Эта статья представляет собой эффективный метод для выполнения ишемии миокарда и последующего хронического реперфузии у крыс с использованием минимально инвазивного подхода. Кроме того, левая желудочковая гемодинамическая функция крыс оценивается эхокардиографией и изолированными методами работы сердца.
Инфаркт миокарда (МИ) остается основным фактором заболеваемости и смертности во всем мире. Поэтому исследования на эту тему являются обязательными. Легко и высоко воспроизводимой процедуры индукции MI требуется для получения дальнейшего понимания и лучшего понимания основных патологических изменений. Эта процедура также может быть использована для оценки последствий или потенции новых и перспективных методов лечения (как лекарства или вмешательства) при остром ИК, последующей реконструкции и сердечной недостаточности (HF). После интубации и предоперационных приготовлений животного был проведен анестетический протокол с изофлураном, и хирургическая процедура была проведена быстро. Используя минимально инвазивный подход, левая передняя нисходящая артерия (LAD) была расположена и окклюзия лигатурой. Окклюзия может быть выполнена остро для последующего реперфузии (ишемия / реперфузия травмы). Кроме того, судно может быть перевязывать постоянно для изучения развития хронических ИМ, реконструкции или HF. Несмотря на распространенные подводные камни, показатели отсева минимальны. Различные методы лечения, такие как удаленные ишемической кондиционирования могут быть рассмотрены для их кардиопротекторных потенциал предварительно, пери- и после оперативно. Послеоперационное восстановление было быстрым, так как анестезия была точно контролируется, а продолжительность операции была короткой. Послеоперационная анальгезия вводилась в течение трех дней. Минимально инвазивная процедура снижает риск инфекции и воспаления. Кроме того, он способствует быстрому выздоровлению. Измерения “рабочего сердца” были выполнены ex vivo и позволили точно контролировать предзагрузку, после нагрузку и поток. Эта процедура требует специального оборудования и подготовки для адекватной работы. Данная рукопись содержит подробное пошаговое представление для проведения этих измерений.
Хотя заболеваемость постоянно снижается, острый инфаркт миокарда (МИ) по-прежнему является основным фактором заболеваемости и смертности во всем мире1. Существуют ограничения на оценку эффективности потенциальных методов лечения в качестве лекарств или хирургических процедур, которые предотвращают и лечат острый ИМ. Прежде чем их эффекты могут быть рассмотрены в организме человека, эти методы лечения должны быть проверены на риски заранее, в том числе in vivo обследований у животных. Нет лучшей возможности изучать патологию, чем в условиях in vivo. Поэтому индукция МИ у крыс или мышей и даже крупных моделей животных (свиней или овец) позволяет проводить исследования краткосрочных (острых) и долгосрочных (хронических) изменений из-за ишемии в коронарных артериях и окружающей миокарде, а также системных изменений из-за нарушения сердечной функции. Infarct размер был ранее основной целью, но в последнее время последующие процессы сердечной реконструкции в острой ИК или ишемии / реперфузии травмы, а также в последовательных сердечной недостаточности (HF) стали представлять большой интерес. Поэтому для достижения согласованных результатов необходим сопоставимый и легко воспроизводимый метод.
Хотя использование крио-абляции для получения MI было сообщено2, наш метод основывается на других исследованиях, в которых исследователи окклюзии левой передней нисходящей артерии (LAD) на один перевязку стежка. По сравнению с (геми-) процедурами стернотомии, минимально инвазивный подход, который будет представлен в данной статье, позволяет быстрее послеоперационного восстановления и заметно сокращает время работы. Общим шагом других хирургических процедур является подъем из сердца из грудной клетки для выполнения стежка сердца3. Подход этого метода делает этот шаг ненужным. В зависимости от протокола можно выполнить две различные процедуры: временное окклюзию с использованием турникета для исцемии/реперфузии в течение определенного времени; или постоянное окклюзии артерии путем фиксации лигатуры. Успех окклюзии можно оценить с помощью электрокардиограммы (ЭКГ) и макроскопических изменений в левом желудочке (LV), а также его бледности.
Другим важным шагом перед операцией является интубация. В то время как в большинстве случаев, интубация выполняется через трахеотомию или через устную вставку трубки под зрением разрезом кожи в горле, этот протокол описывает эндотрахеальную интубацию обезболивающего животного, что уменьшает затрудненное дыхание или инфекции послеоперационно4,5. Чтобы избежать послеоперационных осложнений, воздух удаляется из грудной клетки через шприц перед закрытием грудной клетки.
Вторая задача этой статьи является оценка гемодинамической функции с помощью изолированной рабочей модели сердца экспериментальных, как она используется в других проектах в рамках нашего института6,7. В то время как эхокардиография, сердечная магнитно-резонансная томография (МРТ) и инвазивная количественная количественная оценка петель давления хорошо известны и широко используются методы оценки сердечной функции in vivo, они, как известно, имеют некоторые ограничения. Инвазивные подходы, такие как использование катетеров для изучения глобальной функции или конкретных параметров сердца, широко используются и представляют собой золотой стандарт сердечных измерений. В отличие от этого, ex vivo рабочий сердечный аппарат редко используется из-за его сложности и стоимости. Есть много важных аспектов, от смеси перфузии до адекватной каннуляции сердца, которые имеют решающее значение для успешной оценки. Изолированный рабочий аппарат сердца был впервые описан Оскаром Лангендорфом в 18978 и был изменен в течение последних десятилетий9. Сегодня используются две модели: режим Langendorff (LD) и режим рабочего сердца (WH). В нашем исследовании, режим LD используется для акклиматизации сердца к своей новой среде (около 15 мин). В этом режиме сердце консервируется через аорту, а коронарные артерии антероградели проливаются, адекватно снабжая миокард. В режиме LD сердце не выполняет никакой работы по объему давления. В отличие от этого, в режиме WH, левое предсердие наклоняется через легочную вену, через которую перфузиат попадает в левое предсердие. Затем сердце перекачивает это перфузию физиологически против предопределенной после загрузки. Увеличивая послезавостановку с течением времени, сердечная функция может быть непрерывно измерена. Можно измерить такие параметры, как коронарный поток, сердечный выброс (CO), объем инсульта (СВ) и работа, предсердий и систолическое и диастолическое давление. Влияние различных методов лечения непосредственно и исключительно на сердце может быть исследовано6,,10. Обзор Ляо и Podesser9 представил широкое использование этого метода в оценке фармакологического воздействия на сердечную функцию и метаболизм, а также в исследовании различных заболеваний, таких как И.В., HF, ожирение и диабет.
Таким образом, этот протокол представляет воспроизводимый метод для выполнения ИМИ или ишемии миокарда / реперфузии (MIR) травмы in vivo. Кроме того, он позволяет характеристику LV (дис-)функции на изолированном сердце крысы после MI. Этот протокол представляет собой уникальное сочетание лечения и анализа.
Неблагоприятная реконструкция пост-МИ считается ключевым механизмом развития сердечной недостаточности. Поэтому для обеспечения непрерывности сердечно-сосудистых исследований должны быть воспроизведены экспериментальные процедуры и методы. Понятный и четко определенный экспериментальный протокол является основополагающим элементом воспроизводимости. Воспроизводимость относится к результатам, которые могут быть повторены несколькими учеными и проверяются в лабораториях. Это исследование было направлено на представление полу-минимально инвазивный метод, чтобы вызвать хронические или повторно проникнуты ИК и оценить сердечную гемодинамическую функцию у крыс.
Эти результаты и дальнейшие опубликованные данные показывают высокую потенцию этого хирургического метода и его важность в исследованиях по ИМ, реконструкции и HF. В то время как ишемия / реперфузия травмы могут быть использованы для понимания изменений в ИК с последующим реперфузии, постоянное окклюзия позволяет дальнейшее понимание краткосрочных и долгосрочных процессов реконструкции миокарда. Другие хирургические подходы вызывают больше повреждений тканей и животные показывают более высокий риск развития инфекций и пневмоторакса, что приводит к более высоким показателям отсева. В отличие от этого, эта процедура направлена на снижение смертности за счет конкретных улучшений в установке и обработке. Кроме того, они показывают различия в фиброзных шрамов расширения из-за нестабильной окклюзии LAD.
Наш протокол обеспечивает простой метод интубации, который является одним из наиболее важных шагов всей процедуры. В отличие от нескольких других публикаций12, трахеотомия не выполняется в нашей процедуре. Это усиливает пробуждение и реабилитацию животных после операции, что приводит к развитию патофизиологических изменений, которые предназначены этой хирургической процедурой до того, как животные проходят послеоперационные измерения. Очевидно, что если это не выживший протокол, трахеотомия выполняется под зрением и, таким образом, легче выполнять. Кроме того, закрытие трахеотомии в протоколе выживания не применяется. Если грудная клетка открыта, необходимо проветрить легкое, чтобы предотвратить коллапс. Таким образом, крысы интубируются до хирургической процедуры. Минимально инвазивный подход не режет ребра или грудину, сохраняя тем самым компактность и стабильность грудной клетки. Следовательно, восстановление животных улучшается, и риск спонтанного пневмоторакса или кровотечения является относительно низким.
Как уже упоминалось выше, в то время как интубация имеет явное преимущество, это трудно выполнить и может привести к более высокой скорости отсева в начале экспериментов. Эта проблема может быть смягчена с обучением и некоторые анатомические знания. Важно вставить трубку под прямым углом и растянуть тело животного, пока свет не просвечивает через вокальные губы, после чего трубку можно мягко отодвинуть вперед. Позаботьтесь, чтобы не повредить вокальные губы, как это может вызвать отек, последующее окклюзии glottis и удушья.
Важно также, чтобы LAD был правильно передетан. Небольшое хирургическое окно, быстро бьющееся сердце и проветриваемое легкое (избегайте прикосновения к нему как можно больше, так как каждый контакт может привести к кровотечению в легких) сделать сосуд не ясно видимым. Поэтому анатомические знания необходимы. Левая ушной раковина необходима для стандартизации как зоны риска, так и для размещения перевязки вокруг LAD. Стежок должен быть выполнен внутримурно, а не трансмурально в LV, так как это может привести к уменьшению диаметра камеры LV и объема, который не из-за патологических процессов. Успешная окклюзия связана с цианозом области миокарда с риском и возвышением ST-сегмента на ЭКГ. Основным ограничением этой процедуры является правильное расположение шва. Для достижения сопоставимых результатов, стежки должны быть на том же уровне и должны использовать аналогичные количества ткани. Это требует высокого уровня подготовки и различные веса животных должны быть рассмотрены. Еще один момент, который следует рассмотреть, – адекватное удаление пневмоторакса до закрытия межреберного пространства. Если это точно не выполняется, животные будут проявлять трудности в дыхании, как инфляция левого легкого будет препятствовать пневмоторакс. Как уже упоминалось выше, это может быть смягчено с помощью шприца для удаления остаточного воздуха из грудной клетки.
В настоящее время эта процедура MI является широко используемым методом, который гарантирует сопоставимые результаты и высокую выживаемость, если критические шаги выполняются с высокой точностью. Будущие проекты по различным методам лечения, устройств или лекарств в ИВ, HF или кардиореконструкторинге могут быть оценены, выполняя этот минимально инвазивный метод.
Измерения WH, как уже упоминалось выше, обычно не используются, так как их техническое обслуживание и обработка требуют специального оборудования и знаний. Для получения репрезентативных и сопоставимых данных следует избегать ловушек. Наиболее важными шагами являются монтаж сердца и переключение с модели D на режим WH. Если сердце не вырезано должным образом, монтаж может быть трудно, как достаточная длина аорты ткани требуется, чтобы исправить сердце к аппарату. Вскоре после подключения к режиму LD частота сердца может уменьшиться из-за мытья в холодном буфере, отключения его физиологических стимулов в организме или реперфузии с кровью от другого вида аппаратом. В таких случаях кардиостимулятор должен применяться как для восстановления, так и для сохранения физиологической частоты. Это обеспечивает сопоставимые результаты у всех животных. Поскольку объем крови в аппарате является кратным физиологического объема у крыс, используются красные кровяные тельца крупного рогатого скота в буферной подвеске на основе Кребса-Хенселейта.
Переход из режима LD в режим WH является синонимом перехода от пассивной к активной работе сердца. Режим LD используется для приучания сердца к новой среде. В режиме WH сердце должно выполнять свои физиологические функции выброса. Таким образом, перед оценкой требуется короткий этап адаптации к новым обстоятельствам путем увеличения послезарядки.
Другим важным шагом, который обычно забывают, является адекватная подготовка и обслуживание аппарата и перфузии. Точный объем каждого соединения должен быть смешан, а температура в системе должна контролироваться и корректироваться. Тем не менее, WH является элегантным методом для оценки сердечного выброса, объема инсульта, левого желудочкого систолического давления и коронарного потока одновременно.
Эта высоковоспроизводимая процедура, чтобы побудить MI и представляющие данные, полученные аппаратом WH, сами доказывают их способность. Полумамально инвазивный подход, уровень окклюзии и интубации LAD способствуют быстрому восстановлению и низкой изменчивости в размерах инфаркта. Кроме того, анализ сердечной функции в изолированных рабочих сердцах дает ценные гемодинамические результаты.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят оперативную команду театра и техников Центра биомедицинских исследований за их вклад, техническую помощь, ценный вклад и советы. Проекты финансируются Институтом Людвига Больцмана, Кластером сердечно-сосудистых исследований (проект REM).
ANAESTHESIA & ANALGESIA | |||
Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
Ketamine | Dr. E. Gräub AG | 100 mg/kg of bodyweight | |
Piritramide | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampulles with 30 ml of Glucose 5% in 250ml water | |
Xylazine | Bayer | 4 mg/kg of bodyweight | |
INTUBATION | |||
Air | |||
Oxygen (pure) | |||
Ventilation machine | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
14-gauge tube | Dickinson and Company | BD Venflon | |
PREPARATION | |||
Anti-septic povidine iodine solution | Mundipharma | Betaisodona solution | |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | Oleovital with Vitamin A + Dexpanthenol | |
Shaver | |||
SURGICAL INSTRUMENTS | |||
Anatomical forceps | Martin | 12-272-15 | |
Anatomical forceps small | Martin | 24-386-16 | |
Anatomical forceps thin | Odelga | RU4042-15 | |
Cautery Fine Tip | High Temp | bvi-Accu-Temp | |
Cup (small, for liquids) | Martin | 56-231/11 | |
Mensur | MTI | 29-260/25 | |
Mosquito clamps | MTI | 05-055/12 | |
Needleholder short | Martin | 20-658-14 | |
Needleholder thin | Martin | ||
Round hook | BT-190 | ||
Scalpell size 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
Scissors for tissue preparation | Aesculap | BC259R | |
Sharp scissors | MTI | 01-010/10 | |
Small retractor | Alm | AM.416.10 | |
Surcigal forceps | Martin | 12-321-13 | |
Surgical scissors | |||
SUTURES | |||
PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | single monofil suture |
Vicryl 6-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | V301G | polyethylene suture |
COMPUTER PROGRAMS & APPARATUS | |||
Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Labchart Software |
PowerLab System | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | flow probe | |
Isolated heart apparatus | Hugo Sachs Electronics | ||
Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Labchart Software |
Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | high-fidelity MicroTip catheter |
Needle electrodes via Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domes | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
PowerLab System | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |