Denne protokol beskriver den robuste generation af makrofager fra humane inducerede pluripotente stamceller, og metoder til deres efterfølgende karakterisering. Celleoverflademarkørekspression, genekspression og funktionelle analyser anvendes til at vurdere fænotypen og funktionen af disse iPSC-afledte makrofager.
Makrofager er til stede i de fleste hvirveldyr væv og omfatter vidt spredte og heterogene cellepopulationer med forskellige funktioner. De er centrale aktører i sundhed og sygdom, der fungerer som fagocytter under immunforsvar og mægle trofisk, vedligeholdelse og reparation funktioner. Selv om det har været muligt at studere nogle af de molekylære processer, der er involveret i human makrofag funktion, har det vist sig vanskeligt at anvende genteknologiske teknikker til primære menneskelige makrofager. Dette har i høj grad hæmmet vores evne til at afhøre de komplekse genetiske veje, der er involveret i makrofagbiologi, og til at generere modeller for specifikke sygdomstilstande. En off-the-shelf kilde til menneskelige makrofager, der er modtagelige for det store arsenal af genetiske manipulation teknikker ville derfor give et værdifuldt redskab på dette område. Vi præsenterer en optimeret protokol, der giver mulighed for generering af makrofager fra humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) in vitro. Disse iPSC-afledte makrofager (iPSC-DMs) udtrykker humane makrofagcelleoverflademarkører, herunder CD45, 25F9, CD163 og CD169, og vores funktionelle analyse af levende celler viser, at de udviser robust fagocytisk aktivitet. Kulturformes iPSC-DMs kan aktiveres til forskellige makrofagtilstande, der viser ændret genekspression og fagocytisk aktivitet ved tilsætning af LPS og IFNg, IL4 eller IL10. Således, dette system giver en platform til at generere menneskelige makrofager regnskabsmæssige genetiske ændringer, model specifikke menneskelige sygdomme og en kilde til celler til narkotika screening eller celle terapi til behandling af disse sygdomme.
Embryonale stamceller (ESCs) og inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) repræsenterer en selvfornyende cellekilde, der kan differentieres til at producere celler af alle tre kimlagsslægter. Teknologier, der giver mulighed for genetisk manipulation af humane pluripotente stamceller, såsom Zink Finger Nuclease, TALENS, og CRISPR-Cas9, har revolutioneret medicinsk forskning1,2,,3,4. Genetisk manipulation af menneskelige kpc’er er en særlig attraktiv strategi , når den primære celle af interesse er vanskelig at udvide og/eller opretholde in vitro eller er vanskelig at manipulere genetisk, som det er tilfældet for makrofager5,6,7,8,9. Da menneskelige iPSCs kan udledes af enhver somatiske celle, omgår de de etiske begrænsninger, der er forbundet med ePC’er, og giver en strategi for levering af personlig medicin. Dette omfatter patientspecifik sygdomsmodellering, lægemiddeltest og autolog celleterapi med nedsat risiko for immunafstødning og infektion6,8,10,11.
Protokoller, der beskriver generering af makrofager fra iPSC’er, består af en tretrinsproces, der omfatter: 1) Generering af embryolede kroppe; 2) Fremkomsten af hæmatopoietiske celler i suspension; 3) Terminal makrofag modning.
Dannelsen af tredimensionelle aggregater, kendt som embryoide organer (EBs) initierer differentiering af iPSCs. Knogle morfogenetisk protein (BMP4), stamcellefaktor (SCF), og vaskulære endotel vækstfaktor (VEGF) tilsættes for at drive mesoderm specifikation og støtte nye hæmatopoietiske celler7,8,9,11,12. De differentierende celler i EBs også indlede aktivering af endogene signalveje såsom Wnt og Activin. Nogle differentieringsprotokoller går ikke gennem den fase af EB-dannelse. I disse tilfælde føjes Wnt- og Activin-signalregulatorer, såsom rekombinant human Activin A og/eller Chiron, til differentiering af iPSC’er i et monolagsformat13,14,15. Her fokuserer vi på en protokol, der bruger EB-formation. For det andet trin i differentiering, er EBs belagt på en klæbende overflade. Disse vedlagte celler er derefter udsat for cytokiner, der fremmer fremkomsten af suspension celler, der omfatter hæmatopoietiske og myeloid progenitors. I disse in vitro kultur betingelser, interleukin-3 (IL3) sandsynligvis understøtter hæmatopoietisk stilk-progenitor celledannelse og spredning16,17, samt myeloid prækursorer spredning og differentiering18. Makrofagkolonistimulerende faktor (CSF1) understøtter produktionen af myeloidceller og deres differentiering til makrofager19,20. I den tredje fase af differentiering, er disse suspension celler dyrkes i overværelse af CSF1 til støtte terminal makrofag modning.
Differentieringen af menneskelige iPSCs i makrofager in vitro efterligner den tidlige bølge af makrofag produktion under udviklingen. Vævs-hjemmehørende makrofager er etableret under embryogenese og har en særskilt udviklingsmæssige afstamning fra voksne monocytter. Flere undersøgelser har vist, at iPSC-DMs har en gensignatur, der er mere sammenlignelig med føtale leverbaserede makrofager end blodafledte monocytter, hvilket tyder på, at iPSC-DMs er mere beslægtet med vævshjemmehørende makrofager. iPSC-DMs udtrykker højere niveauer af gener, der koder for udskillelsen af proteiner, der er involveret i vævsombygning og angiogenese, og udtrykker lavere niveauer af gener, der koder for proinflammatoriske cytokinsekredions- og antigenpræsentationsaktiviteter21,22. Desuden har iPSC-DMs et tilsvarende transskriptionsfaktorkrav til kravet om vævsresidente makrofager23,24. Ved hjælp af knockout iPSC-cellelinjer, der er mangelfulde i transskriptionsfaktorerne RUNX1, SPI1 (PU.1) og MYB, viste Buchrieser et al. at genereringen af iPSC-DMs er SPI1 og RUNX1 afhængig, men MYB uafhængig. Dette indikerer, at de er transskriptionalt ligner æggeblomme-sac afledte makrofager, der genereres under den første bølge af hæmatopoiese under udvikling23. Derfor er det almindeligt accepteret, at iPSC-DMs repræsenterer en mere passende cellemodel til at studere vævshjemmehørende makrofager såsom mikroglia14,25 og Kupffer celler11, og en mere ønskelig kilde til celler, der potentielt kunne anvendes i behandlinger til reparation af væv. For eksempel har det vist sig, at makrofager produceret in vitro fra mus ESCs var effektive i forbedring af fibrose i en CCl4-induceret leverskade model in vivo11. Endvidere var disse ESC-afledte makrofager mere effektive end knoglemarvsafledte makrofager ved repopulating Kupffer cellerum forarmet af makrofager ved hjælp af liposomal clodronat11 i mus.
Her beskriver vi protokoller for serum- og feederfri protokoller til vedligeholdelse, frysning og optøning af humane iPSC’er og for differentieringen af disse iPSCs til funktionelle makrofager. Denne protokol er meget lig den, der er beskrevet af Van Wilgenburg et al.12, med mindre ændringer, herunder: 1) iPSC-vedligeholdelse medier; 2) ROCK-hæmmer anvendes ikke i EB-dannelsesfasen. 3) En mekanisk tilgang snarere end en enzymatisk tilgang anvendes til at generere ensartede EBs fra iPSC kolonier; 4) Metoden til EB høst og plating ned er anderledes; 5) Suspension celler høstes 2x om ugen, snarere end ugentligt; og 6) Høstede suspensionceller dyrkes under CSF1 for makrofagmodning i 9 dage i stedet for 7 dage. Vi beskriver også protokoller, der bruges til at karakterisere iPSC-afledt makrofagfænotype og funktion, herunder analyser for genekspression (qRT-PCR), celleoverflademarkørudtryk (flowcytometri) og funktionelle analyser til vurdering af fagocytose og polarisering.
Protokollen for generering af iPSC-DM’er, der er beskrevet her, er robust og giver mulighed for produktion af et stort antal homogene celler fra et relativt lille antal iPSC’er. Efter den indledende differentiering af ca. 1 x 106 iPSC’er kan de efterfølgende kulturer høstes hver 4.7 Disse in vitro-genererede humane makrofager er morfologisk ligner primære menneskelige makrofager, udtrykke de vigtigste makrofag celle overflade markører, og udstille fagocytisk aktivitet. Protokollen for makrofagdifferentiering er reproducerbar og kan anvendes på andre hiPSC- og hESC-cellelinjer, men den præcise timing af den første høst af makrofagprækursorerne og det absolutte antal celler, der kan genereres, varierer mellem iPSC-linjer.
Det er blevet påvist, at makrofager kan genereres fra iPSCs, der er blevet genetisk manipuleret. F.eks. blev der indsat en transgenkassette bestående af den fluorescerende reporter ZsGreen under den konstituerende CAG-promotors kontrol i AAVS1 locus på SFCi55 iPSC-linjen, og det blev efterfølgende påvist, at denne iPSC-linje kunne differentieres til ZsGreen-udtrykkende makrofager8. Disse fluorescerende makrofager kan anvendes i fremtiden til at spore migration og stabilitet af terapeutiske makrofager i sygdomsmodeller. I en anden undersøgelse, makrofager blev genereret fra en iPSC linje, der var blevet genetisk manipuleret til at udtrykke en tamoxifen-induceret transskription faktor, KLF1. Aktivering af KLF1 i iPSC-afledte makrofager resulterede i produktion af makrofager med en fænotype, der kan sammenlignes med makrofager på erythroidøen9. Potentielt kan denne strategi anvendes til genetisk program iPSC-afledte makrofager i fænotyper forbundet med andre vævsspecifikke makrofagpopulationer såsom Kupffer-celler i leveren eller Langerhans-celler i huden. Dette ville være muligt, når de vigtigste transskriptionsfaktorer, der definerer disse celletyper, er identificeret.
Med hensyn til protokollen er det meget vigtigt at bemærke, at forudsætningen for startpopulationen af iPSC’er er afgørende for en vellykket differentiering. Menneskelige iPSC kulturer kan overskrides med karyotypically unormale subpopulationer over flere passager, så robust kurering af iPSC bestande og store batch master bestande udsat for genom kvalitetskontrol anbefales. I vores hænder kan de vedligeholdelsesprotokoller, der er beskrevet her, opretholde karyotypically normale iPSCs i op til 2 måneder i kontinuerlig kultur, men dette kan variere for forskellige cellelinjer og i forskellige laboratorier. Hvis der opstår problemer, er det tilrådeligt at bruge et nyt hætteglas med udifferentierede iPSC’er til hvert differentieringseksperiment. Desuden bør startkulturen for udifferentierede iPSC’er ikke være mere end 80 % flydende. På EB plating fase, bør kun 10-15 EBs være belagt pr brønd af en 6 godt væv kultur plade, og det er afgørende, at disse EBs er spredt ud jævnt over brønden. Et højere antal EBs og / eller sammenklumpning af EBs i midten af brønden havde en negativ effekt på antallet af makrofager genereret. Der bør udvises forsigtighed ved genopfyldning af medier og høst af monocytelignende sfrajedringsceller fra EB-kulturerne for at undgå at forstyrre eB’ernes vedhæftning til overfladen af de belagte dyrkningsplader. Antallet af hæmatopoietiske suspensionsceller, der produceres, stiger gradvist med hver høst med optimal produktion mellem dag 40-72 af differentiering (figur 2). Produktionen falder gradvist efter dag 68, og pladerne har tendens til at udtømme efter 2,5 måneder, selv om den præcise timing kan variere afhængigt af iPSC-linjen.
En begrænsning af vores protokol er, at det ikke har været muligt at kryopræparere de hæmatopoietiske suspensionsceller, der blev genereret i slutningen af fase 2. Protokoller, der er afhængige af den eksogene aktivering af WNT rapport om en 40% inddrivelse sats efter kryopræservering, men disse protokoller rapporterer kun én celle høst, så det absolutte antal makrofager genereret er lav30. Den protokol, der er beskrevet her, og som fremkalder endogen signalering via dannelsen af EB’er, kan høstes hver anden uge, hvilket giver et langt højere samlet makrofagudbytte.
Sammenfattende præsenterer vi en detaljeret protokol til produktion af funktionelle iPSC-afledte makrofager. Opsætning af in vitro-eksperimenter med iPSC-afledte makrofager for at studere makrofagbiologi i sundhed og sygdom har mange fordele i forhold til forsøg med monocyt-afledte makrofager (MDMs). Disse fordele omfatter den lette adgang til materialet (f.eks. kræves der ingen donorer), der kan produceres meget store mængder makrofager, og det er muligt og relativt ligetil at producere genetisk modificerede makrofager. Desuden kan iPSC-afledte makrofager være bedre ressource for studiet af vævs-hjemmehørende makrofag biologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Fiona Rossi og Claire Cryer for hjælp med flow cytometri, Eoghan O’Duibhir og Bertrand Vernay med mikroskopi. Dette arbejde blev finansieret af CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) og Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD studentship (A.M.), MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. og J.W.P. blev støttet af Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) og COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350010 | |
Abtibody CD64-APC -CY7 | Biolegend | 305026 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody 25F9-EFLUOR 660 | Ebioscience | 15599866 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CCR2-PE-Cy7 | Biolegend | 357212 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CCR5 PE | Biolegend | 313707 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CCR8 PE | Biolegend | 360603 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD11b-PE | Biolegend | 301305 | Dilution factor: 1:50 |
Antibody CD14-APC | Ebioscience | 10669167 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CD163-PE-CY7 | BIolegend | 333614 | Dilution factor: 1:25 |
Antibody CD169-APC | Biolegend | 346007 | Dilution factor: 1:25 |
Antibody CD206-PE | Biolegend | 321106 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD209-PE-CY7 | Biolegend | 3310114 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD274-PE-CY7 | Biolegend | 329718 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD43-PE | Ebioscience | 10854419 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD45-APC | Ebioscience | 15577936 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CD86-APC | Biolegend | 305412 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD93-PE | Ebioscience | 10804637 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CX3CR1-PE | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody HLA-DR-BV650 | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
Antiboy CD115-PE | Biolegend | 347308 | Dilution factor: 1:40 |
Cell Dissociation Buffer, enzyme free | Thermofisher | 13151014 | |
Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS | Gibco | 13151014 | |
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well | PerkinElmer | 6055302 | |
CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain | Thermofisher | C10046 | Cryopreservation media |
Cryostor CS10 | Sigma | C2874 | |
CTS CELLstart Substrate | Invitrogen | A1014201 | Stem cell substrate |
DAPI | Merck | D9542-1MG | Final concentration 1 μg/mL |
DPBS, calcium, magnesium (500ml) | Thermofisher | 14040091 | |
FcR Blocking Reagent, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHG0021 | |
GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
Human Recombinant IFNY | Thermofisher | 14-8319-80 | |
Human Serum Albuminum | Irvine Scientific | 9988 | |
Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli | Sigma | L2630 | |
NucBlue (Hoechst33342) | Thermofisher | R37605 | |
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis | Thermofisher | P35365 | |
Porcine Skin Gelatin | Sigma | G9136 | |
Recombinant Human BMP4 Protein | R&D | 314-BP-010 | |
Recombinant Human IL10 | Preprotech | 200-10 | |
Recombinant Human IL3 | Preprotech | 200-03-10 | |
Recombinant Human IL4 | Preprotech | 200-04 | |
Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100ug | Biolegend | 574806 | |
Recombinant Human VEGF Protein | R&D | 293-VE-010 | |
Rock Inhibitor Y-27632 | Merck | SCM075 | |
SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHC2111 | |
StemPro hESC SFM | Thermofisher | A1000701 | |
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | Thermofisher | 23181010 | |
Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface | Greiner | 657970 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
X-Vivo 15 500 mL bottle | Lonza | BE02-060F |