Denne artikkelen presenterer en effektiv metode for å utføre myokardiskemi og påfølgende kronisk reperfusjon hos rotter ved hjelp av en minimal invasiv tilnærming. I tillegg er venstre ventrikulær hemodynamisk funksjon av rotter vurdert av ekkokardiografi og isolerte arbeidende hjertemetoder.
Hjerteinfarkt (MI) er fortsatt den viktigste bidragsyteren til sykelighet og dødelighet over hele verden. Derfor er forskning på dette emnet obligatorisk. En enkel og svært reproduserbar MI induksjonsprosedyre er nødvendig for å få ytterligere innsikt og bedre forståelse av de underliggende patologiske endringene. Denne prosedyren kan også brukes til å evaluere effekten eller styrken av nye og lovende behandlinger (som legemidler eller intervensjoner) ved akutt MI, påfølgende ombygging og hjertesvikt (HF). Etter intubasjon og preoperativ forberedelse av dyret ble det utført en bedøvelsesprotokoll med isofluran, og den kirurgiske prosedyren ble utført raskt. Ved hjelp av en minimal invasiv tilnærming ble den venstre fremre synkende arterien (LAD) plassert og okkludert av en ligatur. Okklusjonen kan utføres akutt for etterfølgende reperfusjon (iskemi/reperfusjonsskade). Alternativt kan fartøyet bli bestått permanent for å undersøke utviklingen av kronisk MI, ombygging eller HF. Til tross for vanlige fallgruver, er frafallet minimale. Ulike behandlinger som ekstern iskemisk kondisjonering kan undersøkes for deres kardiobeskyttende potensial pre-, peri- og postoperativt. Den postoperative utvinningen var rask da anestesi var nøyaktig kontrollert og varigheten av operasjonen var kort. Postoperativ analgesi ble administrert i tre dager. Den minimalt invasive prosedyren reduserer risikoen for infeksjon og betennelse. Videre forenkler det rask gjenoppretting. “Arbeidshjerte”-målingene ble utført ex vivo og aktivert nøyaktig kontroll av forhåndsbelastning, etterbelastning og flyt. Denne prosedyren krever spesifikk utstyr og opplæring for tilstrekkelig ytelse. Dette manuskriptet gir en detaljert trinnvis innføring for å gjennomføre disse målingene.
Selv om forekomsten avtar kontinuerlig, er akutt hjerteinfarkt (MI) fortsatt den viktigste bidragsyteren til sykelighet og dødelighet over hele verden1. Det er restriksjoner på evaluering av effekten av potensielle behandlinger som legemidler eller kirurgiske prosedyrer som forebygger og behandler akutt MI. Før deres effekter kan undersøkes hos mennesker, må disse behandlingene testes for risiko på forhånd, inkludert in vivo undersøkelser hos dyr. Det er ingen bedre mulighet til å studere en patologi enn under in vivo forhold. Derfor tillater MI induksjon hos rotter eller mus og til og med store dyremodeller (griser eller sauer) undersøkelse av korte (akutte) og langsiktige (kroniske) endringer på grunn av iskemi i koronararteriene og det omkringliggende myokardiet, samt systemiske endringer på grunn av nedsatt hjertefunksjon. Infarkt størrelse var tidligere hovedmålet, men mer nylig påfølgende hjerte ombygging prosesser i akutt MI eller iskemi / reperfusjon skade samt i påfølgende hjertesvikt (HF) har blitt av stor interesse. Derfor er en sammenlignbar og lett reproduserbar metode nødvendig for å nå konsistente resultater.
Mens bruken av kryo-ablasjon for å få MI har blitt rapportert2,bygger vår metode på andre studier der forskere okkluderer venstre fremre synkende arterie (LAD) av en enkelt sting ligation. I forhold til (hemi-)sternotomy prosedyrer, minimalt invasiv tilnærming som vil bli presentert i denne artikkelen, tillater en raskere postoperativ utvinning og markert reduserer driftstiden. Et vanlig trinn i andre kirurgiske prosedyrer er opphevingen av hjertet fra thoraxen for å utføre hjertesømmen3. Tilnærmingen til denne metoden gjør dette trinnet unødvendig. Avhengig av protokollen kan to forskjellige prosedyrer utføres: en midlertidig okklusjon ved hjelp av en turniquet for å indusere iskemi / reperfusjon over en definert tid; eller en permanent okklusjon av arterien ved å fikse ligaturen. Suksessen til okklusjon kan evalueres med elektrokardiogram (EKG) og de makroskopiske endringene i venstre ventrikkel (LV) samt paling.
Et annet viktig skritt før operasjonen er intubasjon. Mens i de fleste tilfeller utføres intubasjon via trakeotomi eller via oral innsetting av røret under syn av et hudsnitt i halsen, beskriver denne protokollen endotrakeal intubasjon av det bedøvede dyret som reduserer pustevansker eller infeksjoner postoperativt4,5. For å unngå postoperative komplikasjoner fjernes luft fra thoraxen via en sprøyte før brystet lukkes.
Den andre oppgaven med denne artikkelen er evalueringen av hemodynamisk funksjon via en isolert arbeider hjerte eksperimentell modell, hvordan den brukes i andre prosjekter i vårt institutt6,7. Mens ekkokardiografi, hjertemagnetisk resonansavbildning (MR) og invasiv kvantifisering av trykkvolumløkker er velkjente og mye brukte metoder for å vurdere hjertefunksjon in vivo, er de kjent for å ha noen begrensninger. Invasive tilnærminger, for eksempel bruk av katetre for å undersøke den globale funksjonen eller spesifikke parametere i hjertet, brukes ofte og representerer gullstandarden for hjertemålinger. I motsetning er ex vivo arbeider hjerteapparatet sjelden brukt på grunn av sin kompleksitet og kostnad. Det er mange viktige aspekter, fra blandingen av perfusate til tilstrekkelig kannulation av hjertet, som er avgjørende for vellykket evaluering. Det isolerte arbeidshjerteapparatet ble først beskrevet av Oskar Langendorff i 18978 og har blitt modifisert i løpet av de sistetiårene 9. I dag er det to modeller som brukes: Langendorff (LD) modus og arbeidshjerte (WH) modus. I vår studie brukes LD-modusen til å akklimatisere hjertet til sitt nye miljø (ca. 15 min). I denne modusen er hjertet cannulated via aorta og koronararteriene perfunderes anterogradely, tilstrekkelig leverer myokardiet. I LD-modus utfører ikke hjertet noe trykkvolumarbeid. Derimot, i WH-modus, er venstre atrium cannulated via en lungevene, der perfusatet kommer inn i venstre atrium. Hjertet pumper deretter denne perfusate fysiologisk mot en forhåndsdefinert etterbelastning. Ved å øke etterbelastningen over tid, kan hjertefunksjonen måles kontinuerlig. Parametere som koronarstrøm, hjerteutgang (CO), slagvolum (SV) og arbeid, atriestrøm og LV systolisk og diastolisk trykk kan måles. Virkningen av ulike behandlinger direkte og utelukkende på hjertet kan undersøkes6,10. En gjennomgang av Liao og Podesser9 presenterte den utbredte bruken av denne metoden i evalueringen av farmakologiske effekter på hjertefunksjon og metabolisme, samt i utforskning av ulike sykdommer som MI, HF, fedme og diabetes.
Oppsummert presenterer denne protokollen en reproduserbar metode for å utføre MI eller myokardiskemi / reperfusjon (MIR) skade in vivo. I tillegg tillater det karakterisering av LV (dys-)funksjon på et isolert rottehjerte etter MI. Denne protokollen presenterer en unik kombinasjon av behandling og analyse.
Negativ remodeling post-MI anses å være en viktig mekanisme i utviklingen av hjertesvikt. Derfor, for å sikre kontinuiteten i kardiovaskulær forskning, bør eksperimentelle prosedyrer og teknikker være reproduserbare. En forståelig og klart definert eksperimentell protokoll er et grunnleggende element i reproduserbarhet. Reproduserbarhet refererer til resultater som kan gjentas av flere forskere og validerer på tvers av laboratorier. Denne studien hadde som mål å presentere en semi-minimal invasiv metode for å indusere kronisk eller re-perfused MI og vurdere hjerte hemodynamisk funksjon hos rotter.
Disse resultatene og videre publiserte data viser den høye styrken til denne kirurgiske metoden og dens betydning i forskning på MI, ombygging og HF. Mens iskemi/reperfusjonsskade kan brukes til å forstå endringene i MI med påfølgende reperfusjon, gir permanent okklusjon ytterligere forståelse av de kortsiktige og langsiktige ombyggingsprosessene til myokardiet. Andre kirurgiske tilnærminger forårsaker mer vevsskade og dyr viser høyere risiko for å utvikle infeksjoner og pneumothorax, noe som resulterer i høyere frafall. I motsetning er denne prosedyren rettet mot å redusere dødeligheten ved spesifikke forbedringer i oppsett og håndtering. I tillegg viser de variasjoner i fibrotisk arrutvidelse på grunn av ustabil LAD-okklusjon.
Vår protokoll gir en enkel metode for intubasjon, som er en av de mest kritiske trinnene i hele prosedyren. I motsetning til flere andre publikasjoner12, trakeotomi er ikke utført i vår prosedyre. Dette forbedrer oppvåkning og rehabilitering av dyrene postoperativt, noe som fører til utviklingen av de patofysiologiske endringene som er ment av denne kirurgiske prosedyren før dyrene gjennomgår postoperative målinger. Selvfølgelig, hvis det er en ikke-overlevelsesprotokoll, utføres trakeotomi under syn og er dermed lettere å utføre. I tillegg er lukking av trakeotomi i en overlevelsesprotokoll ikke anvendelig. Hvis thoraxen åpnes, er det obligatorisk å ventilere lungene for å forhindre kollaps. Derfor er rottene intubert før den kirurgiske prosedyren. Den minimalt invasive tilnærmingen kutter ikke ribbeina eller brystbenet og opprettholder thoraxens kompakthet og stabilitet. Følgelig er dyrenes utvinning forbedret, og risikoen for spontan pneumothorax eller blødning er relativt lav.
Som nevnt, mens intubasjonen er av klar fordel, er det vanskelig å utføre og kan føre til en høyere frafallshastighet i begynnelsen av eksperimentene. Dette problemet kan reduseres med trening og litt anatomisk kunnskap. Det er viktig å sette inn røret i riktig vinkel og strekke dyrets kropp til lyset skinner gjennom vokale lepper hvoretter røret kan skyves forsiktig fremover. Pass på å ikke skade vokalleppene, da dette kan forårsake hevelse, påfølgende okklusjon av glottis og kvelning.
Det er også viktig at LAD er ligated riktig. Det lille kirurgiske vinduet, raskt bankende hjerte og ventilert lunge (unngå å berøre det så mye som mulig som hver kontakt kan føre til blødning i lungene) gjør fartøyet ikke godt synlig. Derfor er anatomisk kunnskap uunnværlig. Venstre auricle er uunnværlig for å bidra til å standardisere både området i fare og å plassere ligation rundt LAD. Stinget må utføres intramuralt, ikke transmuralt i LV, da dette kan føre til en reduksjon av LV-kammerdiameteren og volumet som ikke skyldes de patologiske prosessene. Vellykket okklusjon er forbundet med cyanose i myokardområdet i fare og økning av ST-segment på EKG. Hovedbegrensningen av denne prosedyren er riktig posisjonering av suturen. For å oppnå sammenlignbare resultater må stingene være på samme nivå og må bruke lignende mengder vev. Dette krever et høyt nivå av trening og de forskjellige vektene av dyrene må vurderes. Et annet poeng å vurdere er tilstrekkelig fjerning av pneumothorax før lukking av interkostalrom. Hvis dette ikke er nøyaktig utført, vil dyrene vise vanskeligheter med å puste som inflasjonen av venstre lunge vil bli hindret av en pneumothorax. Som nevnt kan dette reduseres ved å bruke en sprøyte for å fjerne eventuell gjenværende luft fra thoraxen.
For øyeblikket er denne MI-prosedyren en vanlig metode som garanterer sammenlignbare resultater og en høy overlevelsesrate hvis de kritiske trinnene utføres med høy presisjon. Fremtidige prosjekter på ulike behandlinger, enheter eller legemidler i MI, HF eller hjerteremodeling kan evalueres ved å utføre denne minimalt invasive teknikken.
WH-målingene er, som nevnt, ikke ofte brukt som vedlikehold og håndtering krever spesifikt utstyr og kunnskap. For å innhente representative og sammenlignbare data må fallgruver unngås. De mest kritiske trinnene er montering av hjertet og bytte fra D-modellen til WH-modus. Hvis hjertet ikke blir tilstrekkelig utskåret, kan monteringen være vanskelig, da tilstrekkelig aortavevslengde er nødvendig for å feste hjertet til apparatet. Kort tid etter tilkobling til LD-modus, kan hjertefrekvensen reduseres på grunn av vasking i kald buffer, frakobling av fysiologiske stimuli i kroppen eller reperfusjonen med blod fra en annen art av apparatet. I slike tilfeller må en pacemaker brukes på både å gjenopprette og bevare den fysiologiske frekvensen. Dette sikrer sammenlignbare resultater hos alle dyr. Siden blodvolumet i apparatet er et multiplum av det fysiologiske volumet hos rotter, brukes storferøde blodlegemer i en Krebs-Henseleit bufferbasert suspensjon.
Overgangen fra LD-modus til WH-modus er synonymt med en overgang fra passiv til aktivt hjertearbeid. LD-modus brukes til å venne hjertet til sitt nye miljø. I WH-modus må hjertet utføre sine fysiologiske utstøtingsfunksjoner. Derfor er det nødvendig med en kort tilpasningsfase til de nye omstendighetene før evalueringen ved å øke etterbelastningen.
Et annet kritisk skritt som vanligvis glemmes er tilstrekkelig forberedelse og vedlikehold av apparatet og perfusat. Det nøyaktige volumet av hver forbindelse må blandes og temperaturen i systemet må kontrolleres og justeres. Likevel er WH en elegant metode for å vurdere hjerteutgang, slagvolum, venstre ventrikkel systolisk trykk og koronarstrøm samtidig.
Denne svært reproduserbare prosedyren for å indusere MI og de representerer dataene som er innhentet av WH-apparatet, beviser deres evne selv. Den semi-minimalt invasive tilnærmingen, nivået av LAD okklusjon og intubasjonsmetode letter rask gjenoppretting og lav variasjon i infarkt størrelse. I tillegg gir hjertefunksjonsanalyse i isolerte arbeidshjerter verdifulle hemodynamiske resultater.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker operasjonsteaterteamet og teknikerne i Senter for biomedisinsk forskning for deres bidrag, teknisk assistanse, verdifulle innspill og råd. Prosjektene er finansiert av Ludwig Boltzmann Institute, Cluster for Cardiovascular Research (REM-prosjektet).
ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
INTUBATION | |||
Air | |||
Oxygen (pure) | |||
Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
PREPARATION | |||
Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
Shaver | |||
SURGICAL INSTRUMENTS | |||
Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
Mensur | MTI | 29-260/25 | |
Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
Needleholder thin | Martin | ||
Round hook | BT-190 | ||
Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
Surgical scissors | |||
SUTURES | |||
PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |