وأدخل مُناهاً للحصول على رؤية القلب والرئة (الشكل 1E). افتح الجنب بعناية لتجنب النزيف.
- مؤقتا occlude LAD باستخدام tourniquet للحث على نقص التروية / reperfusion (مير) على مدى وقت محدد؛ أو بشكل دائم (MI) من خلال جعل 6-7 عقدة باستخدام خياطة 6-0 لإغلاق الربط (الشكل 1F, G).
ملاحظة: تقع البقعة المناسبة لغلق جهاز تقييم الحالة في القلب على بعد حوالي 2-3 مم تحت فتحة اليمين على الهامش الجانبي في الجزء البطني/الأيسر من القلب. ويرتبط الانسداد الناجح مع تغييرات ECG (رفع الجزء ST) والتغيرات العيانية في LV كما بالينغ. - في حالة نموذج الإقفار/إعادة التسريب، أعد فتح LAD عن طريق إزالة التورنيكيت بعد 30 دقيقة من الانسداد.
- إغلاق الصدر مع ثلاث خياطة زر واحد باستخدام 4-0 خياطة أحادية أحادية(الشكل 1H). قبل تشديد خياطة الماضي، وإزالة أي الهواء المتبقية من الصدر مع حقنة 10 مل لمنع االثورة (الشكل 1I).
- إعادة وضع العضلات وإيقاف التخدير المتطاير.
- خياطة الجلد مع خياطة مستمرة باستخدام خياطة 4-0 (الشكل 1J).
- إدارة رذاذ مطهر للحماية من العدوى والعض من خياطة من قبل الفئران.
3- معايير العلاج والاستبعاد بعد الجراحة
- إبقاء الفئران على طاولة التدفئة حتى يستيقظوا. اُنسف الفئران بمجرد أن تبدأ في التنفس تلقائياً.
- وضع الفئران تمبت في قفص تحت مصباح التدفئة لمنعهم من التبريد.
- إعادة الفئران إلى بيوت الحيوانات في ظل ظروف موحدة عندما تبدأ تتصرف بشكل طبيعي مرة أخرى.
- إضافة 2 أمبولات من بيريتراميد و 30 مل من الجلوكوز 5٪ إلى 250 مل من الماء للاكتئاب بعد العملية الجراحية لمدة ثلاثة أيام.
- تحقق من اللياقة البدنية وسلوك الفئران مع قائمة الاختيار ومعايير الاستبعاد (الجدول 1). مراقبة الحيوانات مرتين في اليوم للأسبوع التالي، ثم مرتين في الأسبوع.
ملاحظة: وفقا للمعايير الدولية، وتقديم أي الحيوانات المعذبة، أو الحيوانات التي تكسب ما يصل إلى 6 نقاط في التقييم مع قائمة الاختيار، للأطباء البيطريين لاتخاذ القرارات ذات الصلة بالعلاج. يجب التضحية على الفور أي الحيوانات التي كسب 7 أو أكثر من النقاط مع جرعة زائدة من الكيتامين والزيلازين.
