Summary
Ce protocole décrit la génération robuste de macrophages des cellules souches pluripotentes induites par l’homme, et les méthodes pour leur caractérisation ultérieure. L’expression de marqueur de surface de cellules, l’expression de gène, et les essais fonctionnels sont employés pour évaluer le phénotype et la fonction de ces macrophages iPSC-dérivés.
Abstract
Les macrophages sont présents dans la plupart des tissus vertébrés et comprennent des populations cellulaires largement dispersées et hétérogènes ayant des fonctions différentes. Ils sont des acteurs clés de la santé et de la maladie, agissant comme phagocytes pendant la défense immunitaire et la médiation trophique, l’entretien, et les fonctions de réparation. Bien qu’il ait été possible d’étudier certains des processus moléculaires impliqués dans la fonction de macrophage humain, il s’est avéré difficile d’appliquer des techniques de génie génétique aux macrophages humains primaires. Cela a considérablement entravé notre capacité d’interroger les voies génétiques complexes impliquées dans la biologie du macrophage et de générer des modèles pour des états de maladie spécifiques. Une source de macrophages humains prêtes à l’emploi, qui est favorable au vaste arsenal de techniques de manipulation génétique, constituerait donc un outil précieux dans ce domaine. Nous présentons un protocole optimisé qui permet la génération de macrophages à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) in vitro. Ces macrophages iPSC-dérivés (iPSC-DMs) expriment des marqueurs de surface de cellules de macrophage humain, y compris CD45, 25F9, CD163, et CD169, et notre essai fonctionnel d’imagerie de cellules vivantes démontre qu’ils présentent l’activité phagocytic robuste. Les iPSC-DM cultivés peuvent être activés vers différents états de macrophage qui affichent l’expression génique altérée et l’activité phagocytic par l’ajout de LPS et IFNg, IL4, ou IL10. Ainsi, ce système fournit une plate-forme pour générer des macrophages humains porteurs d’altérations génétiques qui modéliser des maladies humaines spécifiques et une source de cellules pour le dépistage des médicaments ou la thérapie cellulaire pour traiter ces maladies.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires (ESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) représentent une source cellulaire auto-renouvelée qui peut être différenciée pour produire des cellules des trois lignées de couches germinales. Les technologies qui permettent la manipulation génétique des cellules souches pluripotentes humaines (CSP), telles que la nucléase des doigts de zinc, les TALENS et le CRISPR-Cas9, ont révolutionné la recherche médicale1,2,3,4. La manipulation génétique des CFP humains est une stratégie particulièrement attrayante lorsque la cellule primaire d’intérêt est difficile à développer et/ou à maintenir invitro, ou est difficile à manipuler génétiquement, comme c’est le cas pour les macrophages5,6,7,8,9. Comme les IPSC humains peuvent être dérivés de n’importe quelle cellule somatique, ils contournent les limitations éthiques associées aux ESC et fournissent une stratégie pour la livraison de médicaments personnalisés. Cela comprend la modélisation des maladies spécifiques aux patients, le dépistage des drogues et la thérapie cellulaire autologue avec un risque réduit de rejet immunitaire et d’infection6,8,10,11.
Les protocoles décrivant la génération de macrophages à partir d’iPSC consistent en un processus en trois étapes qui comprend : 1) Génération de corps embryonnaires; 2) Émergence des cellules hématopoïétiques en suspension ; 3) Maturation du macrophage terminal.
La formation d’agrégats tridimensionnels, connus sous le nom de corps embryonnaires (EB) initie la différenciation des iPSC. Des protéines morphogénétiques osseuses (BMP4), un facteur de cellules souches (SCF) et un facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) sont ajoutés pour stimuler la spécification du mésoderm et soutenir les cellules hématopoïétiques émergentes7,8,9,11,12. Les cellules différenciantes dans les EB initient également l’activation des voies de signalisation endogènes telles que Wnt et Activin. Certains protocoles de différenciation ne passent pas par le stade de la formation EB. Dans ces cas, les régulateurs de signalisation Wnt et Activin, tels que l’Activin A et/ou Chiron humain recombinant, sont ajoutés aux iPSC différenciants dans un format monocouche13,14,15. Ici, nous nous concentrons sur un protocole qui utilise la formation EB. Pour la deuxième étape de la différenciation, les EB sont plaqués sur une surface adhérente. Ces cellules attachées sont ensuite exposées à des cytokines qui favorisent l’émergence de cellules de suspension qui incluent des progéniteurs hématopoïétiques et myéloïdes. Dans ces conditions de culture in vitro, l’interleukine-3 (IL3) soutient probablement la formation et la prolifération des cellules hématopoïétiques souches-progénitrices16,17, ainsi que la prolifération et la différenciation des précurseurs myéloïdes18. Le facteur stimulant de la colonie de macrophage (CSF1) soutient la production de cellules myéloïdes et leur différenciation avec les macrophages19,20. Au cours de la troisième étape de la différenciation, ces cellules de suspension sont cultivées en présence de CSF1 pour soutenir la maturation du macrophage terminal.
La différenciation des iPSC humains en macrophages in vitro imite la première vague de production de macrophage pendant le développement. Les macrophages de tissu-résident sont établis pendant l’embryogenèse et ont une lignée développementale distincte des monocytes adultes. Plusieurs études ont montré que les iPSC-DM ont une signature génétique qui est plus comparable aux macrophages foetaux dérivés du foie que les monocytes dérivés du sang, ce qui suggère que les iPSC-DMs s’apparentent davantage aux macrophages de tissu-résident. iPSC-DMs exprimer des niveaux plus élevés de gènes qui codent pour la sécrétion de protéines impliquées dans le remodelage des tissus et l’angiogenèse et exprimer des niveaux inférieurs de gènes codant pour la sécrétion de cytokine pro-inflammatoire et les activités de présentation d’antigène21,22. En outre, iPSC-DMs ont une exigence analogue facteur de transcription à celle des macrophages de tissu-résident23,24. L’utilisation des lignées cellulaires knock-out iPSC qui sont déficientes dans les facteurs de transcription RUNX1, SPI1 (PU.1), et MYB, Buchrieser et autres a montré que la génération d’iPSC-DMs est SPI1 et RUNX1 dépendant, mais MYB indépendant. Ceci indique qu’ils sont transcriptionnellement semblables aux macrophages dérivés de jaune-sac qui sont générés pendant la première vague d’hématopoiesis pendant le développement23. Par conséquent, il est largement admis que les iPSC-DM représentent un modèle cellulaire plus approprié pour étudier les macrophages de tissu-résident tels que les microglies14,25 et les cellules de Kupffer11, et une source plus souhaitable de cellules qui pourraient potentiellement être employées dans des thérapies pour réparer des tissus. Par exemple, il a été démontré que les macrophages produits in vitro à partir de CSE souris étaient efficaces pour améliorer la fibrose dans un modèle de lésions hépatiques induits par CCl4 in vivo11. En outre, ces macrophages dérivés de l’ESC étaient plus efficaces que les macrophages dérivés de la moelle osseuse à repeupler les compartiments cellulaires De Kupffer appauvris des macrophages utilisant le clodronate liposomal11 chez la souris.
Ici, nous décrivons les protocoles sans sérum et sans alimentation pour l’entretien, le gel et le dégel des iPSCs humains, et pour la différenciation de ces iPSC en macrophages fonctionnels. Ce protocole est très similaire à celui décrit par Van Wilgenburg et coll.12, avec des modifications mineures, y compris : 1) les supports iPSC-maintenance; 2) L’inhibiteur ROCK n’est pas utilisé au stade de formation EB; 3) Une approche mécanique plutôt qu’une approche enzymatique est utilisée pour générer des EB uniformes à partir de colonies iPSC; 4) La méthode pour la récolte et le placage d’EB est différente ; 5) Les cellules de suspension sont récoltées 2x par semaine, plutôt que chaque semaine ; et 6) Les cellules de suspension récoltées sont cultivées sous CSF1 pour la maturation du macrophage pendant 9 jours plutôt que 7 jours. Nous décrivons également les protocoles utilisés pour caractériser le phénotype et la fonction de macrophage dérivés d’iPSC, y compris des analyses pour l’expression des gènes (qRT-PCR), l’expression de marqueur de surface cellulaire (cytométrie de flux), et les essais fonctionnels pour évaluer la phagocytose et la polarisation.
Protocol
REMARQUE: Tous les réactifs et équipements utilisés dans ce protocole sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. Les médias devraient être à 37 oC pour la culture cellulaire. Les médias et les réactifs utilisés dans le protocole de différenciation doivent être stériles.
1. Dégel et entretien de la ligne iPSC humaine
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Préparer le milieu d’entretien cellulaire, les facteurs de croissance et d’autres réactifs.
- Préparer les supports libres hESC-sérum (hESC-SFM; voir Tableau des matériaux) en complétant l’Eagle medium-F12 modifié de Dulbecco (DMEM/F12) avec supplément hESC, 1,8% w/v albumin de sérum bovin (BSA), et 0,1 mM 2-mercaptoethanol. (
- Préparer la solution de stock du facteur de croissance fibreux de base humain (bFGF) (10 g/mL) en dissolvant le bFGF dans une solution saline tamponnée (PBS) stérile de 0,1 % de sérum humain (HSA). Distribuez la solution de stock sous forme d’aliquots de 200 L dans des cryotubes. Les solutions stock peuvent être stockées à -20 oC jusqu’à 1 an. Une fois décongelé, le stock bFGF peut être stocké à 4 oC pendant 7 jours.
- Préparer l’inhibiteur de la kinase Rho (inhibiteur de ROCHE)-Y27632 solution de stock (1 mg/mL) en le dissolvant dans l’eau stérile. Distribuez la solution de stock sous forme d’aliquots de 50 L dans des cryotubes. Les solutions stock peuvent être stockées à -20 oC jusqu’à 1 an. Une fois décongelé, l’inhibiteur ROCK stock peut être stocké à 4 oC pendant 7 jours.
- Diluer le substrat de cellules souches (voir tableau des matériaux) 1:50 dans la saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec du calcium et du magnésium.
- Placez la solution diluée de substrat de cellules souches sur des plaques de culture de sorte que le volume final par surface est de 78 L/cm2. Pour enrober le puits d’une plaque de 6 puits, ajouter 750 l de solution.
- Incuber la plaque enduite pendant 1 h dans une atmosphère humifiée à 37 oC et 5% de CO2.
- Aspirez le revêtement du substrat de cellules souches et ajoutez 1 ml de hESC complété par 20 ng/mL bFGF et 10 M INHIBITeur ROCK.
- Pour décongeler une fiole de cellules iPSC humaines congelées, incuber le flacon à 37 oC jusqu’à ce qu’il soit décongelé et transférer les cellules dans un support hESC-SFM de 5 ml.
- Cellules de centrifugeuse à 100 x g pendant 3 min.
- Résuspendez en 0,5 mL hESC-SFM complété par 20 ng/mL bFGF et 10 M ROCK Inhibiteur. Transférer les cellules vers le bien enduit.
- Cellules de culture pour 24 h.
- Changez de support en hESC-SFM complété par 20 ng/mL bFGF, mais sans inhibiteur rock.
- Pour maintenir les cellules, changez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence. Les IPSC indifférents prennent habituellement de 3 à 4 jours pour atteindre 80 % de confluence.
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Une fois que les cellules ont atteint 80% de confluence, les cellules de passage.
- Remplacer la culture passée moyenne par 1,5 mL de hESC-SFM frais complété par 20 ng/mL bFGF (sans inhibiteur ROCK).
- Tenez le récipient de culture dans une main et roulez un outil de passage de cellules jetables (voir tableau des matériaux) à travers la plaque dans une direction (c.-à-d. de gauche à droite). Toutes les lames dans le rouleau doivent toucher la plaque. Maintenez une pression uniforme pendant le roulement.
- Répétez le roulement dans la même direction jusqu’à ce que l’ensemble du puits ait été couvert.
- Faire pivoter le récipient de culture à 90 degrés et répéter le roulement tel que décrit dans les étapes 1.12.2 et 1.12.3.
- Jetez l’outil de passaging après utilisation.
- Avec une pipette stérile, utilisez les médias dans le puits pour déloger les colonies coupées.
- Transférer les cellules à un rapport de 1:4 sur des puits de substrats de cellules souches précoated (étapes 1.2-1.5) à un volume final de médias (hESC -SFM complété par 20 ng/mL bFGF) de 1,5 mL par puits.
2. Congélation de ligne humaine iPSC
- Pour congeler les cellules iPSC, remplacez les supports d’un puits confluent de 70 % à 80 % d’une plaque de 6 puits par hESC-SFM complété par un inhibiteur de 20 ng/mL bFGF et d’un inhibiteur ROCK de 10 M.
- Bien incuber à 37 oC et 5% de CO2 pour 1 h.
- Couper les colonies avec l’outil de passage cellulaire et placer les colonies délogées dans un tube de centrifugeuse.
- Cellules de centrifugeuse à 100 x g pendant 3 min.
- Aspirer les médias et réanimer les cellules dans 1 ml de tissu de cryoconservation cellulaire (voir Tableau des matériaux).
- Divisez les cellules également en deux cryoviaux et placez-les dans un contenant de cryoconservation cellulaire pré-réfrigéré à 4 oC.
- Conserver les cellules à -80 oC pendant 24h48.
- Transférer les flacons dans un congélateur à -135 oC ou dans un réservoir d’azote liquide.
3. Différenciation humaine iPSC aux macrophages
REMARQUE: Un résumé schématique du protocole de différenciation des macrophages est décrit dans la figure 1.
- Préparation des facteurs de croissance de la différenciation cellulaire et d’autres réactifs
- Préparer les médias hESC-SFM (voir la section précédente).
- Préparer 0,1% w/v solution de gélatine porcine en dissolvant la gélatine dans l’eau stérile. La solution de gélatine peut être stockée à 4 oC pendant une année allant jusqu’à 2 ans.
- Préparer la solution de stock BMP4 humaine (25 g/mL) en dissolvant le BMP4 en un chlorure d’hydrogène de 4 mM (HCl) -0,2 % de solution BSA PBS. Distribuez la solution de stock sous forme d’aliquots de 50 L dans des cryotubes. Les solutions stock peuvent être stockées à -20 oC jusqu’à 1 an. Une fois décongelé, le stock BMP4 peut être stocké à 4 oC pendant 5 jours.
- Préparer la solution d’actions VEGF humaine (100 g/mL) en dissolvant VEGF en une solution DE 0,2 % de BSA PBS. Distribuez la solution de stock sous forme d’aliquots de 10 L dans des cryotubes. Les solutions stock peuvent être stockées à -20 oC jusqu’à 1 an. Une fois décongelé, le stock VEGF peut être stocké à 4 oC pendant 7 jours.
- Préparer la solution d’actions SCF humaine (100 g/mL) en dissolvant SCF en une solution de 0,2 % de BSA PBS. Distribuez la solution de stock sous forme d’aliquots de 5 L dans des cryotubes. Les solutions stock peuvent être stockées à -20 oC jusqu’à 1 an. Une fois décongelé, le stock SCF peut être stocké à 4 oC pendant 10 jours.
- Préparer la solution de stock IL3 humaine (10 g/mL) en dissolvant IL3 en une solution de 0,2 % de BSA PBS. Distribuez la solution de stock sous forme d’aliquots de 500 L dans des cryotubes. Les solutions stock peuvent être stockées à -20 oC jusqu’à 2 ans. Une fois décongelé, le stock SCF peut être stocké à 4 oC pendant 15 jours.
- Préparer la solution d’actions CSF1 humaine (10 g/mL) en dissolvant CSF1 en une solution de 0,2 % de BSA PBS. Distribuez la solution stock comme 1 mL aliquots dans des cryotubes. Les solutions stock peuvent être stockées à -20 oC jusqu’à 2 ans. Une fois décongelé, le stock SCF peut être stocké à 4 oC pendant 15 jours.
- Préparer des solutions de stock séparées de 10 g/mL d’interféron-gamma (IFNg), d’interleukine 4 (IL4) et d’interleukin 10 (IL10) en se dissolvant en solutions DE PBS BSA à 0,2 %. Préparer le lipopolysaccharide (LPS) à une solution de stock de (100 U/mL) en se dissolvant dans une solution de 0,2% BSA PBS. Distribuez chaque solution de stock sous forme d’aliquots de 35 L. Conserver à -80 oC jusqu’à 2 ans. Une fois décongelés, les stocks peuvent être entreposés à 4 oC pendant 7 jours.
- Étape 1 : Génération de corps embryonnaires (jour 0-jour 3)
- Le jour 0, ajouter 2,25 ml de support de l’étape 1 (hESC-SFM complété par 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF, et 20 ng/mL SCF) en deux puits d’une plaque de puits ultralow attachment 6.
- Remplacer les supports d’entretien d’un puits confluent de 80 % d’iPSC dans une plaque de 6 puits par 1,5 ml de support de l’étape 1.
- Couper les colonies à l’aide de l’outil de passage cellulaire et transférer les colonies coupées avec une pipette dans les deux puits d’une plaque de puits ultralow attachment 6 (voir Tableau des matériaux).
- Le jour 2, apportez les cytokines à une concentration finale de 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF, et 20 ng/mL SCF utilisant 0,5 mL de médias hESC-SFM.
REMARQUE: Les colonies de l’IPSC deviendront des EB(figure 2A).
- Étape 2 : Émergence de cellules hématopoïétiques en suspension
- Le jour 4, enrober 4 puits d’une plaque de culture de tissu de puits de 6 avec 0,1 % de gélatine et incuber pendant au moins 10 min.
- Retirez la gélatine et ajoutez 2,5 ml de support de l’étape 2 (X-VIVO15 complété par 100 ng/mL CSF1, 25 ng/mL IL-3, 2 mM glutamax, 1% pénicilline-streptomycine et 0,055 mM 2-mercaptoethanol).
- Recueillir des EB formés dans un tube de centrifugeuse de 50 ml et leur permettre de s’installer au fond du tube par gravité. Aspirez soigneusement les médias.
- Resuspendez EBs dans 2 mL de l’étape 2 des médias.
- Transférer 10 à 15 EBs (pas plus de 15) dans un puits recouvert de gélatine contenant 2,5 ml de support de l’étape 2.
- Incubate EBs à 37 oC et 5% DE CO2 air.
- Changez de support sur les EB plaqués tous les 3 à 4 jours pendant 2 à 3 semaines.
- Après 2 à 3 semaines, les EB commencent à relâcher les cellules hématopoïétiques nonadherentes en suspension.
REMARQUE: Cette période de libération de cellule de suspension peut varier et dépend de la lignée cellulaire. Les cellules de cette suspension peuvent être récoltées et mûries en macrophages (voir l’étape 3) (figure 2A).
- Étape 3 : Maturation du macrophage terminal
- Recueillir des cellules hématopoïétiques de suspension et reconstituer les supports (médias de stade 2) sur la plaque EB.
- Cellules de suspension de centrifugeuse à 200 x g pendant 3 min.
- Cellules de suspension de résuspendance dans les médias de stade 3 (X-VIVO15 complétées par 100 ng/mL CSF1, 2 mM glutamax et 1% pénicilline-streptomycine).
- Plaque collectée et filée de cellules sur des plaques de plastique non traitées de 10 cm de qualité bactériologique (10 ml) ou de plaques de culture tissulaire de puits non enduites (3 ml) à une densité de 0,2 x 106 cellules/mL.
- Gardez les cellules dans les médias de l’étape 3 pendant 9 à 11 jours, en changeant les médias tous les 5 jours.
REMARQUE: Les étapes 3.4.1-3.4.5 de l’étape 3 peuvent être répétées tous les 3 à 4 jours et les cellules de suspension récoltées à partir de la plaque EB d’origine pendant une période pouvant aller jusqu’à 3 mois.
- Polarisation de macrophage
- Pour activer les macrophages à un phénotype M(LPS et IFNg), stimulez les cellules avec LPS (concentration finale : 100 ng/mL) et IFNg (concentration finale : 10 U/mL) pour 48 h. Pour activer les cellules à un phénotype M(IL4), stimuler les cellules avec IL4 (concentration finale : 20 ng/mL). Pour activer sur un phénotype M(IL10), stimulez les macrophages avec IL10 (concentration finale : 5 ng/mL).
4. Contrôle de la qualité des macrophages dérivé d’iPSC
- Déterminez le nombre de cellules de suspension hématopoïétique produites par 6 plaques de puits d’EBs en les comptant avec un hématocytomètre.
- Évaluer la morphologie du macrophage telle qu’elle a été décrite précédemment (p. ex., coloration commerciale des kits)8,9.
-
Détecter l’expression des marqueurs spécifiques de macrophage et des marqueurs de polarisation à l’aide d’analyses d’expression des gènes et de cytométrie du flux comme décrit précédemment8,9.
- Pour les expériences de cytométrie d’écoulement sur un puits d’une plaque de 6 puits de macrophages, les cellules de récolte en aspirant leur support de maturation, laver avec 2 ml de PBS, et les incuber avec 2 ml de tampon de dissociation cellulaire sans enzyme pendant 5 minutes à température ambiante (RT). Pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour détacher et récolter des macrophages.
- Comptez les cellules avec un hématocytomètre et réutilisez-les dans 80 L d’une solution de 2 % de BSA, 0,5 m M d’acide éthylènediaminettraacétique (EDTA).
- Ajouter 20 L de bloqueur humain MACS FC.
- Incuber sur la glace pendant 20 min et protéger de la lumière.
- Ajouter un volume approprié de 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS solution pour porter la concentration cellulaire à 1 x 106 macrophages/mL.
- Tache 1 x 105 cellules dans 100 L de 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS solution avec anticorps correspondant (voir NOTE ci-dessous) et incubate pendant 15 min à RT protégé de la lumière.
- Laver 1x avec au moins 100 L de 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
- Résuspendez les cellules en 200 L de 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
- Ajouter 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilué 1:1,000) comme colorant mort vif. Incubate 3 min.
- Pour les analyses de cytométrie d’écoulement, porte sur la population principale, puis cellules simples, puis cellules vivantes. Sur la population de cellules vivantes, l’expression de marqueurs liés au macrophage est évidente(figure 3A).
REMARQUE: Les anticorps doivent être soigneusement titrés pour chaque lignée cellulaire utilisée pour dériver des macrophages. Les anticorps présentés dans la section des résultats sont dans le Tableau des matériaux. Le facteur de dilution pour les essais de cytométrie de flux de macrophages dérivés de SFCi55 est également inclus.
5. High Throughput Phagocytosis Assay
- Récoltez les macrophages dérivés d’iPSC (iPSC-DMs) en aspirant les médias, en ajoutant le tampon de dissociation des cellules sans enzymes glacées et en incuber pendant 5 min. Recueillir des macrophages en tuyautant à plusieurs reprises.
- Plaque 8 x 104 iPSC-DMs dans un puits d’imagerie de la culture tissulaire grade 96 plaques de puits (par exemple, Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) au moins 2 jours avant l’imagerie à haut débit dans 200 'L des médias de stade 3.
- Préparer pHrodoGreen Zymosan-A Bioparticles en résinuant une fiole sur 2 ml de PBS (" Solution 1 "). Solution Vortex pour 10 s.
- Diluer les 2 ml de suspension de perle PBS 1:5 avec plus de PBS ("Solution 2").
- Sonicate Solution 2 pour 8 s et solution vortex pour 10 s. Gardez-le à 4 oC. Cette solution sera utilisée à l’étape 5.11.
- Retirez les supports sur iPSC-DMs plaqués et lavez-vous avec PBS.
- Stain iPSC-DMs avec une solution PBS contenant Hoechst 33342 dilué 1:20. Incuber pendant 20 min à 37 oC.
- Laver les cellules avec PBS.
- Tache avec une solution PBS contenant la tache de membrane de plasma rouge profond diluée 1:1,000 (voir Tableau des matériaux). Incuber pendant 30 min à 37 oC.
- Laver les cellules avec PBS.
- Ajouter 100 L de solution de perles conservées à 4 oC à chaque puits d’iPSC-DMs. Les plaques sont maintenant prêtes pour l’imagerie.
- Imagez la plaque à l’aide d’un système d’imagerie à haute teneur et acquérez trois champs ou plus à travers le puits pour obtenir une bonne représentation du puits.
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Quantifiez la phagocytose en utilisant le logiciel Columbus (logiciel de système d’analyse d’imagerie à haute teneur). Un algorithme spécifique peut être développé pour l’analyse sans ambiguïté du lot d’images :
- Mesurez l’intensité bleue et définissez dans le logiciel que le signal bleu indique les noyaux.
- Mesurer l’intensité rouge et définir dans le logiciel que le signal rouge indique le cytoplasme.
- Définir que le noyau et le cytoplasme correspondent ensemble à une cellule.
- Mesurer l’intensité verte dans les cellules et établir une valeur stricte de seuil/seuil pour considérer une cellule comme phagocytique.
- Quantifier la fraction de cellules phagocytiques et l’indice phagocytique moyen par cellule. Étant donné que l’intensité de la couleur des perles est proportionnelle au nombre de perles, l’activité phagocytique peut être mesurée par le nombre de perles ingérées.
- Appliquer l’algorithme/pipeline à toutes les images dans chaque champ et à tous les moments acquis, permettant une approche de lot robuste et impartiale pour déterminer les capacités phagocytiques des cellules.
REMARQUE: Columbus est un logiciel d’analyse de contenu élevé, qui offre l’analyse de segmentation cellulaire pour le phénotypage cellulaire et les tests fonctionnels.
Representative Results
Progression de différenciation, nombre de macrophages et morphologie
Les résultats présentés proviennent de la différenciation de la ligne IPSC humaine SFCi55 qui a été décrite et utilisée dans un certain nombre d’études8,9,10,26. Le processus de différenciation IPSC vers les macrophages pourrait être surveillé par microscopie optique. Les colonies iPSC, les corps embryonnaires (EB), les cellules de suspension hématopoïétique et les macrophages matures étaient morphologiquement distincts(figure 2A). La morphologie mûre de macrophage pourrait être validée par la coloration des préparations centrifuges de cytospin. Les macrophages dérivés de l’IPSC étaient grands et avaient de petits noyaux ovales et un cytoplasme abondant contenant de nombreuses vésicules(figure 2B).
Les 2 premières semaines de suspension hématopoïétique récolte (jours 16-28) d’une plaque complète de 6 puits d’EB contenue, en moyenne, 2,59 x 106 à 0,54 cellules. Après le 28e jour, une moyenne de 4,64 x 106 à 0,94 des cellules de suspension pour 6 plaques de puits d’EB ont été produites. À partir du jour 80, le nombre de cellules de suspension a commencé à baisser à mesure que les EB s’épuisent(figure 2C). Il est recommandé d’arrêter le protocole de différenciation après que les nombres tombent en dessous de 3 x 106 précurseurs par récolte par 6 plaques de puits d’EBs.
IpSC-dérivé de la surface des cellules macrophage marqueurs expression
La cytométrie des débits reste la méthode la plus courante utilisée pour évaluer le phénotype des macrophages humains. La stratégie de gating pour évaluer l’expression du marqueur de surface cellulaire consiste à gating la population principale de cellules en utilisant des paramètres physiques comme la taille et la granularité, suivie par la gating cellules individuelles, puis les cellules vivantes(figure 3A). Les macrophages iPSC-dérivés mûrs devraient exprimer le marqueur de lignée CD45 et le marqueur de maturation de macrophage 25F9, et être négatifs pour le marqueur de macrophage monocyte/immature CD93. Cela est conforme à nos observations(figure 3A). Les macrophages dérivés de l’IPSC ont également été positifs pour les marqueurs myéloïdes de lignée CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 et CD169(figure 3B). Ils étaient positifs pour le marqueur de modulation immunitaire CD86, et une petite proportion d’entre eux exprimaient des récepteurs de chimiokine CX3CR1, CCR2, CCR5 et CCR8 à l’état naïf(figure 3B). Les parcelles ont été obtenues à partir de données publiées précédemment par notre laboratoire8.
Phagocytose et polarisation des macrophages dérivés de l’iPSC
Une des principales caractéristiques des macrophages dans la défense de l’hôte et l’homéostasie des tissus est leur capacité à phagocytose pathogènes, cellules apoptotiques, et les débris27. Le taux de phagocytose est étroitement associé à des états phénotypiques spécifiques28. Pour évaluer la capacité phagocytique iPSC-DM, nous avons utilisé une approche du système d’imagerie à haute teneur8,9,11 qui fait usage du microscope PerkinElmer Operetta et des bioparticules pHrodo Zymosan (conjugues de colorant sensibles à la pH). Les bioparticules n’étaient pasfluorescentes lorsqu’elles étaient ajoutées aux cultures(figure 4A),mais fluorées vert vif dans le pH acide intracellulaire(figure 4B). Le microscope Operetta d’imagerie vivante a été mis à l’image tous les 5 minutes après l’ajout de perles pour un temps total de 175 min. Un pipeline d’analyse d’images à haut débit et impartial a ensuite été utilisé dans la plate-forme Columbus pour quantifier l’activité en termes de fraction phagocytique qui représente la proportion de cellules que les perles phagocytosed et l’indice phagocytique qui est une mesure du nombre de perles que chaque cellule a ingéré.
Les macrophages peuvent réagir et modifier leur phénotype en fonction des indices environnementaux. Pour évaluer leur capacité à réagir et à modifier les stimuli environnementaux, les IPSC-DM peuvent être traités avec des LPS et des IFNg, IL4 ou IL10. Après 48 h de traitement, ils ont changé de phénotype, ici appelé M (LPS - IFNg), M (IL4), et M (IL10), respectivement29. L’analyse de l’expression génique est un outil utile pour tester l’état de polarisation des macrophages. Sur la stimulation LPS et IFNg, macrophages upregulated mRNA expression of genes CD40, VCAM1, and TNFA (Figure 5A). Sur la stimulation IL4, les cellules ont régulé l’expression de l’ARNm des gènes CD68, CD84, et MRC1 (figure 5B). Sur la stimulation IL10, iPSC-DMs upregulated expression of MRC1 (Figure 5B). En termes de phagocytose, les macrophages traités avec LPS - IFNg ou IL4 ont montré un pourcentage significativement inférieur de cellules phagocytiques par rapport aux macrophages naïfs. iPSC-DMs traités avec IL10 a montré un pourcentage accru de cellules phagocytiques et l’indice phagocytique (figure 5C-E).
Figure 1 : Résumé graphique de la différenciation iPSC aux macrophages fonctionnels matures. Diagramme dessiné avec Biorender. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : différenciation iPSC vers les macrophages et le nombre et la morphologie iPSC-DM. (A) Images bright Field obtenues de (de gauche à droite) : une colonie ipSC, des corps embryonnaires (EB), des cellules de suspension récoltées et des macrophages matures. Barre d’échelle à 100 m. (B) Image des cytospins macrophage tachés de kit Kwik-diff. Barre d’échelle de 25 m. (C) Nombre de cellules de suspension collectées par récolte par une 6 plaque de puits d’EBs. Les expositions de parcelle signifient ' SEM ; (n 6 expériences biologiquement indépendantes). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Phénotype de marqueur de surface de cellules de macrophage. (A) Stratégie de Gating pour l’analyse des macrophages iPSC matures dérivés. Des cellules simples et vivantes ont été fermées, puis analysées pour l’expression des marqueurs de surface cellulaire CD45, CD93 et 25F9. Des portes pour les marqueurs de surface cellulaire ont été dessinées à l’aide de fluorescence moins un (FMO) témoins. (B) Indicateurs de cytométrie de flux représentatifs pour les taches simples d’iPSC-DMs (bleu) et de contrôles d’isotype (gris) pour les marqueurs de lignée et de myéloïde, les marqueurs de modulation immunitaire, les marqueurs de maturation et les récepteurs de chimiokine. Les parcelles sont représentatives des expériences biologiquement indépendantes de n 5 pour toutes les lignées et marqueurs myéloïdes, à l’exception des CD105 et des CD206 (n - 3); marqueurs de maturation (n - 5); marqueurs de modulation immunitaire (n - 3); et les récepteurs de la chimiokine (n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Les parcelles utilisent les données publiées précédemment8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : essais de polarisation et de phagocytose IPSC-DM. Images représentatives d’iPSC-DMs (A) immédiatement après l’ajout de perles vertes Zymosan pHrodo et (B) 175 min après l’ajout de perles. Le bleu représente les noyaux des cellules; rouge représente le cytoplasme des cellules. Le vert représente les perles ingérées (barre d’échelle de 20 m). (C) Fraction des macrophages phagocytiques et (D) indice phagocytique/intensité verte par macrophage phagocytique au fil du temps dans l’état naïf (n - 6 expériences biologiquement indépendantes). Les parcelles montrent la valeur moyenne et les barres représentent le SEM. Les parcelles utilisent les données publiées précédemment8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Évaluation des états de polarisation iPSC-DM. Quantification relative des analyses RT-PCR des iPSC-DMs naïfsAet polarisés pour évaluer l’expression des M (LPS-IFN); (B) M(IL4) et M (IL10) --expériences associées; Comparaisons à sens unique ANOVA et Holm-Sidak après le test. Les groupes polarisés étaient statistiquement comparés au groupe naïf seulement). Les parcelles montrent la valeur moyenne, et les barres d’erreur représentent l’écart standard. ND dans les parcelles - transcription non détectée. Les données de ces parcelles ont déjà été publiées8. (C) Images représentatives d’iPSC-DMs 175 min après l’ajout de perles de pHrodo à partir d’iPSC-DM traités avec (de gauche à droite) : pas de cytokines, LPS-IFN-Y, IL-4 et IL-10 (barre d’échelle de 20 m). (D) Fraction des macrophages phagocytiques et (E) indice phagocytic/intensité verte par macrophage phagocytique dans les traitements macrophage naïfs et polarisés 175 min après l’ajout de perles (n - 12 expériences biologiquement indépendantes, ANOVA à sens unique et comparaisons multiples de Holm-Sidak après le test. Les groupes polarisés étaient statistiquement comparés au groupe naïf seulement). Les parcelles montrent la valeur moyenne et les barres d’erreur représentent l’écart standard (p 'lt; 0.05, 'p 'lt; 0.01, 'p 'lt; 0.001, 'p 'lt; 0.0001). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Le protocole pour la génération d’iPSC-DMs décrit ici est robuste et permet la production d’un grand nombre de cellules homogènes à partir d’un nombre relativement faible d’iPSC. Après la différenciation initiale d’environ 1 x 106 iPSCs, les cultures suivantes peuvent être récoltées tous les 4 jours pendant un mois allant jusqu’à 2 à 3 mois, ce qui entraîne la production d’au moins 6,5 x 107 macrophages au cours de cette période. Ces macrophages humains générés in vitro sont morphologiquement semblables aux macrophages humains primaires, expriment les marqueurs clés de surface de cellules de macrophage, et présentent l’activité phagocytic. Le protocole de différenciation du macrophage est reproductible et peut être appliqué à d’autres lignées cellulaires hiPSC et hESC, mais le moment précis de la première récolte des précurseurs macrophage et le nombre absolu de cellules qui peuvent être générées varie entre les lignes iPSC.
Il a été démontré que les macrophages peuvent être générés à partir d’iPSCs qui ont été génétiquement manipulés. Par exemple, une cassette transgène composée du journaliste fluorescent ZsGreen sous le contrôle du promoteur constitutif CAG a été insérée dans le locus AAVS1 de la ligne SFCi55 iPSC, et il a été démontré par la suite que cette ligne iPSC pouvait être différenciée en macrophages8. Ces macrophages fluorescents pourraient être utilisés à l’avenir pour suivre la migration et la stabilité des macrophages thérapeutiques dans les modèles de maladie. Dans une autre étude, des macrophages ont été générés à partir d’une lignée iPSC qui avait été génétiquement manipulée pour exprimer un facteur de transcription induit par le tamoxifène, KLF1. L’activation de KLF1 dans les macrophages iPSC-dérivés a eu comme conséquence la production des macrophages avec un phénotype comparable aux macrophages de l’île érythroide9. Potentiellement, cette stratégie pourrait être utilisée pour programmer génétiquement les macrophages dérivés de l’iPSC dans des phénotypes associés à d’autres populations de macrophage spécifiques aux tissus telles que les cellules Kupffer du foie ou les cellules Langerhans de la peau. Cela serait possible une fois que les principaux facteurs de transcription qui définissent ces types de cellules sont identifiés.
En ce qui concerne le protocole, il est très important de noter que l’état de la population de départ des CISPS est essentiel pour une différenciation réussie. Les cultures iPSC humaines peuvent être envahies par des sous-populations karyotypically anormales sur plusieurs passages, de sorte que la curation robuste des stocks d’iPSC et de grands stocks de maître de lot soumis au contrôle de la qualité du génome est recommandée. Dans nos mains, les protocoles d’entretien décrits ici peuvent maintenir des iPSCs karyotypiquement normaux pendant jusqu’à 2 mois dans la culture continue, mais cela peut varier pour différentes lignées cellulaires et dans différents laboratoires. Si des problèmes sont rencontrés, il est conseillé d’utiliser une flacon frais d’iPSC indifférents pour chaque expérience de différenciation. En outre, la culture de départ des IPSC indifférents ne devrait pas être plus de 80% confluent. Au stade du placage EB, seulement 10 à 15 EB doivent être plaqués par puits d’une plaque de culture de tissu de puits de 6, et il est essentiel que ces EB soient répartis uniformément sur le puits. Un plus grand nombre d’EB et/ou d’agglutination des EB au centre du puits a eu un effet négatif sur le nombre de macrophages générés. Il faut faire attention lors de la reconstitution des supports et de la récolte des cellules de suspension de progéniteurs monocytes des cultures EB afin d’éviter de perturber l’adhérence des EB à la surface des plaques de culture enduites. Le nombre de cellules de suspension hématopoïétique produites augmente progressivement à chaque récolte, avec une production optimale entre les jours 40-72 de différenciation(figure 2). La production diminue progressivement après le jour 68 et les plaques ont tendance à s’épuiser après 2,5 mois, bien que le moment précis puisse varier en fonction de la ligne iPSC.
Une limitation de notre protocole est qu’il n’a pas été possible de cryopréserver les cellules de suspension hématopoïétique générées à la fin de l’étape 2. Protocoles qui s’appuient sur l’activation exogène du rapport WNT sur un taux de récupération de 40% après cryoconservation, mais ces protocoles ne rapportent qu’une seule récolte cellulaire, de sorte que le nombre absolu de macrophages générés est faible30. Le protocole décrit ici, induisant la signalisation endogène par la formation d’EBs, peut être récolté deux semaines, produisant un rendement macrophage total beaucoup plus élevé.
En résumé, nous présentons un protocole détaillé pour la production de macrophages fonctionnels dérivés d’iPSC. La mise en place d’expériences in vitro avec des macrophages dérivés de l’iPSC pour étudier la biologie du macrophage dans la santé et la maladie présente de nombreux avantages par rapport aux expériences avec des macrophages dérivés du monocyte (MDM). Ces avantages comprennent la facilité d’accessibilité au matériau (p. ex., aucun donneur n’est nécessaire), de très grandes quantités de macrophages peuvent être produites, et il est faisable et relativement simple de produire des macrophages génétiquement modifiés. En outre, les macrophages dérivés d’iPSC pourraient être une meilleure ressource pour l’étude de la biologie de macrophage tissulaire-résident.
Disclosures
Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Nous remercions Fiona Rossi et Claire Cryer pour leur aide à la cytométrie des débits, Eoghan O’Duibhir et Bertrand Vernay avec microscopie. Ces travaux ont été financés par CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) et Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust DoctorD studentship (A.M), MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. et J.W.P. ont reçu l’appui de Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), du Medical Research Council (MR/N022556/1) et de COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350010 | |
| Abtibody CD64-APC -CY7 | Biolegend | 305026 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody 25F9-EFLUOR 660 | Ebioscience | 15599866 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CCR2-PE-Cy7 | Biolegend | 357212 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR5 PE | Biolegend | 313707 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR8 PE | Biolegend | 360603 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD11b-PE | Biolegend | 301305 | Dilution factor: 1:50 |
| Antibody CD14-APC | Ebioscience | 10669167 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD163-PE-CY7 | BIolegend | 333614 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD169-APC | Biolegend | 346007 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD206-PE | Biolegend | 321106 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD209-PE-CY7 | Biolegend | 3310114 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD274-PE-CY7 | Biolegend | 329718 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD43-PE | Ebioscience | 10854419 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD45-APC | Ebioscience | 15577936 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD86-APC | Biolegend | 305412 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD93-PE | Ebioscience | 10804637 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CX3CR1-PE | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody HLA-DR-BV650 | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antiboy CD115-PE | Biolegend | 347308 | Dilution factor: 1:40 |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme free | Thermofisher | 13151014 | |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS | Gibco | 13151014 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well | PerkinElmer | 6055302 | |
| CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain | Thermofisher | C10046 | Cryopreservation media |
| Cryostor CS10 | Sigma | C2874 | |
| CTS CELLstart Substrate | Invitrogen | A1014201 | Stem cell substrate |
| DAPI | Merck | D9542-1MG | Final concentration 1 μg/mL |
| DPBS, calcium, magnesium (500 mL) | Thermofisher | 14040091 | |
| FcR Blocking Reagent, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHG0021 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IFNY | Thermofisher | 14-8319-80 | |
| Human Serum Albuminum | Irvine Scientific | 9988 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli | Sigma | L2630 | |
| NucBlue (Hoechst33342) | Thermofisher | R37605 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis | Thermofisher | P35365 | |
| Porcine Skin Gelatin | Sigma | G9136 | |
| Recombinant Human BMP4 Protein | R&D | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human IL10 | Preprotech | 200-10 | |
| Recombinant Human IL3 | Preprotech | 200-03-10 | |
| Recombinant Human IL4 | Preprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100 μg | Biolegend | 574806 | |
| Recombinant Human VEGF Protein | R&D | 293-VE-010 | |
| Rock Inhibitor Y-27632 | Merck | SCM075 | |
| SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHC2111 | |
| StemPro hESC SFM | Thermofisher | A1000701 | |
| StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | Thermofisher | 23181010 | |
| Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface | Greiner | 657970 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| X-Vivo 15 500 mL bottle | Lonza | BE02-060F |
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