Denne artikel præsenterer en effektiv metode til at udføre myokardieiskæmi og efterfølgende kronisk reperfusion hos rotter ved hjælp af en minimalt invasiv tilgang. Desuden vurderes rotternes venstre ventrikelhærefunktion ved ekkokardiografi og isolerede arbejdshjertemetoder.
Myokardieinfarkt (MI) er fortsat den største bidragyder til sygelighed og dødelighed på verdensplan. Derfor er forskning i dette emne obligatorisk. En let og meget reproducerbar MI induktion procedure er nødvendig for at opnå yderligere indsigt og bedre forståelse af de underliggende patologiske ændringer. Denne procedure kan også bruges til at vurdere virkningerne eller styrken af nye og lovende behandlinger (som lægemidler eller interventioner) i akut MI, efterfølgende remodeling og hjertesvigt (HF). Efter intubation og præoperativ præoperativ forberedelse af dyret blev der udført en bedøvelsesprotokol med isofluran, og den kirurgiske procedure blev udført hurtigt. Ved hjælp af en minimalt invasiv tilgang, venstre forreste faldende arterie (LAD) var placeret og okkluderet af en ligatur. Okklusionen kan udføres akut for efterfølgende reperfusion (iskæmi/ reperfusion skade). Alternativt kan fartøjet være ligeret permanent at undersøge udviklingen af kronisk MI, remodeling eller HF. På trods af almindelige faldgruber er frafaldsprocenterne minimale. Forskellige behandlinger såsom fjernbetjening iskæmisk konditionering kan undersøges for deres cardioprotective potentielle præ-, peri- og post-operatively. Den postoperative genopretning var hurtig, da anæstesien blev kontrolleret præcist, og operationens varighed var kort. Postoperativ analgesi blev administreret i tre dage. Den minimalt invasive procedure reducerer risikoen for infektion og betændelse. Desuden letter det en hurtig genopretning. De “arbejdshjerte” målinger blev udført ex vivo og aktiveret præcis kontrol af preload, efterlast og flow. Denne procedure kræver særligt udstyr og uddannelse for at opnå tilstrækkelig ydeevne. Dette manuskript giver en detaljeret trinvis introduktion til udførelse af disse målinger.
Selv om forekomsten er konstant faldende, akut myokardieinfarkt (MI) er stadig den største bidragyder til sygelighed og dødelighed på verdensplan1. Der er begrænsninger på at evaluere effekten af potentielle behandlinger som lægemidler eller kirurgiske procedurer, der forebygger og behandler akut MI. Før deres virkninger kan undersøges hos mennesker, skal disse behandlinger testes for risici på forhånd, herunder in vivo-undersøgelser hos dyr. Der er ingen bedre mulighed for at studere en patologi end under in vivo betingelser. Derfor, MI induktion i rotter eller mus og endda store dyremodeller (svin eller får) tillader undersøgelse af kort- (akut) og langsigtede (kroniske) ændringer på grund af iskæmi i kranspulsårerne og det omgivende myokardi, samt systemiske ændringer på grund af nedsat hjertefunktion. Infarkt størrelse var tidligere det vigtigste mål, men for nylig efterfølgende hjerte remodellering processer i akut MI eller iskæmi / reperfusion skade samt i på hinanden følgende hjertesvigt (HF) er blevet af stor interesse. Derfor er der behov for en sammenlignelig og let reproducerbar metode for at opnå ensartede resultater.