| دراسه | المراقبه | نقاط |
| وزن الجسم | مستقره | 0 |
| 10% خسارة | 4 | |
| 15% خسارة ل 48 ساعة | 7 | |
| 18% خسارة | 7 | |
| عادي (معطف مسطح ولامع) | 0 | |
| المظهر الخارجي | piloerection | 1 |
| ورم دموي | 2 | |
| جروح الجلد / التخفيضات / علامات لدغة | 2 | |
| انخفاض شديد الاستمالة | 4 | |
| (فتحات غير نظيفة / متخثر أو رطبة) | 7 | |
| تهيج أو جروح شديدة في الجلد | 7 | |
| موقف حدب > 2 ح | 7 | |
| انتفاخ البطن كبيرة (استسقاء) | 7 | |
| السلوك | عادي (النوم، غريبة، اتصالات اجتماعية، رد فعل عندما لمست) | 0 |
| سلوك غير عادي، مثل إعاقة النشاط | 2 | |
| العزلة الذاتية، أو فرط النشاط أو القوالب النمطية | 4 | |
| الخمول لـ <6 h | 4 | |
| الخمول لمدة 6 ساعات إلى 8 ساعات | 7 | |
| apathia > 8 ساعة | 7 | |
| stereotypia دون انقطاع ل> 10 دقيقة، ولا تزال مستمرة بعد 2 ساعة | 7 | |
| علامات الألم عندما لمست | 7 | |
| التبدل التلقائي | 7 | |
| الهضم | العاديه | 0 |
| الإسهال (البراز الناعم) | 3 | |
| الإسهال لمدة 72 ساعة أو مائي | 7 | |
| دموية البراز | 7 |
الجدول 1: قائمة مرجعية ومعايير استبعاد. يحتوي هذا الجدول على الامتحانات التي يجب مراعاتها والنقاط المقابلة. وفقا لذلك ، يجب تكييف العلاج بعد الجراحة للحيوان ، أو يجب استشارة الطبيب البيطري.
4- قياسات تخطيط صدى القلب
ملاحظة: عادة ما يتم إجراء تخطيط صدى القلب مرتين، قبل تحريض MI وقبل حصاد الأعضاء.
- حقن الفئران بخليط من الزيلازين (4 ملغم/كغ من الأسلحة البيولوجية) والكيتامين (100 ملغم/كغ من الأسلحة البيولوجية) داخل الصفاق.
- ضع الفئران في وضعية اِناء على صينية تدفئة. تطبيق هلام صدى على الصدر، مما يساعد موجات الموجات فوق الصوتية السفر بشكل أفضل ويقلل من تداخلات الإشارة.
- الحصول على مناظر قصيرة محور parasternal من تجويف LV على مستوى العضلات الحليمية.
- إجراء تخطيط صدى القلب M-وضع من أجل قياس الكسر القذف البطيني الأيسر ومورفولوجيا.
5. حصاد الأعضاء (بدون قلب عامل)
- يُعطى الإكسيلازين (4 ملغم/كغم من وزن الجسم) والكيتامين (100 ملغم/كغم من الأسلحة البيولوجية) داخل الصفاق قبل حصاد الأعضاء. تأكد من أن ردود الفعل سلبية.
ملاحظة: لا يلزم النوباض لأن الإجراء لا يستمر أكثر من 1 دقيقة. - استخدام مشرط لجعل شق الجلد تحت xiphoid وتمديدها بالتوازي مع الأضلاع على كلا الجانبين باستخدام مقص.
- قطع الأضلاع في خط الإبطين الأمامية والاستيلاء على xiphoid لرفع الصدر حتى (الشكل 2A).
- إزالة الالتصاقات الأنسجة التشريحية أو الليفية عن طريق تمزق بعناية الأنسجة مع اثنين من أزواج من ملقط.
- أخذ عينات الدم (لتقييم غاز الدم أو التحليلات الجزيئية) من الوريد الكافا السفلي مع حقنة 5 مل.
- تنفيذ ختان القلب كله على مستوى مدخل ومنفذ (الشكل 2B). إذا لزم الأمر، والمضي قدما في تقييم القلب العمل كما هو موضح في القسم 6.
- حصاد الأعضاء، صدمة الصقيع لهم في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات الجزيئية، أو في الفورمالديهايد لأغراض النسيج.
6. قياسات حيوية الجسم السابق عن طريق نظام القلب العامل
ملاحظة: الإعداد العام ومكونات الجهاز قد سبق وصف11. يصف البروتوكول التالي معالجة قلب الحيوان والخطوات اللازمة لتقييم وظيفة LV.
- تخدير الفئران كما هو موضح في الخطوة 5.1 وحقن 200 وحدة دولية من الهيبارين عن طريق الوريد (الوريد الفخذي).
- افتح الصدر عبر شق تحت القوس الخطي بمشرط واوسعه إلى كل من خطوط الإبط الأمامي مع المقص ورفع القص.
- قطع السفن كبيرة بالقرب من منفذ أو مدخل إلى القلب إلى مكوس ذلك (الشكل 2B).
- غمر القلب في الجليد الباردة Krebs-Henseleit العازلة وجبله على نظام القلب المعزول دريثروسيت التي غرست عن طريق قنى الأبهر (الشكل 3A).
- ابدأ بوضع LD مع حمولة ثابتة من 60 مم زئبق (فترة الاستقرار).
- بعد 15 دقيقة من LD الوضع، انتقل إلى وضع WH. ولذلك، cannulate الأذين الأيسر عن طريق الوريد الرئوي (الشكل 3B). ثم، تغيير اتجاه التدفق في النظام عن طريق فتح مقطع أن يُغلق قنية الأذينية. وهذا يؤدي إلى ضخ الأذين الأيسر وتدفق الدم الفسيولوجي في القلب الأيسر11.
- سجل قياسات ديناميكية الدموية لمدة 20 دقيقة في وضع WH.
- جمع قطرات الدم من التاجيات مع حقنة 2 مل لقياس تدفق التاجية (CF، مل / دقيقة) كل 5 دقيقة.
ملاحظة: يتم قياس CF على أنه الفرق بين التدفق الأذيني الأيسر (LAF) وتدفق الأبهر (AF). - إجراء قياسات مستمرة من LAF (ما يعادل الناتج القلب) و AF مع مسبار تدفق.
ملاحظة: يتم إدراج المسبار عبر جهاز WH في LV. جميع البيانات مسجلة باستمرار. - إذا طلب البروتوكول المستمر، أدخل قسطرة عالية الدقة بشكل رجعي عبر الصمام الأبهري في LV ومقياس الضغط الانقباضي البطيني الأيسر (LVSP).
- لتقييم حجم الضغط العمل الذي يتم تنفيذه في الدقيقة الواحدة، حساب حجم السكتة الدماغية كما الناتج القلبي مقسمة على معدل ضربات القلب.
- حساب عمل القلب الخارجي (EHW) وفقا للصيغة التالية: CO X LVSP(ز × م / دقيقة) تطبيع لوزن القلب.
Representative Results
وقد نشرت Pilz وآخرون النتائج التالية6. مع هذا الإجراء الجراحي الدقيق ، يمكن التحقيق في التأثير القلبي للقلب من التكداح الإقفاري (RIPerc). هذا هو علاج جديد محتمل للمرضى الذين يعانون من مرضى الوفيات الحادة أو مير وإعادة عرض البطين اللاحقة ، والتي تؤدي في كثير من الحالات إلى HF متتالية. في هذا البروتوكول، تعرضت الحيوانات ل 30 دقيقة من انسداد LAD تليها reperfusion (أي مير).
لإثبات تكرار الإجراء ، تم إجراء التخفيضات النسيجية والبقع (الشكل 4A). كان من الواضح أن ندبة ليفية في الحيوانات مير + RIPerc المعالجة كانت مماثلة مع تشكيل ندبة الحيوانات الشام في حين أن المقارنة بين التليف بين الشام والمجموعات مير كانت كبيرة (الشكل 4B). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الحيوانات المعالجة مير +RIPerc انخفاض التليف بشكل ملحوظ مقارنة بالحيوانات المعالجة من MIR. ومع ذلك، فإن الصور النسيجية التمثيلية توضح فاعلية هذا الإجراء الجراحي حيث أن الاحتشاء مستمر بشكل صريح في مجموعة MIR(الشكل 4A). باستخدام في الجسم الحي echography، الكسر القذفي، LV نهاية الانبساطي ونهاية الانقباضي أقطار (LVEDD وLVESD) تم قياس وأظهرت بشكل ملحوظ وظيفة القلب بسبب العلاج مير في حين تم الحفاظ على المعلمات الهوديميك من قبل RIPerc(الشكل 4C−F). أظهرت البيانات السابقة vivo hemodynamic فعالية الإجراء كما أظهرت مجموعة مير انخفاضات كبيرة في LVSP، والإخراج القلبي (CO)، وحجم السكتة الدماغية (SV) وكذلك عمل القلب الخارجي (EHW) (الشكل 5A−G).
بحث الأدب حول هذا الإجراء الجراحي ذكرت أي تعليقات سلبية أو غير المرضية والنتائج عندما كان أداؤها بشكل كاف. ومع ذلك، فإن العثرات المذكورة في المقدمة والمناقشة بحاجة إلى منع، والتدريب إلزامي لاكتساب مستوى ثابت من الأداء والحصول على نتائج قابلة للمقارنة.
الشكل 1: الإعداد قبل الجراحة والإجراءات الجراحية. (أ) الاحتضان من الحيوان باستخدام أنبوب 14 G. (ب) سوبين تحديد المواقع وتطهير المجال الجراحي. (C) شق الجلد (2 مم parasternal على الصدر الأيسر على مستوى الفضاء الوربي الثالث). يجب أن يصل الشق إلى خط الإبط الأمامي على مستوى الفضاء الوربي الخامس. (D) يزيّر العضلات لجعل الأضلاع مرئية. (ه) فتح الصدر. (F) الانسداد الدائم لـ LAD باستخدام 6−7 عقدة. (G) الانسداد العابر من LAD باستخدام tourniquet. (H) إغلاق الصدر بعد نقص التروية وإعادة ضخ عضلة القلب عن طريق وضع ثلاث خياطة أحادية العقد حول الأضلاع. (I) إغلاق الصدر الصحيح. استخدام حقنة 10 مل لإزالة أي الهواء المتبقي من الصدر قبل تحديد عقدة الماضي بإحكام. وهذا جزء لا يتجزأ من منع وجود اٍسَرِةَ اِسَرَة. (J) خياطة الجلد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حصاد الأعضاء. ( أ) فتح الصدر مع التخفيضات تحت xiphoidal وتمديدها إلى كل من خطوط منتصف الإبطين. يتم إجراء المزيد من التخفيضات من خلال الأضلاع لتسهيل رفع القص. (ب) ختان القلب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: جهاز قلب معزول. (أ)وضع Langendorff. يتم تركيب القلب على جهاز WH عن طريق التكبل من الشريان الأورطي. (ب) وضع القلب العامل. يمكن تحويل النظام إلى نموذج WH لتقييم وظيفة القلب عن طريق اِزهان الأذين الأيسر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تأثير تكييف نقص تروية عن بعد على تشكيل ندبة، وظيفة البطين الأيسر وإعادة عرض. (أ)شرائح LV النسيجية التي تم حصادها في اليوم 14 بعد ضخ عضلة القلب. (ب) النتائج الكمية للتليف في الرسوم البيانية شريط. (C) الممثل M-وضع تخطيط صدى القلب. (D) كسر القذف (EF) كمي في الرسوم البيانية الشريطية. (E) LV نهاية الانقباضي القطر (LVESD) كميا في الرسوم البيانية شريط. (F) LV نهاية-الانبساطي القطر (LVEDD) كميا في الرسوم البيانية شريط. MIR, نقص التروية عضلة القلب-reperfusion; RIPerc، عن بعد perconditioning. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM. * p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001. أعيد طبعه من بيلز وآخرون6 بإذن من إلسفير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تأثير RIPerc على دالة LV الهكمية. (أ) LV الضغط الانقباضي (LVSP)، (ب) خرج القلب (CO)، و (C) تم الحصول على نتائج حجم السكتة الدماغية (SV) من قلب العمل المعزول في اليوم 14 بعد إعادة ضخ عضلة القلب. (D) يتم تصوير CO كدالة من التحميل؛ (F) الخارجية القلب العمل كدالة afterload، النتائج كميا في شريط الرسم البياني (E و G). يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM و n = 4-7 لكل مجموعة. * ف < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001. MIR, نقص التروية عضلة القلب / reperfusion; RIPerc، شرط مسبق عن بعد نقص تروية؛ EHW, عمل القلب الخارجي; SV، حجم الحد؛ AUC، منطقة تحت المنحنى. أعيد طبعه من بيلز وآخرون6 بإذن من إلسفير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تعتبر إعادة عرض السلبية بعد MI أن تكون آلية رئيسية في تطوير قصور القلب. لذلك، لضمان استمرارية البحوث القلبية الوعائية، وينبغي أن تكون الإجراءات والتقنيات التجريبية استنساخها. 10- إن البروتوكول التجريبي المفهوم والمحدد بوضوح هو عنصر أساسي في قابلية التكاثر. ويشير قابلية التكاثر إلى النتائج التي يمكن تكرارها من قبل علماء متعددين والتحقق من صحتها عبر المختبرات. تهدف هذه الدراسة إلى تقديم طريقة شبه طفيفة التوغل للحث على MI المزمنة أو التي أعيد غرسها وتقييم وظيفة الدم الديناميكية القلبية في الفئران.
هذه النتائج والبيانات المنشورة تظهر فعالية عالية من هذه الطريقة الجراحية وأهميتها في البحوث على MI، وإعادة عرض وHH. بينما يمكن استخدام إصابة الإقفارية/إعادة الضخ لفهم التغييرات في MI مع إعادة الضخ اللاحقة، يسمح الانسداد الدائم بمزيد من الفهم لعمليات إعادة عرض الـ 2000 على المدى القصير والطويل. الأساليب الجراحية الأخرى تسبب المزيد من تلف الأنسجة والحيوانات تظهر مخاطر أعلى من العدوى النامية وفوتوثوراس، مما أدى إلى ارتفاع معدلات التسرب. وعلى النقيض من ذلك، يهدف هذا الإجراء إلى الحد من الوفيات عن طريق تحسينات محددة في الإعداد والمناولة. بالإضافة إلى ذلك, أنها تظهر الاختلافات في التوسع ندبة ليفية بسبب انسداد LAD غير مستقرة.
يوفر بروتوكولنا طريقة سهلة للانبيب ، والتي تعد واحدة من أهم الخطوات في الإجراء بأكمله. على النقيض من العديد من المنشورات الأخرى12، لا يتم إجراء استئصال القصبة الهوائية في الإجراء الخاص بنا. وهذا يعزز الصحوة وإعادة تأهيل الحيوانات بعد الجراحة، مما يؤدي إلى تطور التغيرات الفسيولوجية المرضية التي يقصدها هذا الإجراء الجراحي قبل خضوع الحيوانات لقياسات ما بعد العملية الجراحية. من الواضح أنه إذا كان بروتوكولًا غير بقاء ، يتم إجراء استئصال القصبة الهوائية تحت الرؤية وبالتالي يكون من الأسهل القيام به. بالإضافة إلى ذلك، لا ينطبق إغلاق القصبة الهوائية في بروتوكول البقاء على قيد الحياة. إذا تم فتح الصدر ، فمن الإلزامي لتهوية الرئة لمنع الانهيار. ولذلك، يتم تنبيب الفئران قبل إجراء العمليات الجراحية. لا يقطع النهج الحد الأدنى من الغازية الأضلاع أو القص وبالتالي الحفاظ على الإحكام والاستقرار في الصدر. وبالتالي، تحسن انتعاش الحيوانات، وخطر الإصابة بـ "هضورات الفوط" أو النزف التلقائي منخفض نسبياً.
وكما ذكر آنفا، في حين أن النوبات ذات ميزة واضحة، فإنه من الصعب القيام به، وقد يتسبب في ارتفاع معدل التسرب في بداية التجارب. ويمكن تخفيف هذه المشكلة مع التدريب وبعض المعرفة التشريحية. من المهم إدخال الأنبوب في الزاوية اليمنى وإطالة جسم الحيوان حتى يضيء الضوء من خلال الشفاه الصوتية التي يمكن بعدها دفع الأنبوب إلى الأمام بلطف. الحرص على عدم إيذاء الشفاه الصوتية لأن هذا يمكن أن يسبب تورم، انسداد لاحقة من glottis والاختناق.
ومن المهم أيضا أن يتم ربط LAD بشكل صحيح. النافذة الجراحية الصغيرة، القلب النابض السريع، والرئة التهوية (تجنب لمسه قدر الإمكان حيث أن كل اتصال قد يؤدي إلى نزيف في الرئة) تجعل الوعاء غير مرئي بوضوح. لذلك، لا غنى عن المعرفة التشريحية. لا غنى عن auricle اليسار للمساعدة في توحيد كل من المنطقة المعرضة للخطر ووضع الربط حول LAD. غرزة يحتاج إلى أن يؤدي intramurally، وليس transmurally في LV لأن هذا قد يسبب انخفاض في قطر غرفة LV وحجم الذي ليس بسبب العمليات المرضية. ويرتبط الانسداد الناجح مع زرقة من منطقة عضلة القلب في خطر وارتفاع ST الجزء على تخطيط القلب. القيد الرئيسي لهذا الإجراء هو الموضع الصحيح للخياطة. لتحقيق نتائج مماثلة، يجب أن تكون غرز في نفس المستوى وتحتاج إلى استخدام كميات مماثلة من الأنسجة. وهذا يتطلب مستوى عال من التدريب ويجب النظر في الأوزان المختلفة للحيوانات. نقطة أخرى للنظر هي إزالة كافية من افراغات الصدر قبل إغلاق الفضاء الوربي. إذا لم يتم تنفيذ هذا بدقة ، فإن الحيوانات تظهر صعوبات في التنفس حيث سيتم إعاقة تضخم الرئة اليسرى من قبل رئة. كما ذكر أعلاه، يمكن تخفيف هذا باستخدام حقنة لإزالة أي هواء متبقي من الصدر.
حالياً، هذا الإجراء MI هو أسلوب شائع الاستخدام الذي يضمن نتائج قابلة للمقارنة ومعدل بقاء عالية إذا تم تنفيذ الخطوات الهامة بدقة عالية. ويمكن تقييم المشاريع المستقبلية على مختلف العلاجات والأجهزة أو الأدوية في MI، HF أو إعادة عرض القلب من خلال تنفيذ هذه التقنية طفيفة التوغل.
والقياسات التي تُستخدم في هذه المقاييس، كما سبق ذكره، لا تستخدم عادة لأن صيانتها ومناولتها تتطلب معدات ومعارف محددة. وللحصول على بيانات تمثيلية وقابلة للمقارنة، يجب تجنب العثرات. الخطوات الأكثر أهمية هي تركيب القلب والتحول من نموذج D إلى وضع WH. إذا لم يتم استئصال القلب بشكل كاف، قد يكون من الصعب تركيب كما طول الأنسجة الأبهري كافية هو مطلوب لإصلاح القلب إلى الجهاز. بعد وقت قصير من الاتصال بوضع LD ، قد ينخفض تردد القلب بسبب الغسيل في المخزن المؤقت البارد ، أو انفصال المحفزات الفسيولوجية في الجسم أو إعادة ضخ الدم بالدم من نوع آخر بواسطة الجهاز. في مثل هذه الحالات، يجب تطبيق جهاز تنظيم ضربات القلب لاستعادة كل من والحفاظ على التردد الفسيولوجي. وهذا يضمن نتائج مماثلة في جميع الحيوانات. كما حجم الدم داخل الجهاز هو مضاعف من حجم الفسيولوجية في الفئران، وتستخدم خلايا الدم الحمراء البقرية في تعليق العازلة Krebs-Henseleit.
التحول من وضع LD إلى وضع WH مرادف للتبديل من السلبي إلى عمل القلب النشط. يتم استخدام وضع LD لتعود القلب على بيئتها الجديدة. في وضع WH، يجب أن يؤدي القلب وظائفه القذف الفسيولوجية. ولذلك، فإن مرحلة التكيف قصيرة للظروف الجديدة مطلوبة قبل التقييم عن طريق زيادة الحمولة.
خطوة أخرى حاسمة التي تنسى عادة هو إعداد وصيانة كافية للجهاز و perfusate. يجب أن يكون حجم دقيق لكل مركب مختلطة ودرجة الحرارة داخل النظام يجب أن تسيطر عليها وتعديلها. ومع ذلك، فإن WH هو طريقة أنيقة لتقييم الناتج القلبي، وحجم السكتة الدماغية، والضغط البطيني الأيسر وتدفق الشريان التاجي في وقت واحد.
هذا الإجراء القابل للاستنساخ للغاية للحث على MI والبيانات الممثلة التي حصل عليها جهاز WH تثبت قدرتها نفسها. النهج شبه الغازية الحد الأدنى، ومستوى انسداد LAD وطريقة الاشتعال تسهيل الانتعاش السريع وتقلب منخفض في حجم المزارع. بالإضافة إلى ذلك، يوفر تحليل وظيفة القلب في قلوب العمل المعزولة نتائج ديناميكية الدموية القيمة.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون فريق مسرح العمليات والفنيين في مركز أبحاث الطب الحيوي على مساهمتهم ومساعدتهم الفنية وإسهاماتهم ونصائحهم القيمة. يتم تمويل المشاريع من قبل معهد لودفيغ بولتزمان، مجموعة لأبحاث القلب والأوعية الدموية (REM المشروع).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
| Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
| Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
| Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
| INTUBATION | |||
| Air | |||
| Oxygen (pure) | |||
| Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
| 14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
| PREPARATION | |||
| Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
| Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
| Shaver | |||
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
| Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
| Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
| Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
| Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
| Mensur | MTI | 29-260/25 | |
| Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
| Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
| Needleholder thin | Martin | ||
| Round hook | BT-190 | ||
| Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
| Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
| Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
| Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
| Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
| Surgical scissors | |||
| SUTURES | |||
| PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
| Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
| Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
| COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
| PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
| EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
| Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
| Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
| Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
| Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
| Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
| PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |
References
- WHO. Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015. World Health Organization. , (2016).
- Jaquet, K., et al. Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism. Stem Cells and Development. 14 (3), 299-309 (2005).
- Liu, P., Xu, B., Cavalieri, T. A., Hock, C. E. Age-related difference in myocardial function and inflammation in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion. Cardiovascular Research. 56 (3), 443-453 (2002).
- Kolk, M. V. V., et al. LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments. (32), e1438 (2009).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery. Journal of Visualized Experiments. (150), e59591 (2019).
- Pilz, P. M., et al. Remote ischemic perconditioning attenuates adverse cardiac remodeling and preserves left ventricular function in a rat model of reperfused myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 285, 72-79 (2019).
- Santer, D., et al. In vivo and ex vivo functional characterization of left ventricular remodelling after myocardial infarction in mice. ESC Heart Failure. 2 (3), 171-177 (2015).
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugetierherzen II. Über den Einfluss von Wärme und Kälte auf das Herz der warmblütigen Tiere. Pflügers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 66 (67-68), 355-400 (1897).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Podesser, B. K., et al. The erythrocyte-perfused "working heart" model: hemodynamic and metabolic performance in comparison to crystalloid perfused hearts. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 9-15 (1999).
- Kiss, A., et al. Argon preconditioning enhances postischaemic cardiac functional recovery following cardioplegic arrest and global cold ischaemia. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 54 (3), 539-546 (2018).
- Kiss, A., et al. Vagal nerve stimulation reduces infarct size via a mechanism involving the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor and downregulation of cardiac and vascular arginase. Acta Physiologica. 221 (3), 174-181 (2017).
