Questo articolo presenta un metodo efficiente per eseguire l’ischemia miocardiale e la successiva riperfusione cronica nei ratti utilizzando un approccio minimamente invasivo. Inoltre, la funzione emodinamica ventricolare sinistra dei ratti è valutata con ecocardiografia e metodi isolati del cuore di lavoro.
L’infarto miocardico (MI) rimane il principale contributore alla morbilità e alla mortalità in tutto il mondo. Pertanto, la ricerca su questo argomento è obbligatoria. È necessaria una procedura di induzione MI facilmente e altamente riproducibile per ottenere ulteriori approfondimenti e una migliore comprensione dei cambiamenti patologici sottostanti. Questa procedura può essere utilizzata anche per valutare gli effetti o la potenza di nuovi e promettenti trattamenti (come farmaci o interventi) in MI acuta, successiva ristrutturazione e insufficienza cardiaca (HF). Dopo l’intubazione e la preparazione pre-operatoria dell’animale, è stato eseguito un protocollo anestetico con isoflurane e la procedura chirurgica è stata condotta rapidamente. Utilizzando un approccio minimamente invasivo, l’arteria discendente anteriore sinistra (LAD) è stata localizzata e occlusa da una legatura. L’occlusione può essere eseguita acutamente per la successiva reperfusione (lesione ischemia/reperfusione). In alternativa, la nave può essere costantemente migate per studiare lo sviluppo di MI cronica, rimodellamento o HF. Nonostante le insidie comuni, i tassi di abbandono sono minimi. Vari trattamenti come il condizionamento ischemico remoto possono essere esaminati per il loro potenziale cardioprotettivo pre-, peri- e post-operatorio. Il recupero post-operatorio è stato rapido in quanto l’anestesia è stata controllata con precisione e la durata dell’operazione è stata breve. L’analgesia post-operatoria è stata somministrata per tre giorni. La procedura minimamente invasiva riduce il rischio di infezione e infiammazione. Inoltre, facilita il rapido recupero. Le misurazioni del “cuore di lavoro” sono state eseguite ex vivo e hanno permesso un controllo preciso del precarico, del postcarico e del flusso. Questa procedura richiede attrezzature e formazione specifici per prestazioni adeguate. Questo manoscritto fornisce un’introduzione dettagliata passo-passo per condurre queste misurazioni.
Anche se l’incidenza è in continua diminuzione, l’infarto miocardico acuto (MI) è ancora il principale contributore alla morbilità e alla mortalità in tutto il mondo1. Ci sono restrizioni sulla valutazione dell’efficacia dei potenziali trattamenti come farmaci o procedure chirurgiche che prevengono e trattano l’AMI acuta. Prima che i loro effetti possano essere esaminati nell’uomo, questi trattamenti devono essere testati per i rischi in anticipo, compresi gli esami in vivo negli animali. Non c’è occasione migliore per studiare una patologia che in condizioni in vivo. Pertanto, l’induzione MI in ratti o topi e anche grandi modelli animali (maiali o pecore) permette lo studio di cambiamenti a breve (acuto) e a lungo termine (cronici) a causa di ischemia nelle arterie coronarie e nel miocardio circostante, nonché cambiamenti sistemici a causa della funzione cardiaca compromessa. In precedenza le dimensioni dell’infarto erano l’obiettivo principale, ma più recentemente i successivi processi di rimodellamento cardiaco in lesioni acute MI o ischemia/reperfusione, nonché in insufficienza cardiaca consecutiva (HF) sono diventati di grande interesse. Pertanto, è necessario un metodo comparabile e facilmente riproducibile per raggiungere risultati coerenti.
Mentre l’uso di crio-ablazione per ottenere MI è stato segnalato2, il nostro metodo si basa su altri studi in cui i ricercatori occludono l’arteria discendente anteriore sinistra (LAD) da una singola legatura punto. Rispetto alle procedure (emi-)sternotomia, l’approccio minimamente invasivo che sarà presentato in questo articolo, consente un recupero post-operatorio più veloce e riduce notevolmente il tempo di funzionamento. Una fase comune di altre procedure chirurgiche è il sollevamento del cuore dal torace per eseguire il punto cardiaco3. L’approccio di questo metodo rende questo passaggio non necessario. A seconda del protocollo, è possibile eseguire due diverse procedure: un’occlusione temporanea utilizzando un laccio emostatico per indurre ischemia/riperfusione in un tempo definito; o un’occlusione permanente dell’arteria fissando la legatura. Il successo dell’occlusione può essere valutato con l’elettrocardiogramma (ECG) e i cambiamenti macroscopici nel ventricolo sinistro (LV) e il suo ipraggio.
Un altro passo importante prima dell’intervento chirurgico è l’intubazione. Mentre nella maggior parte dei casi, l’intubazione viene eseguita tramite tracheotomia o tramite inserimento orale del tubo sotto la vista da un’incisione cutanea alla gola, questo protocollo descrive l’intubazione endotracheale dell’animale anestesizzato che riduce le difficoltà respiratorie o le infezioni post-operatorie4,5. Per evitare complicazioni post-operatorie, l’aria viene rimossa dal torace tramite una siringa prima di chiudere il torace.
Il secondo compito di questo articolo è la valutazione della funzione emodinamica attraverso un modello sperimentale cuore funzionante isolato, come viene utilizzato in altri progetti all’interno del nostro istituto6,7. Mentre l’ecocardiografia, la risonanza magnetica cardiaca (RM) e la quantificazione invasiva dei cicli di volume di pressione sono metodi ben noti e ampiamente utilizzati per valutare la funzione cardiaca in vivo, sono noti per avere alcune limitazioni. Gli approcci invasivi, come l’uso di cateteri per esaminare la funzione globale o parametri specifici del cuore, sono comunemente usati e rappresentano lo standard d’oro delle misurazioni cardiache. Al contrario, l’apparato cardiaco funzionante ex vivo è raramente usato a causa della sua complessità e dei suoi costi. Ci sono molti aspetti importanti, dalla miscela del perfusate all’adeguata cannulation del cuore, che sono cruciali per una valutazione di successo. L’apparato cardiaco funzionante isolato è stato descritto per la prima volta da Oskar Langendorff nel 18978 ed è stato modificato negli ultimi decenni9. Oggi, ci sono due modelli utilizzati: la modalità Langendorff (LD) e la modalità cuore di lavoro (WH). Nel nostro studio, la modalità LD viene utilizzata per acclimatare il cuore al suo nuovo ambiente (circa 15 min). In questa modalità, il cuore è cannulato attraverso l’aorta e le arterie coronarie sono perfuse anterogradamente, fornendo adeguatamente il miocardio. Nella modalità LD, il cuore non sta eseguendo alcun lavoro di volume di pressione. Al contrario, nella modalità WH, l’atrio sinistro è cannulato attraverso una vena polmonare, attraverso la quale il perfusate entra nell’atrio sinistro. Il cuore poi pompa questo perfusate fisiologicamente contro un afterload predefinito. Aumentando il postload nel tempo, la funzione cardiaca può essere continuamente misurata. Parametri come il flusso coronarico, l’uscita cardiaca (CO), il volume della corsa (SV) e il lavoro, il flusso atriale e le pressioni sistoliche e diastoliche possono essere misurati. L’impatto di vari trattamenti direttamente ed esclusivamente sul cuore può essere studiato6,10. Una recensione di Liao e Podesser9 ha presentato l’uso diffuso di questo metodo nella valutazione degli effetti farmacologici sulla funzione cardiaca e sul metabolismo, nonché nell’esplorazione di varie malattie come MI, HF, obesità e diabete.
In sintesi, questo protocollo presenta un metodo riproducibile per eseguire lesioni MI o miocardiodiale ischemia/reperfusione (MIR) in vivo. Inoltre, permette la caratterizzazione della funzione LV (dys-)su un cuore di ratto isolato dopo l’MI. Questo protocollo presenta una combinazione unica di trattamento e analisi.
Il rimodellamento avverso post-MI è considerato un meccanismo chiave nello sviluppo dell’insufficienza cardiaca. Pertanto, per garantire la continuità della ricerca cardiovascolare, le procedure sperimentali e le tecniche dovrebbero essere riproducibili. Un protocollo sperimentale comprensibile e chiaramente definito è un elemento fondamentale della riproducibilità. La riproducibilità si riferisce a risultati che possono essere ripetuti da più scienziati e sono convalidati in tutti i laboratori. Questo studio mirava a presentare un metodo semi-minimamente invasivo per indurre MI cronici o ri-perfusi e valutare la funzione emodinamica cardiaca nei ratti.
Questi risultati e ulteriori dati pubblicati mostrano l’alta potenza di questo metodo chirurgico e la sua importanza nella ricerca su MI, rimodellamento e HF. Mentre la lesione ischemia/reperfusione può essere utilizzata per comprendere i cambiamenti nel MI con successiva riperfusione, l’occlusione permanente consente un’ulteriore comprensione dei processi di rimodellamento a breve e lungo termine del miocardio. Altri approcci chirurgici causano più danni ai tessuti e gli animali mostrano maggiori rischi di sviluppare infezioni e pneumotorace, con conseguente aumento dei tassi di abbandono. Al contrario, questa procedura ha lo scopo di ridurre la mortalità con miglioramenti specifici nella configurazione e nella gestione. Inoltre, mostrano variazioni nell’espansione della cicatrice fibrotica a causa dell’occlusione LAD instabile.
Il nostro protocollo fornisce un metodo semplice per l’intubazione, che è uno dei passaggi più critici dell’intera procedura. A differenza di diverse altre pubblicazioni12, la tracheotomia non viene eseguita nella nostra procedura. Ciò migliora il risveglio e la riabilitazione degli animali post-operatori, portando allo sviluppo dei cambiamenti patofisiologici previsti da questa procedura chirurgica prima che gli animali vengano sottoposti a misurazioni post-operatorie. Ovviamente, se si tratta di un protocollo di non sopravvivenza, la tracheotomia viene eseguita sotto visione ed è quindi più facile da eseguire. Inoltre, la chiusura della tracheotomia in un protocollo di sopravvivenza non è applicabile. Se il torace è aperto, è obbligatorio ventilare il polmone per prevenire il collasso. Pertanto, i ratti vengono intubati prima della procedura chirurgica. L’approccio minimamente invasivo non taglia le costole o lo sterno mantenendo così la compattezza e la stabilità del torace. Di conseguenza, il recupero degli animali è migliorato e il rischio di pneumotorace o sanguinamento spontaneo è relativamente basso.
Come accennato in precedenza, mentre l’intubazione è di chiaro vantaggio, è difficile da eseguire e può causare un più alto tasso di abbandono all’inizio degli esperimenti. Questo problema può essere mitigato con la formazione e alcune conoscenze anatomiche. È importante inserire il tubo ad angolo retto e allungare il corpo dell’animale fino a quando la luce brilla attraverso le labbra vocali dopo le quali il tubo può essere spinto delicatamente in avanti. Fare attenzione a non danneggiare le labbra vocali in quanto questo può causare gonfiore, successiva occlusione della glottis e soffocamento.
È anche importante che il LAD sia legato correttamente. La piccola finestra chirurgica, il cuore che batte velocemente e il polmone ventilato (evitare di toccarlo il più possibile, poiché ogni contatto può provocare sanguinamento nel polmone) rendono il vaso non chiaramente visibile. Pertanto, la conoscenza anatomica è indispensabile. Il auricolo sinistro è indispensabile per aiutare a standardizzare sia l’area a rischio che per posizionare la legatura intorno al LAD. Il punto deve essere eseguito per via intramuralmente, non transmuralmente nell’LV in quanto ciò può causare una riduzione del diametro e del volume della camera LV che non è dovuta ai processi patologici. L’occlusione di successo è associata alla cianosi dell’area miocardiale a rischio e all’elevazione del segmento ST su ECG. La limitazione principale di questa procedura è il corretto posizionamento della sutura. Per ottenere risultati comparabili, i punti devono essere allo stesso livello e devono utilizzare quantità simili di tessuto. Ciò richiede un alto livello di formazione e devono essere considerati i diversi pesi degli animali. Un altro punto da considerare è l’adeguata rimozione dello pneumotorace prima della chiusura dello spazio intercostale. Se questo non viene eseguito con precisione, gli animali mostreranno difficoltà nella respirazione in quanto l’inflazione del polmone sinistro sarà ostacolata da uno pneumotorace. Come già detto, questo può essere mitigato utilizzando una siringa per rimuovere qualsiasi aria residua dal torace.
Attualmente, questa procedura MI è un metodo comunemente usato che garantisce risultati comparabili e un alto tasso di sopravvivenza se i passaggi critici vengono eseguiti con alta precisione. Progetti futuri su vari trattamenti, dispositivi o farmaci in MI, HF o rimodellamento cardiaco possono essere valutati eseguendo questa tecnica minimamente invasiva.
Le misurazioni WH, come di cui sopra, non sono comunemente utilizzate in quanto la sua manutenzione e movimentazione richiede attrezzature e conoscenze specifiche. Per acquisire dati rappresentativi e comparabili, occorre evitare insidie. I passaggi più critici sono il montaggio del cuore e il passaggio dal modello D alla modalità WH. Se il cuore non viene assornato adeguatamente, il montaggio può essere difficile in quanto è necessaria una lunghezza sufficiente del tessuto aortico per fissare il cuore all’apparato. Poco dopo il collegamento alla modalità LD, la frequenza cardiaca può diminuire a causa del lavaggio nel tampone freddo, della disconnessione dei suoi stimoli fisiologici nel corpo o della reperfusione con il sangue di un’altra specie da parte dell’apparato. In questi casi, un pacemaker deve essere applicato sia per ripristinare che preservare la frequenza fisiologica. Ciò garantisce risultati comparabili in tutti gli animali. Poiché il volume sanguigno all’interno dell’apparato è un multiplo del volume fisiologico nei ratti, vengono utilizzati globuli rossi bovini in una sospensione basata sul buffer di Krebs-Henseleit.
Il passaggio dalla modalità LD alla modalità WH è sinonimo di passaggio dal lavoro passivo a quello attivo. La modalità LD viene utilizzata per abituare il cuore al suo nuovo ambiente. Nella modalità WH, il cuore deve eseguire le sue funzioni di espulsione fisiologica. Pertanto, è necessaria una breve fase di adattamento alle nuove circostanze prima della valutazione aumentando il postcarico.
Un altro passo critico che viene comunemente dimenticato è l’adeguata preparazione e manutenzione dell’apparato e del perfusate. Il volume preciso di ogni composto deve essere miscelato e la temperatura all’interno del sistema deve essere controllata e regolata. Tuttavia, la WH è un metodo elegante per valutare l’uscita cardiaca, il volume della corsa, la pressione sistolica ventricolare sinistra e il flusso coronarico contemporaneamente.
Questa procedura altamente riproducibile per indurre mi e i dati di rappresentanza acquisiti dall’apparato WH stanno dimostrando la loro capacità. L’approccio semi-minimamente invasivo, il livello di occlusione LAD e il metodo di intubazione facilitano il recupero rapido e la bassa variabilità nelle dimensioni infarto. Inoltre, l’analisi della funzione cardiaca nei cuori di lavoro isolati fornisce preziosi risultati emodinamici.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano l’operazione del team di teatro e i tecnici del Centro per la ricerca biomedica per il loro contributo, assistenza tecnica, prezioso contributo e consulenza. I progetti sono finanziati dall’Istituto Ludwig Boltzmann, Cluster for Cardiovascular Research (progetto REM).
ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
INTUBATION | |||
Air | |||
Oxygen (pure) | |||
Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
PREPARATION | |||
Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
Shaver | |||
SURGICAL INSTRUMENTS | |||
Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
Mensur | MTI | 29-260/25 | |
Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
Needleholder thin | Martin | ||
Round hook | BT-190 | ||
Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
Surgical scissors | |||
SUTURES | |||
PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |