Summary
이 프로토콜은 인간이 유도한 다능성 줄기 세포로부터의 대식세포의 강력한 생성 및 이들의 후속 특성화 방법을 설명합니다. 세포 표면 마커 발현, 유전자 발현 및 기능성 세포는 이들 iPSC 유래 대식세포의 표현형 및 기능을 평가하기 위해 사용된다.
Abstract
대식세포는 대부분의 척추동물 조직에 존재하며, 서로 다른 기능을 가진 널리 분산되고 이기종세포 집단을 포함한다. 그들은 건강과 질병에 있는 중요한 선수입니다, 면역 방어 도중 식세포로 작동하고 영양, 유지 보수 및 수리 기능을 중재하는 동안. 인간의 대식세포 기능에 관여하는 분자 과정의 일부를 연구하는 것이 가능했지만, 1차 인간 대식세포에 유전 공학 기술을 적용하는 것이 어렵다는 것이 입증되었습니다. 이것은 대식세포 생물학에서 관련시킨 복잡한 유전 통로를 심문하고 특정 질병 국가를 위한 모형을 생성하는 우리의 기능을 현저하게 방해했습니다. 따라서, 유전 조작 기술의 광대 한 무기고에 순종하는 인간의 대식세포의 기성 공급원은, 따라서, 이 분야에서 귀중한 공구를 제공할 것입니다. 우리는 시험관내에서 인간이 유도한 다능성 줄기 세포(iPSCs)로부터 대식세포의 생성을 허용하는 최적화된 프로토콜을 제시한다. 이러한 iPSC 유래 대식세포(iPSC-DM)는 CD45, 25F9, CD163 및 CD169를 포함한 인간 대식세포 표면 마커를 발현하고, 당사의 라이브 셀 이미징 기능 분석사는 강력한 식세포 활성을 나타낸다는 것을 입증한다. 배양된 iPSC-DM은 LPS 및 IFNg, IL4, 또는 IL10의 첨가에 의해 변경된 유전자 발현 및 식세포 활성을 표시하는 상이한 대식세포 상태로 활성화될 수 있다. 따라서, 이 시스템은 이러한 질병을 치료하기 위해 약물 스크리닝 또는 세포 치료를 위한 특정 인간 질환 및 세포의 공급원을 모델링하는 유전적 변조를 운반하는 인간 대식세포를 생성하는 플랫폼을 제공한다.
Introduction
배아 줄기 세포(ESCs) 및 유도만능 줄기세포(iPSCs)는 3개의 생식층 혈통 의 세포를 생산하기 위해 분화될 수 있는 자가 갱신 세포 공급원을 나타낸다. 아연 핑거 뉴클레아제, TALENS 및 CRISPR-Cas9와 같은 인간 다능성 줄기 세포 (PSC)의 유전자 조작을 허용하는 기술은 의학 연구1,,2,,3,,4에혁명을 부리고 있습니다. 인간 PSCs의 유전적 조작은 관심의 1차 세포가 시험관 내에서 확장 및/또는 유지되기 어렵거나, 또는 대식세포,, 5,6,,,7,8,9와같이 유전자 조작이 어려운 경우에 특히 매력적인 전략이다., 인간 iPSCs는 어떤 체세포든지에서 파생될 수 있기 때문에, ESCs와 관련되었던 윤리적한계를 우회하고, 개인화한 약을 전달하기 위한 전략을 제공합니다. 이는 면역 거부 및 감염의 위험이 감소된 환자 별 질병 모델링, 약물 검사 및 자가 세포요법을 포함하며 6,,8,,10,,11을포함한다.
iPSCs에서 대식세포의 생성을 설명하는 프로토콜은 다음을 포함하는 3단계 과정으로 구성됩니다: 1) 배아 체의 생성; 2) 현탁액에서 조혈 세포의 출현; 3) 말단 대식세포 성숙.
배아 체 (EBs)로 알려진 3 차원 응집체의 형성은 iPSCs의 분화를 시작합니다. 골형태유전학적 단백질(BMP4), 줄기세포 인자(SCF), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 첨가되어 중피균 을 구동하고 신흥 조혈세포를 지원한다7,,8,,99,11,,12. EBs 내의 분화 세포는 또한 Wnt와 Activin와 같은 내인성 신호 통로의 활성화를 시작합니다. 일부 분화 프로토콜은 EB 형성의 단계를 거치지 않습니다. 이러한 경우, Wnt 및 Activin 신호 조절기, 예컨대 재조합 인간 액티빈 A 및/또는 Chiron은 단층 포맷13,,14,,15로분화iPSCs에 첨가된다. 여기서는 EB 형성을 사용하는 프로토콜에 중점을 둡니다. 분화의 두 번째 단계를 위해, EB는 부착 표면에 도금된다. 이 연결된 세포는 그 때 조혈 및 골수성 전구를 포함하는 현탁액 세포의 출현을 승진시키는 사이토카인에 드러난다. 이러한 시험관내 배양 조건에서, 인터류키친-3(IL3)은 조혈줄기-선조 세포 형성 및증식을 지원하며, 16,,17,골수성 전구체 증식 및 분화(18)를 지원한다.18 대식세포 콜로니 자극 인자(CSF1)는 골수성 세포의 생성을 지원하고 대식세포에 대한 이들의 분화를19,,20. 분화의 제 3 단계 동안, 이들 현탁액 세포는 말단 대식세포 성숙을 지원하기 위해 CSF1의 존재에서 배양된다.
인간 iPSCs를 시험관 내 대식세포로 의분화하는 것은 발달 도중 대식세포 생산의 초기 파를 모방합니다. 조직 상주 대식세포는 배아 발생 중에 확립되고 성인 단핵구로부터 뚜렷한 발달 혈통을 갖는다. 몇몇 연구 결과는 iPSC-DM이 혈액 유래 단핵구 보다는 태아 간 파생된 대식세포에 더 비교되는 유전자 서명이 있다는 것을 보여주었습니다, iPSC-DM가 조직 상주 대식세포에 더 가깝다는 것을 건의합니다. iPSC-DM은 조직 리모델링 및 혈관신생에 관여하는 단백질의 분비를 위해 인코딩하는 유전자의 상부를 발현하고 염증성 사이토카인 분비 및 항원 프리젠테이션 활동을 위해 인코딩하는 유전자의 낮은 수준을발현한다 21,,22. 또한, iPSC-DM은 조직 상주대식세포(23,,24)와유사한 전사 인자 요건을 갖는다. 전사 인자 RUNX1, SPI1(PU.1) 및 MYB에서 결핍된 녹아웃 iPSC 세포주를 사용하여, Buchrieser 등은 iPSC-DMs의 생성이 SPI1 및 RUNX1 의존적이지만 MYB 독립적인 것으로 나타났다. 이는 개발23동안 조혈의 제1파 동안 생성되는 노른자-낭 유래 대식세포와 전사적으로 유사하다는 것을 나타낸다. 따라서, iPSC-DM이 마이크로글리아14,,25 및 Kupffer 세포11과같은 조직 상주 대식세포를 연구하기 위해 보다 적합한 세포 모델을 나타내고, 잠재적으로 조직을 복구하는 치료법에 사용될 수 있는 세포의 보다 바람직한 공급원을 나타낸다는 것이 널리 받아들여진다. 예를 들어, 마우스 ESC로부터 시험관내에서 생성된 대식세포는 생체내 CCl4 유도 간 손상 모델에서 섬유증을 개량하는 데 효과적이었다는 것을 보여주었다11. 더욱이, 이들 ESC 유래 대식세포는 마우스에서 리포좀 클로드로네이트11을 사용하여 대식세포의 고갈된 쿠퍼 세포 구획을 다시 채울 때 골수 유래 대식세포보다 더 효율적이다.
여기서, 우리는 인간 iPSCs의 유지 보수, 동결 및 해동을 위한 혈청 및 피더 없는 프로토콜을 설명하고, 이러한 iPSCs를 기능적 대식세포로 분화한다. 이 프로토콜은 Van Wilgenburg et al.12에의해 설명된 것과 매우 유사하며, 1) iPSC 유지 보수 미디어를 포함한 사소한 변경과 함께; 2) ROCK 억제제는 EB 형성 단계에서 사용되지 않습니다; 3) 효소 접근보다는 기계적 접근은 iPSC 식민지에서 균일 한 EB를 생성하는 데 사용됩니다; 4) EB 수확 및 도금 에 대한 방법은 다르다; 5) 현탁액 세포는 매주가 아닌 일주일에 2 회 수확됩니다. 및 6) 수확된 현탁액 세포는 7일이 아닌 9일 동안 대식세포 성숙을 위해 CSF1 하에서 배양된다. 우리는 또한 유전자 발현 (qRT-PCR), 세포 표면 마커 발현 (유량 세포 분석) 및 식세포 증 및 편광을 평가하기 위한 기능 분석분석을 포함하여 iPSC 유래 대식세포 표현형 및 기능을 특성화하는 데 사용되는 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약 및 장비는 재료 표에나열되어 있습니다. 배지는 세포 배양을 위해 37°C에 있어야 한다. 분화 프로토콜에 사용되는 미디어 및 시약은 멸균되어야 합니다.
1. 인간 iPSC 라인 해동 및 유지 보수
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세포 유지 배지, 성장 인자 및 기타 시약을 준비한다.
- hESC-SFM 프리 미디어(hESC-SFM; 재료 표참조)를 hESC 보충제로 DULbecco의 수정된 이글 미디엄 F12(DMEM/F12) 보충, 1.8% w/v 소 세럼 알부민(BSA), 0.1 mM 2-메르카포에탄올을 보충합니다. (
- 인간 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 스톡 용액(10 μg/mL)을 멸균 된 0.1 % 인간 혈청 알부민 (HSA)-인산 완충 식염수 용액에 용해시킴으로써 준비합니다. 냉동튜브에 200 μL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 1 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 bFGF는 7일 동안 4°C에서 저장될 수 있다.
- 로키나아제 억제제(ROCK Inhibitor)-Y27632 스톡 용액(1 mg/mL)을 멸균수에 용해시켜 준비합니다. 냉동튜브에 50 μL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 1 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 ROCK 억제제는 7일 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
- 줄기 세포 기질을 희석 (재료 표참조) 1:50 칼슘과 마그네슘과 덜베코의 인산 완충 식염수.
- 희석된 줄기세포 기판 용액을 배양판에 놓아 표면적당 최종2부피가 78 μL/cm2가 되도록 한다. 6 웰 플레이트의 우물을 코팅하려면 750 μL의 용액을 추가하십시오.
- 코팅된 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서허프화된 분위기에서 1시간 동안 배양한다.
- 줄기 세포 기질 코팅을 흡인하고 20 ng/mL bFGF 및 10 μM ROCK 억제제로 보충된 hESC 1 mL을 첨가합니다.
- 동결된 인간 iPSC 세포의 바이알을 해동하기 위해, 해동될 때까지 37°C에서 바이알을 배양하고 세포를 5 mL hESC-SFM 매체로 옮김을 전달한다.
- 원심분리기 세포는 100 x g에서 3 분 동안.
- 0.5 mL hESC-SFM에 20 ng/mL bFGF 및 10 μM ROCK 억제제를 보충하여 다시 중단합니다. 코팅된 세포를 잘 전사한다.
- 배양 세포24 시간.
- 20 ng/mL bFGF로 보충된 hESC-SFM으로 미디어를 변경하지만 ROCK 억제제는 없습니다.
- 세포를 유지하려면 세포가 80 % 합류에 도달 할 때까지 매일 배지를 변경하십시오. 미분화 iPSCs는 일반적으로 80% 동률에 도달하는 데 3-4일이 소요됩니다.
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일단 세포가 80% 합류에 도달하면, 통로 세포.
- 20 ng/mL bFGF(ROCK 억제제 제외)로 보충된 1.5 mL의 신선한 hESC-SFM으로 소비배양 배지를 대체합니다.
- 배양 용기를 한 손에 들고 일회용 셀 패서징 도구(재료 표참조)를 한 방향으로(즉, 왼쪽에서 오른쪽으로) 플레이트를 가로질러 굴려보세요. 롤러의 모든 블레이드가 플레이트에 닿아야 합니다. 롤링 하는 동안 균일 한 압력을 유지 합니다.
- 전체 우물이 덮일 때까지 같은 방향으로 반복 롤링하십시오.
- 배양 용기를 90° 회전하고 1.12.2 및 1.12.3 단계에 설명된 대로 반복 압연한다.
- 사용 후에는 패시징 도구를 폐기하십시오.
- 멸균 피펫을 사용하여 우물의 매체를 사용하여 절단 식민지를 빼냅니다.
- 1:4 비율로 전코팅 된 줄기 세포 기질 웰 (단계 1.2-1.5)에서 웰 당 1.5 mL의 최종 미디어 볼륨 (hESC -SFM 보충 20 ng/mL bFGF).
2. 인간 iPSC 라인 동결
- iPSC 세포를 동결하려면, hESC-SFM을 20 ng/mL bFGF 및 10 μM ROCK 억제제와 함께 6웰 플레이트의 70%-80% 웰웰의 매체로 교체하십시오.
- 37°C에서 잘 배양하고 1시간 동안 5%CO2를 배양한다.
- 세포 통과 도구로 식민지를 잘라 원심 분리 튜브에 빠진 식민지를 배치합니다.
- 원심분리기 세포는 100 x g에서 3 분 동안.
- 매질을 흡인하고 세포 동결 보존 매체의 1 mL에서 세포를 재중단시다(재료 표참조).
- 세포를 두 개의 저온 으로 동등하게 나누고 4 °C에서 미리 냉각 된 세포 냉동 보존 용기에 넣습니다.
- 24-48 시간 동안 -80 °C에서 세포를 저장합니다.
- 바이알을 -135°C 냉동고 또는 액체 질소 탱크로 옮김.
3. 인간 iPSC 대식세포에 대한 분화
참고: 도 1에대식세포 분화 프로토콜의 개략적 요약이 도시되어 있습니다.
- 세포 분화 성장 인자 및 기타 시약 준비
- hESC-SFM 미디어 준비(이전 섹션 참조).
- 젤라틴을 멸균수로 용해시켜 돼지 젤라틴용 액을 0.1% w/v로 준비합니다. 젤라틴 용액은 최대 2 년 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
- BMP4를 4mM 염화수소(HCl)-0.2% BSA PBS 용액으로 용해시킴으로써 인간 BMP4 스톡 솔루션(25 μg/mL)을 준비합니다. 냉동튜브에 50 μL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 1 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 BMP4는 5일 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
- VEGF를 0.2% BSA PBS 용액으로 용해시킴으로써 인간 VEGF 스톡 용액(100 μg/mL)을 준비한다. 냉동튜브에 스톡 솔루션을 10 μL aliquots로 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 1 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 VEGF는 7일 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
- SCF를 0.2% BSA PBS 용액으로 용해시켜 인간 SCF 스톡 솔루션(100 μg/mL)을 준비합니다. 냉동튜브에 5 μL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 1 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 SCF는 10일 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
- IL3를 0.2% BSA PBS 용액으로 용해시킴으로써 인간 IL3 스톡 솔루션(10 μg/mL)을 준비합니다. 냉동튜브에 500 μL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 2 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 SCF는 15일 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
- CSF1을 0.2% BSA PBS 용액으로 용해시킴으로써 인간 CSF1 스톡 솔루션(10 μg/mL)을 준비합니다. 냉동튜브에서 1 mL aliquots로 스톡 솔루션을 배포합니다. 재고 용액은 -20 °C에서 최대 2 년까지 보관할 수 있습니다. 일단 해동되면, 스톡 SCF는 15일 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
- 인터페론 감마(IFNg), 인터류킨 4(IL4), 인터류킨 10(IL10)의 분리된 10μg/mL 스톡 솔루션을 0.2% BSA PBS 용액으로 용해하여 준비합니다. 0.2% BSA PBS 용액으로 용해시킴으로써 리포폴리사카라이드(LPS)를 스톡 용액(100 U/mL)에 준비한다. 각 스톡 솔루션을 35 μL aliquots로 배포합니다. -80 °C에서 최대 2년 보관하십시오. 일단 해동되면, 주식은 7 일 동안 4 °C에서 저장 될 수있다.
- 1 단계 : 배아 시체 생성 (0 일째 - 3 일)
- 0일째에, 1단계 용지 2.25mL(hESC-SFM50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF, 20 ng/mL SCF)를 초저 부착 6 웰 플레이트의 두 개의 웰에 추가합니다.
- 6개의 웰 플레이트에서 iPSC의 80% 웰을 1.5mL의 스테이지 1 용지로 교체합니다.
- 셀 패싱 도구를 사용하여 식민지를 절단하고 피펫으로 절단 된 식민지를 초저 부착 6 웰 플레이트의 두 개의 우물로 옮니다 (재료 표참조).
- 2일째에, hESC-SFM 매체0.5 mL를 사용하여 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF 및 20 ng/mL SCF의 최종 농도로 사이토카인을 가져온다.
참고: IPSC 식민지는 EB가 될 것입니다(그림 2A).
- 2 단계 : 현탁액에서 조혈 세포의 출현
- 4일째에, 6개의 웰 조직 배양판의 4웰을 0.1% w/v 젤라틴으로 코팅하고 적어도 10분 동안 배양한다.
- 젤라틴을 제거하고 2 단계 미디어 2.5 mL을 추가하십시오 (X-VIVO15 100 ng / mL CSF1, 25 ng / mL IL-3, 2 mM 글루타맥스, 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 및 0.055 mM 2-mercaptoethanol).
- 형성된 EB를 50mL 원심분리기 튜브에 모으고 중력에 의해 튜브 바닥에 정착할 수 있도록 합니다. 조심스럽게 미디어를 흡인.
- 스테이지 2 미디어의 2mL에서 EB를 다시 일시 중단합니다.
- 10-15 EB(15 이하)를 2.5 mL의 스테이지 2 용지를 함유하는 젤라틴 코팅 웰로 옮니다.
- 37°C 및 5%CO2 공기에서 EB를 배양합니다.
- 도금 된 EB의 미디어를 2-3 주 동안 3-4 일마다 변경하십시오.
- 후 2-3 주, EBs 는 현탁액으로 비 부착 조혈 세포를 방출하기 시작합니다.
참고: 현탁액 세포 방출의 이 기간은 변화할 수 있고 세포주 의존적이다. 이러한 현탁액의 세포는 대식세포내로 수확 및 숙성될 수 있다(단계 3 참조)(도2A).
- 3 단계 : 말단 대식세포 성숙
- 현탁액 조혈 세포를 수집하고 EB 플레이트에 매질(Stage 2 media)을 보충합니다.
- 원심분리기 현탁액 세포를 200 x g에서 3분 동안.
- 3단계 매질에서 현탁액 세포를 다시 중단합니다(X-VIVO1510 ng/mL CSF1, 2 mM 글루타맥스 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충).
- 플레이트는 0.2 x 106 세포/mL의 밀도로 처리되지 않은 플라스틱 10cm 세균등급 플레이트(10 mL) 또는 코팅되지 않은 6웰 조직 배양플레이트(3 mL)에 세포를 수집하고 분사하였다.
- 9-11일 동안 스테이지 3 미디어에 세포를 보관하고 5일마다 미디어를 변경합니다.
참고: 단계 3.4.1-3.4.5 단계 3-4 일마다 반복 될 수 있고 최대 3 개월 동안 원래 EB 플레이트에서 수확 된 현탁액 세포.
- 대식세포 편광
- 대식세포를 M(LPS + IFNg) 표현형으로 활성화하려면 LPS(최종 농도: 100 ng/mL) 및 IFNg(최종 농도: 10 U/mL)로 세포를 48시간 동안 자극합니다. 세포를 M(IL4) 표현형으로 활성화하려면 IL4(최종 농도: 20 ng/mL)로 세포를 자극합니다. M(IL10) 표현형을 활성화하려면 IL10(최종 농도: 5 ng/mL)으로 대식세포를 자극합니다.
4. iPSC 유래 대식세포 품질 관리 검사
- 혈세포계로 계산하여 EB의 6 웰 플레이트 당 생산되는 조혈 현탁액 세포의 수를 결정합니다.
- 앞에서 설명한 대로 대식세포 형태를 평가한다(예를 들어, 상용 키트 염색)8,,9.
-
앞서 설명한 바와 같이 유전자 발현 분석 및 유세포분석을 이용한 대식세포 특이적 마커 및 편광 마커의발현을 검출하는 8,,9.
- 대식세포의 6웰 플레이트 중 하나의 웰에서 유세포 분석 실험을 위해, 성숙매체를 흡인하여 세포를 수확하고, 2 mL의 PBS로 세척하고, 실온에서 5분 동안 2 mL의 효소 자유 세포 해리 버퍼로 배양합니다. 피펫을 위아래로 반복해서 분리하고 수확합니다.
- 혈세포계로 세포를 카운트하고 2% BSA, 0.5 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)-PBS 용액의 80 μL에서 세포를 재중단시켰다.
- MACS 인간 FC 차단제 20 μL을 추가합니다.
- 20 분 동안 얼음에 배양하고 빛으로부터 보호합니다.
- 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS 용액의 적절한 부피를 추가하여 세포 농도를 1 x 106 대식세포/mL로 가져옵니다.
- 얼룩 1 x 105 세포에서 100 μL의 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS 용액을 해당 항체와 함께 (아래 참고 참조) 및 빛으로부터 보호된 RT에서 15분 동안 배양한다.
- 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS의 적어도 100 μL로 1x를 씻으소서.
- 2% BSA, 0.5 mM EDTA PBS의 200 μL에서 세포를 다시 중단.
- 살아있는 죽은 염료로 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 희석 1:1,000)를 추가하십시오. 3 분 배양.
- 유세포분석의 경우, 주 모집단에 대한 게이트, 단일 세포, 그리고 살아있는 세포를 조사한다. 살아있는 세포 집단상, 대식세포 관련 마커 발현은분명하다(도 3A).
참고: 항체는 대식세포를 도출하기 위하여 이용된 각 세포주를 위해 신중하게 적정되어야 합니다. 결과 섹션에 제시된 항체는 재료 표에있습니다. SFCi55-유래 대식세포 유세포 분석의 희석 인자도 포함된다.
5. 높은 처리량 식세포 분석
- iPSC 유래 대식세포(iPSC-DM)를 매개체를 흡인하고, 얼음 차가운 효소 자유 세포 해리 버퍼를 추가하고, 5분 동안 배양하여 반복적으로 피펫팅하여 대식세포를 수집합니다.
- 플레이트 8 x 104 iPSC-DM은 이미징 조직 배양 등급 96 웰 플레이트(예를 들어, 셀캐리어 울트라, 퍼킨 엘머)의 웰 플레이트에서 적어도 2일 전에 200 μL의 3단계 배지에서 높은 처리량 이미징을 갖는다.
- pHrodoGreen Zymosan-A 바이오 입자는 PBS의 2 mL에서 1 개의 바이알을 재중단시킴으로써 준비합니다 ("용액 1"). 10 s에 대 한 소용돌이 솔루션.
- 더 많은 PBS ("용액 2")로 PBS 비드 현탁액의 2 mL을 1:5로 희석하십시오.
- 10 s용 8 s용 소닉 액 액 2와 와류 용액을 4 °C로 유지하십시오. 이 솔루션은 5.11 단계에서 사용됩니다.
- 도금된 iPSC-DM의 용지를 제거하고 PBS로 세척합니다.
- Hoechst 33342를 함유하는 PBS 용액을 가진 얼룩 iPSC-DM은 1:20 희석되었다. 37 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
- PBS로 세포를 세척하십시오.
- 1:1,000을 희석한 깊은 적색 플라즈마 멤브레인 얼룩을 함유한 PBS 용액으로 얼룩을 제거하였다(재료 표참조). 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- PBS로 세포를 세척하십시오.
- iPSC-DM의 각 웰에 4°C로 유지된 비드 용액 100 μL을 추가합니다. 이제 플레이트가 이미징할 준비가 되었습니다.
- 고함량 이미징 시스템을 이용하여 플레이트를 이미지화하고 웰을 가로질러 3개 이상의 필드를 획득하여 웰의 좋은 표현을 얻었다.
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콜럼버스 소프트웨어(고함량 이미징 분석 시스템 소프트웨어)를 사용하여 식세포증을 정량화합니다. 명확한 이미지 일괄 분석을 위해 특정 알고리즘을 개발할 수 있습니다.
- 파란색 강도를 측정하고 소프트웨어에서 파란색 신호가 핵을 나타낸다는 것을 정의합니다.
- 적색 강도를 측정하고 적색 신호가 세포질임을 나타내는 소프트웨어에서 정의합니다.
- 핵과 세포질이 함께 세포에 해당한다는 것을 정의합니다.
- 세포의 녹색 강도를 측정하고 세포를 식세포로 간주하기 위해 엄격한 컷오프/임계값을 설정합니다.
- 세포당 식세포 분획 및 평균 식세포 지수를 정량화한다. 비드 색상 강도는 비드의 수에 비례하기 때문에 식세포 활성은 섭취된 비드의 수에 의해 측정될 수 있다.
- 알고리즘/파이프라인을 모든 필드 내의 모든 이미지와 획득한 모든 시간 지점에 적용하여 강력하고 편견 없는 배치 접근 방식을 통해 세포의 식세포 기능을 결정할 수 있습니다.
참고: Columbus는 세포 표현형 및 기능 테스트를 위한 세포 세분화 분석을 제공하는 고함량 분석 소프트웨어입니다.
Representative Results
분화 진행, 대식세포 수 및 형태학
제시된 결과는 SFCi55 인간 iPSC 라인의 분화로부터 기술되고 다수의 연구에서88,9,10,,26을기술하고 사용한다.9 대식세포로 IPSC 분화의 과정은 광학 현미경 검사법에 의해 감시될 수 있었습니다. iPSC 콜로니, 배아체(EBs), 조혈 현탁액 세포 및 성숙한 대식세포는 형태학적으로 구별되었다(도2A). 성숙한 대식세포 형태는 원심 분리된 사이토스핀 제제의 염색에 의해 추가로 검증될 수 있었다. IPSC 유래 대식세포는 크고, 많은 소포를 함유하는 단일 작은 타원형 핵 및 풍부한세포질(도 2B)을가졌다.
조혈 현탁액 세포의 처음 2주(일 16-28일)는 평균 2.59 x 10 6±0.54 세포를6 함유한 1개의 전체 6개의 웰 플레이트를 함유하였다. 28일 이후, 평균 4.64 x6 10 6±0.94의 현탁액 세포가 6개의 웰 플레이트당 EBs를 생성하였다. 80일째부터, 현탁액 세포의 수는 EB가 고갈됨에 따라 떨어지기시작했다(그림 2C). EB의 6 웰 플레이트 당 수확 당 3 x 106 전구체 이하로 숫자가 떨어지면 분화 프로토콜을 중지하는 것이 좋습니다.
IPSC 유래 대식세포 표면 표식
유세포측정법은 인간 대식세포의 표현형을 평가하는 데 사용되는 가장 일반적인 방법으로 남아 있습니다. 세포 표면 마커 발현을 평가하기 위한 게이팅 전략은 크기 및 세분성과 같은 물리적 파라미터를 사용하여 세포의 주요 집단을 게이팅한 다음 단일 세포를 게이팅한 다음 살아있는 세포를 게이팅하는 것으로구성됩니다(그림 3A). 성숙한 iPSC 유래 대식세포는 계보 마커 CD45 및 대식세포 성숙 마커 25F9를 표현해야 하며, 단핵구/미성숙 대식세포 마커 CD93에 대해 음의 적이어야 한다. 이는 당사의 관찰과일치합니다(그림 3A). IPSC 유래 대식세포는 또한 계보 골수성 마커 CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 및 CD169(도3B)에대해 양성이었다. 그들은 면역 변조 마커 CD86에 대해 양성이었고, 그 중 작은 비율은 순진한 상태에서 CX3CR1, CCR2, CCR5 및 CCR8을 발현하였다(그림3B). 플롯은 이전에 우리의 실험실8에의해 출판 된 데이터에서 얻은 .
iPSC 유래 대식세포 식균증 및 분광
숙주 방어 및 조직 항상성에서 대식세포의 주요 특징 중 하나는 식세포 병원균, 세포사멸 세포 및 파편27에대한 그들의 능력이다. 식세포증의 비율은 특정 자형상태28과밀접한 관련이 있다. iPSC-DM 식세포 능력을 평가하기 위해, 우리는 퍼키넬머 오페레타 현미경 및 pHrodo Zymosan 생체 입자 (pH 감응염 접합체)를 사용하는 고함량 이미징 시스템 접근법8,,9,,11을 사용했습니다. 바이오입자는 배양액에 첨가했을 때 불형광(도4A)이었지만세포내 산성 pH(도4B)에서밝은 녹색을 형광하였다. 살아있는 화상 진찰 Operetta 현미경은 175 분의 총 시간 동안 구슬의 추가 후에 매 5 분마다 심상하도록 설정되었습니다. 높은 처리량 및 편견없는 이미지 분석 파이프라인은 콜럼버스 플랫폼에서 식세포 비드가 섭취한 구슬의 수의 척도인 식세포 비드와 식세포 지수의 비율을 나타내는 식세포 분획의 관점에서 활동을 정량화하는 데 사용되었습니다.
대식세포는 환경 단서에 따라 표현형에 반응하고 변경할 수 있습니다. iPSC-DM은 환경 자극에 반응하고 변화하는 능력을 평가하기 위해 LPS 및 IFNg, IL4 또는 IL10으로 치료할 수 있습니다. 48시간 의 치료 후, 이들은 표현형을 변화시켰으며, 본원에서 M(LPS+ IFNg), M(IL4), 및 M(IL10)으로 각각29로지칭된다. 유전자 발현 분석은 대식세포의 편광 상태를 테스트하는 유용한 도구입니다. LPS 및 IFNg 자극시, 대식세포는 CD40, VCAM1및 TNFA유전자의 mRNA 발현을 업게하였다(도5A). IL4 자극시, 세포는 CD68, CD84및 MRC1의 유전자의 mRNA 발현을 업게하였다(도5B). IL10 자극시, iPSC-DMs는 MRC1의 조절식을 업게하였다(도5B). 식세포증의 관점에서, LPS + IFNg 또는 IL4로 처리된 대식세포는 순진한 대식세포에 비해 식세포 세포의 현저히 낮은 비율을 보였다. IL10으로 처리된 iPSC-DM은 식세포 및 식세포 지수의 증가된 백분율을보였다(도 5C–E).
도 1: 성숙한 기능성 대식세포에 대한 iPSC 분화의 그래픽 요약. 바이오렌더로 그려진 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: iPSC 분화 대식세포 및 iPSC-DM 수 및 형태학. (A)밝은 필드 이미지로부터 수득된 (왼쪽에서 오른쪽으로): IPSC 콜로니, 배아 체(EBs), 수확된 현탁액 세포, 및 성숙한 대식세포. 배율 막대 = 100 μm. (B)Kwik-diff 키트로 얼룩진 대식세포 시토스핀의 이미지. 배율 막대 = 25 μm. (C)수확당 수집된 현탁액 셀의 수로, 1개의 유정 접시 1개당 6개의 유정이 있습니다. 플롯은 평균 + SEM을 보여줍니다; (n = 6 생물학적으로 독립적인 실험). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 대식세포 표면 마커 표현형. (A)성숙한 iPSC 유래 대식세포 의 분석을 위한 게이팅 전략. 단일, 라이브 셀을 게이트한 다음, CD45, CD93 및 25F9의 세포 표면 마커의 발현을 분석하였다. 세포 표면 마커에 대한 게이트는 형광 마이너스 1(FMO) 대조군을 사용하여 그려졌다. (B)계보 및 골수성 마커, 면역 변조 마커, 성숙 마커 및 케모카인 수용체에 대한 iPSC-DM (파란색) 및 이소형 대조군 (회색)의 단일 얼룩에 대한 대표적인 유세포 분석 히스토그램. 플롯은 CD105 및 CD206(n=3)을 제외한 모든 계보 및 골수성 마커에 대한 n=5 생물학적으로 독립적인 실험을 대표한다; 성숙 마커 (n = 5); 면역 변조 마커 (n = 3); 및 케모카인 수용체 (n = 3). 플롯은 이전에 게시된 데이터8을사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: IPSC-DM 편광 및 식세포 분석. iPSC-DMs(A)의A대표적인 이미지는 비드첨가 후 175분 후 자이모산 pHrodo 그린 비드 및(B)첨가 후 175분 후에 첨가하였다. 파란색은 세포의 핵을 나타낸다. 빨간색은 세포의 세포질을 나타냅니다. 녹색은 섭취된 비드를 나타냅니다(배율 막대 = 20 μm). (C)식세포 대식세포의 분획 및(D)식세포 지수/청색강도당 식세포 대식세포의 세기는 순진한 상태에서 시간이 지남에 따라 (n=6 생물학적으로 독립적인 실험). 플롯은 평균 값을 표시하고 막대는 SEM을 나타냅니다. 플롯은 이전에 게시된 데이터8을사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: iPSC-DM 편광 상태 평가. (A)M(LPS+IFN;의 발현을 평가하기 위한 순진하고 편광된 iPSC-DM)의 RT-PCR 분석의 상대적 정량화; (B)M(IL4) 및 M(IL10)-관련 유전자(n=6 생물학적으로 독립적인 실험; 단방향 ANOVA와 Holm-Sidak의 여러 비교 후 테스트. 편광 그룹은 통계적으로 순진한 그룹만 비교하였다). 플롯은 평균 값을 표시하고 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 플롯의 ND = 성적 증명서가 감지되지 않습니다. 이러한 플롯에 대한 데이터는 이전에8. (C)iPSC-DMs의 대표적인 이미지 (왼쪽에서 오른쪽으로) 처리 된 iPSC-DM에서 pHrodo 비드를 첨가 한 후 175 분 : 사이토 카인 없음, LPS + IFN-Y, IL-4 및 IL-10 (스케일 바 = 20 μm). (D)식세포 대식세포의 분획 및(E)식세포 지수/녹색 강도는 비드를 첨가한 후 175분 후에 나이브 및 편광 대식세포 치료에서 식세포 대식세포당 175분(n=12생물학적으로 독립적인 실험, 단방향 ANOVA 및 Holm-Sidak의 다중 비교 후 시험) 편광 그룹은 통계적으로 순진한 그룹만 비교하였다). 플롯은 평균 값을 표시하고 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다(*p < 0.05, **p&0.01, ***p & 0.001, 0.001, ****p & 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기서 설명된 iPSC-DM의 생성을 위한 프로토콜은 견고하며 비교적 적은 수의 iPSC로부터 다수의 동종 셀의 생산을 허용한다. 약 1 x 106 iPSCs의 초기 분화에 따라, 후속 배양은 최대 2-3 개월 동안 4 일마다 수확 될 수 있으며, 그 기간 동안 적어도 6.5 x 107 대식세포의 생산이 가능합니다. 이러한 시험관내 생성 인간 대식세포는 형태학적으로 1차 인간 대식세포와 유사하며, 주요 대식세포 표면 마커를 발현하고, 식세포 활성을 나타낸다. 대식세포 분화를 위한 프로토콜은 재현가능하고 다른 hiPSC 및 hESC 세포주에도 적용될 수 있지만, 대식세포 전구체의 첫 번째 수확의 정확한 타이밍과 생성될 수 있는 세포의 절대 수는 iPSC 라인마다 다릅니다.
대식세포는 유전자 조작된 iPSCs에서 생성될 수 있다는 것이 입증되었습니다. 예를 들어, 구성CAG 프로모터의 제어 하에 형광 리포터 ZsGreen로 구성된 이식유전자 카세트는 SFCi55 iPSC 라인의 AAVS1 궤적에 삽입되었고, 이어서 이러한 iPSC 라인이 ZsGreen 발현 대식세포8로분화될 수 있음을 보여주었다. 이러한 형광 대식세포는 미래에 질병 모델에서 치료 대식세포의 이동 및 안정성을 추적하는 데 사용될 수 있습니다. 또 다른 연구에서는, 대식세포는 타목시펜 유도 전사 인자, KLF1을 발현하기 위해 유전적으로 조작된 iPSC 라인에서 생성되었다. iPSC 유래 대식세포에서 KLF1의 활성화는 적혈구 섬의 대식세포에 필적하는 표현형을 가진 대식세포의 생산을초래했다 9. 잠재적으로, 이 전략은 피부의 간 또는 Langerhans 세포의 Kupffer 세포와 같은 그밖 조직 특정 대식세포 인구와 관련되었던 표현형으로 iPSC 파생된 대식세포를 유전으로 프로그램하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 이것은 이 세포 모형을 정의하는 중요한 전사 요인이 확인되면 가능할 것입니다.
프로토콜의 관점에서, iPSCs의 시작 모집단의 조건이 성공적인 분화를 위해 중요하다는 점에 유의하는 것이 매우 중요합니다. 인간 iPSC 문화는 여러 구절에 걸쳐 karyo전형 비정상적인 하위 인구로 오버런 될 수 있으므로 iPSC 주식 및 게놈 품질 관리를 받는 대형 배치 마스터 주식의 강력한 큐레이션이 권장됩니다. 우리의 손에, 여기에서 기술된 유지 관리 프로토콜은 연속적인 배양에서 최대 2 달 동안 karyo전형 정상 iPSCs를 유지할 수 있습니다, 그러나 이것은 다른 세포주 및 다른 실험실에서 다를 수 있습니다. 문제가 발생하면 각 분화 실험에 미분화 iPSCs의 신선한 바이알을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 미분화 iPSCs의 시작 배양은 80% 이하의 동시성이어야 한다. EB 도금 단계에서는 6개의 웰 조직 배양 판의 웰당 10-15개의 EB만 도금되어야 하며, 이러한 EB가 우물 전체에 고르게 퍼져 나가는 것이 중요합니다. 우물 의 중심에 있는 EBs 및/또는 응집의 더 높은 수는 생성된 대식세포의 수에 부정적인 영향을 미쳤습니다. EB 배양물로부터 단핵구와 같은 전구 현탁액 세포를 채취하여 코팅된 배양판의 표면에 EB의 부착을 방해하지 않도록 배지를 보충하고 수확할 때 주의를 기울여야 합니다. 제조된 조혈 현탁액 세포의 수는 수확할 때마다 서서히 증가하고, 40-72일 사이의 최적의 생산과 함께 분화의것이다(도 2). 정확한 타이밍은 iPSC 라인에 따라 다를 수 있지만 생산은 68 일 후 점진적으로 감소하고 플레이트는 2.5 개월 후 배출하는 경향이있다.
우리의 프로토콜의 한 가지 제한은 2 단계의 끝에서 생성 된 조혈 현탁액 세포를 냉동 보존하는 것이 가능하지 않다는 것입니다. WNT의 외인성 활성화에 의존하는 프로토콜은 동결 보존 후 40%의 회수율에 대해 보고하지만, 이들 프로토콜은 하나의 세포 수확만보고하므로 생성된 대식세포의 절대 수는30개에불과하다. 여기에 설명된 프로토콜은 EB의 형성을 통해 내인성 신호를 유도하여 격주로 수확하여 훨씬 더 높은 총 대식세포 수율을 생성할 수 있습니다.
요약하자면, 기능성 iPSC 유래 대식세포의 생산을 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 건강과 질병에 대식세포 생물학을 연구하기 위해 iPSC 유래 대식세포로 시험관 내 실험을 설정하는 것은 단핵구 유래 대식세포(MDM)를 갖는 실험에 비해 많은 장점이 있습니다. 이러한 장점은 재료에 대한 접근성의 용이성(예를 들어, 기증자가 필요하지 않으며), 매우 많은 양의 대식세포가 생성될 수 있으며, 유전자 변형 대식세포를 생산하는 것이 가능하고 비교적 간단하다는 것을 포함한다. 더욱이, iPSC 유래 대식세포는 조직 상주 대식세포 생물학의 연구 결과지를 위한 더 나은 자원일지도 모릅니다.
Disclosures
저자는 선언할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 현미경 검사법으로 흐름 세포 측정, Eoghan O'Duibhir 및 버트 랜드 베르네이와 도움을 피오나 로시와 클레어 크라이어에게 감사드립니다. 이 작품은 CONACYT에 의해 투자되었다 (M.L.-Y.), 웰컴 트러스트 (102610) 및 혁신 영국 (L.M.F), 웰컴 트러스트 박사 과정 학생 (A.M), MRC 정밀 의학 학생 (T.V). L.C.와 J.W.P.는 웰컴 트러스트 (101067 / Z / 13 / Z), 의학 연구 위원회 (MR / N022556 / 1), 비용 액션 BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350010 | |
| Abtibody CD64-APC -CY7 | Biolegend | 305026 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody 25F9-EFLUOR 660 | Ebioscience | 15599866 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CCR2-PE-Cy7 | Biolegend | 357212 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR5 PE | Biolegend | 313707 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR8 PE | Biolegend | 360603 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD11b-PE | Biolegend | 301305 | Dilution factor: 1:50 |
| Antibody CD14-APC | Ebioscience | 10669167 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD163-PE-CY7 | BIolegend | 333614 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD169-APC | Biolegend | 346007 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD206-PE | Biolegend | 321106 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD209-PE-CY7 | Biolegend | 3310114 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD274-PE-CY7 | Biolegend | 329718 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD43-PE | Ebioscience | 10854419 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD45-APC | Ebioscience | 15577936 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD86-APC | Biolegend | 305412 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD93-PE | Ebioscience | 10804637 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CX3CR1-PE | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody HLA-DR-BV650 | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antiboy CD115-PE | Biolegend | 347308 | Dilution factor: 1:40 |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme free | Thermofisher | 13151014 | |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS | Gibco | 13151014 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well | PerkinElmer | 6055302 | |
| CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain | Thermofisher | C10046 | Cryopreservation media |
| Cryostor CS10 | Sigma | C2874 | |
| CTS CELLstart Substrate | Invitrogen | A1014201 | Stem cell substrate |
| DAPI | Merck | D9542-1MG | Final concentration 1 μg/mL |
| DPBS, calcium, magnesium (500 mL) | Thermofisher | 14040091 | |
| FcR Blocking Reagent, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHG0021 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IFNY | Thermofisher | 14-8319-80 | |
| Human Serum Albuminum | Irvine Scientific | 9988 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli | Sigma | L2630 | |
| NucBlue (Hoechst33342) | Thermofisher | R37605 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis | Thermofisher | P35365 | |
| Porcine Skin Gelatin | Sigma | G9136 | |
| Recombinant Human BMP4 Protein | R&D | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human IL10 | Preprotech | 200-10 | |
| Recombinant Human IL3 | Preprotech | 200-03-10 | |
| Recombinant Human IL4 | Preprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100 μg | Biolegend | 574806 | |
| Recombinant Human VEGF Protein | R&D | 293-VE-010 | |
| Rock Inhibitor Y-27632 | Merck | SCM075 | |
| SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHC2111 | |
| StemPro hESC SFM | Thermofisher | A1000701 | |
| StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | Thermofisher | 23181010 | |
| Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface | Greiner | 657970 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| X-Vivo 15 500 mL bottle | Lonza | BE02-060F |
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