Mens brugen af cryo-ablation at få MI er blevet rapporteret2, vores metode bygger på andre undersøgelser, hvor efterforskere occlude venstre forreste faldende arterie (LAD) ved en enkelt søm ligation. I forhold til (hemi-)sternotomy procedurer, den minimalt invasive tilgang, som vil blive præsenteret i denne artikel, tillader en hurtigere postoperativ opsving og markant reducerer driftstiden. Et fælles trin i andre kirurgiske procedurer er løft-out af hjertet fra brystkassen til at udføre hjertet søm3. Metodens fremgangsmåde gør dette trin unødvendigt. Afhængigt af protokollen kan der udføres to forskellige procedurer: en midlertidig okklusion ved hjælp af en årepresse til at fremkalde iskæmi/reperfusion over en bestemt periode; eller en permanent okklusion af arterien ved fastsættelse af ligaturen. Succesen med okklusion kan evalueres med elektrokardiogram (EKG) og de makroskopiske ændringer i venstre hjertekammer (LV) samt dens paling.
Et andet vigtigt skridt forud for operationen er intubation. Mens intubation i de fleste tilfælde udføres via tracheotomi eller via oral indsættelse af røret under synsvidde ved et hudindsnit i halsen, beskriver denne protokol den endotrakeale intubation af detverestede dyr, hvilket reducerer åndedrætsbesvær eller infektioner postoperativt4,5. For at undgå postoperative komplikationer fjernes luft fra brystkassen via en sprøjte, før brystet lukkes.
Den anden opgave i denne artikel er evalueringen af hæmodynamisk funktion via en isoleret arbejde hjerte eksperimentel model, hvordan det bruges i andre projekter inden for vores institut6,7. Mens ekkokardiografi, hjertemagnetisk resonans imaging (MR) og invasiv kvantificering af trykvolumen sløjfer er velkendte og udbredte metoder til at vurdere hjertefunktion in vivo, de er kendt for at have nogle begrænsninger. Invasive tilgange, såsom brugen af katetre til at undersøge den globale funktion eller specifikke parametre i hjertet, er almindeligt anvendt og repræsenterer guldstandarden af hjertemålinger. I modsætning hertil er ex vivo arbejder hjerteapparat sjældent anvendes på grund af sin kompleksitet og omkostninger. Der er mange vigtige aspekter, fra blandingen af perfusate til tilstrækkelig kannulation af hjertet, som er afgørende for en vellykket evaluering. Det isolerede arbejdshjerteapparat blev først beskrevet af Oskar Langendorff i 18978 og er blevet ændret i de seneste årtier9. I dag er der to modeller, der anvendes: Langendorff (LD) mode og arbejdshjerte (WH) mode. I vores undersøgelse, LD mode bruges til at akklimatisere hjertet til sit nye miljø (ca. 15 min). I denne tilstand, hjertet er cannulated via aorta og kranspulsårerne er perfunderet anterogradely, tilstrækkeligt leverer myokardiet. I LD-tilstand udfører hjertet ikke trykvolumenarbejde. I WH-tilstand er det venstre atrium derimod cannulated via en lungevene, hvorigennem perfusatet kommer ind i venstre atrium. Hjertet derefter pumper denne perfusate fysiologisk mod en foruddefineret efterlast. Ved at øge efterbelastningen over tid, kan hjertefunktionen løbende måles. Parametre som koronar flow, hjerte output (CO), slagtilfælde volumen (SV) og arbejde, atriestrømmen flow og LV systoliske og diastoliske tryk kan måles. Virkningen af forskellige behandlinger direkte og udelukkende på hjertet kan undersøges6,10. En gennemgang af Liao og Podesser9 præsenterede den udbredte brug af denne metode i evalueringen af farmakologiske virkninger på hjertefunktion og stofskifte samt i udforskningen af forskellige sygdomme som MI, HF, fedme og diabetes.
Sammenfattende præsenterer denne protokol en reproducerbar metode til at udføre MI eller myokardieiskæmi / reperfusion (MIR) skade in vivo. Desuden tillader det karakterisering af LV (dys-) funktion på et isoleret rottehjerte efter MI. Denne protokol præsenterer en unik kombination af behandling og analyse.
Negativ remodeling post-MI anses for at være en vigtig mekanisme i udviklingen af hjertesvigt. For at sikre kontinuiteten i hjerte-kar-forskning bør forsøgsprocedurer og -teknikker derfor kunne reproduceres. En forståelig og klart defineret forsøgsprotokol er et grundlæggende element i reproducerbarheden. Reproducerbarhed refererer til resultater, der kan gentages af flere forskere og er valideret på tværs af laboratorier. Denne undersøgelse havde til formål at præsentere en semi-minimalt invasiv metode til at fremkalde kronisk eller re-perfunderet MI og vurdere hjerte hæmodynamisk funktion hos rotter.
Disse resultater og yderligere offentliggjorte data viser den høje styrke af denne kirurgiske metode og dens betydning i forskning i MI, remodeling og HF. Mens iskæmi / reperfusion skade kan bruges til at forstå ændringerne i MI med efterfølgende reperfusion, permanent okklusion giver yderligere forståelse af de kortsigtede og langsigtede remodeling processer af myokardiet. Andre kirurgiske tilgange forårsage mere vævsskader og dyr viser højere risiko for at udvikle infektioner og pneumothorax, resulterer i højere frafald. I modsætning hertil har denne procedure til formål at reducere dødeligheden ved specifikke forbedringer i opsætning og håndtering. Derudover viser de variationer i fibrotisk ar ekspansion på grund af ustabil LAD okklusion.
Vores protokol giver en nem metode til intubation, som er et af de mest kritiske trin i hele proceduren. I modsætning til flere andre publikationer12, er tracheotomi ikke udføres i vores procedure. Dette øger opvågnen og rehabilitering af dyrene postoperativt, hvilket fører til udvikling af de patofysiologiske ændringer, som er bestemt ved denne kirurgiske procedure, før dyrene gennemgår postoperative målinger. Naturligvis, hvis det er en ikke-overlevelse protokol, tracheotomi udføres under vision og er dermed lettere at udføre. Derudover er lukning af trakeotomi i en overlevelsesprotokol ikke relevant. Hvis brystkassen åbnes, er det obligatorisk at ventilere lungerne for at forhindre kollaps. Derfor er rotterne intuberet før den kirurgiske procedure. Den minimalt invasive tilgang skærer ikke ribbenene eller brystbenet og opretholder dermed brystkassens kompakthed og stabilitet. Dyrenes bedring forbedres derfor, og risikoen for spontan pneumothorax eller blødning er relativt lav.
Som førnævnt, mens intubation er af klar fordel, er det vanskeligt at udføre og kan forårsage en højere frafaldsprocent i begyndelsen af forsøgene. Dette problem kan afhjælpes med uddannelse og nogle anatomiske viden. Det er vigtigt at indsætte røret i den rette vinkel og strække dyrets krop, indtil lyset skinner gennem de vokale læber, hvorefter røret kan forsigtigt skubbes fremad. Pas på ikke at skade de vokale læber, da dette kan forårsage hævelse, efterfølgende okklusion af glottis og kvælning.
Det er også vigtigt, at LAD er ligeret korrekt. Det lille kirurgiske vindue, det hurtigt bankende hjerte og den ventilerede lunge (undgå at røre ved det så meget som muligt, da enhver kontakt kan resultere i blødning i lungerne) gør beholderen ikke klart synligt. Derfor er anatomisk viden uundværlig. Den venstre aurikel er uundværlig for at hjælpe med at standardisere både det udsatte område og for at placere ligationen omkring LAD. Sømmen skal udføres intramurally, ikke transmurally i LV, da dette kan forårsage en reduktion af LV kammer diameter og volumen, som ikke skyldes de patologiske processer. Vellykket okklusion er forbundet med cyanose af myokardieområdet i fare og forhøjelse af ST-segment på EKG. Den vigtigste begrænsning af denne procedure er den korrekte placering af suturen. For at opnå sammenlignelige resultater skal stingene være på samme niveau og skal bruge lignende mængder væv. Dette kræver et højt uddannelsesniveau, og dyrenes forskellige vægte skal tages i betragtning. Et andet punkt at overveje, er en passende fjernelse af pneumothorax før lukning af interkostale rum. Hvis dette ikke udføres præcist, vil dyrene udviser åndedrætsbesvær, da inflationen i venstre lunge vil blive hæmmet af en pneumothorax. Som nævnt kan dette afbødes ved hjælp af en sprøjte til at fjerne eventuel resterende luft fra brystkassen.
I øjeblikket, denne MI procedure er en almindeligt anvendt metode, som garanterer sammenlignelige resultater og en høj overlevelsesrate, hvis de kritiske trin udføres med høj præcision. Fremtidige projekter om forskellige behandlinger, enheder eller lægemidler i MI, HF eller hjerteremodellering kan evalueres ved at udføre denne minimalt invasive teknik.
WH-målingerne anvendes som nævnt ikke almindeligt, da vedligeholdelse og håndtering kræver specifikt udstyr og viden. For at opnå repræsentative og sammenlignelige data skal faldgruber undgås. De mest kritiske trin er montering af hjertet og skift fra D-modellen til WH-tilstand. Hvis hjertet ikke er fjernet tilstrækkeligt, kan monteringen være vanskelig, da tilstrækkelig aortavævlængde er nødvendig for at fastgøre hjertet til apparatet. Kort efter tilslutning til LD-tilstand, hjertefrekvensen kan falde på grund af vask i kold buffer, afbrydelse af sin fysiologiske stimuli i kroppen eller reperfusion med blod fra en anden art ved apparatet. I sådanne tilfælde skal der anvendes en pacemaker til både at genoprette og bevare den fysiologiske hyppighed. Dette sikrer sammenlignelige resultater hos alle dyr. Da blodvolumenet i apparatet er et multiplum af det fysiologiske volumen hos rotter, anvendes røde kreaturer i en Krebs-Henseleit-bufferbaseret suspension.
Skiftet fra LD-tilstand til WH-tilstand er synonymt med et skift fra passivt til aktivt hjertearbejde. LD-tilstanden bruges til at vænne hjertet til sit nye miljø. I WH-tilstand skal hjertet udføre sine fysiologiske udslyngningsfunktioner. Derfor er der behov for en kort tilpasningsfase til de nye omstændigheder før evalueringen ved at øge efterbelastningen.
Et andet kritisk skridt, som almindeligvis glemmes, er tilstrækkelig forberedelse og vedligeholdelse af apparatet og perfusate. Den nøjagtige mængde af hver forbindelse skal blandes, og temperaturen i systemet skal styres og justeres. Ikke desto mindre, WH er en elegant metode til at vurdere hjerte-output, slagtilfælde volumen, venstre ventrikel systolisk tryk og koronar flow samtidigt.
Denne meget reproducerbare procedure til at fremkalde MI og de repræsentative data, som wh-apparatet har erhvervet, beviser selv deres formåen. Den semi-minimalt invasive tilgang, niveauet af LAD okklusion og intubation metode lette hurtig genopretning og lav variation i infarkt størrelse. Derudover giver hjertefunktionsanalyse i isolerede arbejdshjerter værdifulde hæmodynamiske resultater.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker operationen teater team og teknikere fra Center for Biomedical Research for deres bidrag, teknisk bistand, værdifulde input og rådgivning. Projekterne er finansieret af Ludwig Boltzmann Institute, Cluster for Cardiovascular Research (REM-projektet).
ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
INTUBATION | |||
Air | |||
Oxygen (pure) | |||
Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
PREPARATION | |||
Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
Shaver | |||
SURGICAL INSTRUMENTS | |||
Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
Mensur | MTI | 29-260/25 | |
Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
Needleholder thin | Martin | ||
Round hook | BT-190 | ||
Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
Surgical scissors | |||
SUTURES | |||
PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |