यह प्रोटोकॉल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से मैक्रोफेज की मजबूत पीढ़ी का वर्णन करता है, और उनके बाद लक्षण वर्णन के लिए तरीकों । सेल सरफेस मार्कर अभिव्यक्ति, जीन अभिव्यक्ति, और कार्यात्मक परख का उपयोग इन आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के फेनोटाइप और कार्य का आकलन करने के लिए किया जाता है।
मैक्रोफेज अधिकांश कशेरुकी ऊतकों में मौजूद हैं और विभिन्न कार्यों के साथ व्यापक रूप से फैले और विषम कोशिका आबादी शामिल हैं। वे स्वास्थ्य और रोग में प्रमुख खिलाड़ी हैं, प्रतिरक्षा रक्षा और मध्यस्थता ट्रोफिक, रखरखाव और मरम्मत कार्यों के दौरान फागोसाइट्स के रूप में कार्य करते हैं। हालांकि मानव मैक्रोफेज फ़ंक्शन में शामिल कुछ आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करना संभव हो पाया है, लेकिन प्राथमिक मानव मैक्रोफेज के लिए जेनेटिक इंजीनियरिंग तकनीकों को लागू करना मुश्किल साबित हुआ है। इससे मैक्रोफेज जीव विज्ञान में शामिल जटिल आनुवंशिक रास्तों से पूछताछ करने और विशिष्ट रोग राज्यों के लिए मॉडल उत्पन्न करने की हमारी क्षमता में काफी बाधा आई है । मानव मैक्रोफेज का एक ऑफ-द-शेल्फ स्रोत जो आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों के विशाल शस्त्रागार के लिए उत्तरदायी है, इसलिए, इस क्षेत्र में एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करेगा। हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो विट्रो में मानव प्रेरित प्लुरिटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से मैक्रोफेज की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। ये आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (आईपीएससी-डीएम) सीडी45, 25F9, CD163 और CD169 सहित मानव मैक्रोफेज सेल सतह मार्कर व्यक्त करते हैं, और हमारे लाइव-सेल इमेजिंग कार्यात्मक परख दर्शाता है कि वे मजबूत फागोसाइटिक गतिविधि प्रदर्शित करते हैं। सुसंस्कृत आईपीएससी-डीएम को विभिन्न मैक्रोफेज राज्यों में सक्रिय किया जा सकता है जो एलपीएस और आईएफएनजी, आईएल4 या आईएल10 के अलावा परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति और फागोसाइटिक गतिविधि प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार, यह प्रणाली आनुवंशिक परिवर्तन ों को ले जाने वाले मानव मैक्रोफेज उत्पन्न करने के लिए एक मंच प्रदान करती है जो विशिष्ट मानव रोग को मॉडल करती है और इन बीमारियों के इलाज के लिए दवा स्क्रीनिंग या सेल थेरेपी के लिए कोशिकाओं का स्रोत है।
भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएससी) और प्रेरित प्लुरीपोटस्टेम सेल (आईपीएससी) एक आत्म-नवीनीकरण सेल स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसे सभी तीन रोगाणु परत वंश की कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए विभेदित किया जा सकता है। मानव प्लुरिटेंट स्टेम सेल (पीएससी) जैसे जिंक फिंगर न्यूलीज, टीएलेंस और CRISPR-Cas9 के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देने वाली प्रौद्योगिकियों ने चिकित्सा अनुसंधान1,,2,,3,,4में क्रांति ला दी है। मानव पीएससी का आनुवंशिक हेरफेर एक विशेष रूप से आकर्षक रणनीति है जब ब्याज की प्राथमिक कोशिका का विस्तार करना और/या इन विट्रो को बनाए रखना मुश्किलहोता है, या आनुवंशिक रूप से हेरफेर करना मुश्किल होता है, जैसे मैक्रोफेज5,,6,,7,,8,99का मामला है । चूंकि मानव आईपीएससी को किसी भी दैहिक कोशिका से प्राप्त किया जा सकता है, इसलिए वे ईएससीएस से जुड़ी नैतिक सीमाओं को दरकिनार करते हैं, और व्यक्तिगत दवा देने के लिए एक रणनीति प्रदान करते हैं। इसमें रोगी-विशिष्ट रोग मॉडलिंग, दवा परीक्षण और ऑटोलॉगस सेल थेरेपी शामिल है, जिसमें प्रतिरक्षा अस्वीकृति और संक्रमण6,,8,,10,,11का कम जोखिम है।
आईपीएससी से मैक्रोफेज की पीढ़ी का वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल में तीन चरण की प्रक्रिया शामिल है जिसमें शामिल हैं: 1) भ्रूणीय निकायों की पीढ़ी; 2) निलंबन में हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं का उद्भव; 3) टर्मिनल मैक्रोफेज परिपक्वता।
भ्रूणीय निकायों (ईबी) के रूप में जाना जाने वाला त्रि-आयामी समुच्य का गठन आईपीएससी के भेदभाव की शुरुआत करता है। मेसोडर्म स्पेसिफिकेशन को चलाने और उभरते हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं7,,8,,9,,11,,12को समर्थन देने के लिए बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी4), स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ), और वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) जोड़ा जाता है । ईबी के भीतर विभेदित कोशिकाएं एनडब्ल्यूटी और एक्टिविन जैसे एंडोजेनस सिग्नलिंग रास्तों की सक्रियता भी शुरू करती हैं। कुछ विभेदन प्रोटोकॉल ईबी गठन के चरण से नहीं गुजरते हैं। इन मामलों में, डब्ल्यूएनटी और एक्टिविन सिग्नलिंग नियामक, जैसे कि रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन एक्टिविन ए और/या चिरोन को मोनोलेयर फॉर्मेट13,,14,,15में आईपीएससी में अंतर करने में जोड़ा जाता है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित करते हैं जो ईबी गठन का उपयोग करता है। भेदभाव के दूसरे चरण के लिए, ईबीएस को एक अनुयायी सतह पर चढ़ाया जाता है। इन संलग्न कोशिकाओं को तब साइटोकिन्स के संपर्क में रखा जाता है जो निलंबन कोशिकाओं के उद्भव को बढ़ावा देते हैं जिनमें हेमेटोपोइटिक और माइलॉयड जनक शामिल हैं। इन इन विट्रो संस्कृति स्थितियों में, इंटरल्यूकिन-3 (आईएल 3) की संभावना हेमेटोपोइटिक स्टेम-प्रोजेनिटर सेल गठन और प्रसार16,,17,साथ ही माइलॉयड अग्रदूत प्रसार और विभेदन18का समर्थन करती है। मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (CSF1) माइलॉयड कोशिकाओं के उत्पादन और मैक्रोफेज19,,20के लिए उनके भेदभाव का समर्थन करता है । भेदभाव के तीसरे चरण के दौरान, इन निलंबन कोशिकाओं को टर्मिनल मैक्रोफेज परिपक्वता का समर्थन करने के लिए CSF1 की उपस्थिति में सुसंस्कृत किया जाता है।
विट्रो में मैक्रोफेज में मानव आईपीएससी का भेदभाव विकास के दौरान मैक्रोफेज उत्पादन की प्रारंभिक लहर की नकल करता है। ऊतक-निवासी मैक्रोफेज भ्रूण उत्पत्ति के दौरान स्थापित होते हैं और वयस्क मोनोसाइट्स से एक अलग विकासात्मक वंश होते हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि आईपीएससी-डीएम के पास एक जीन हस्ताक्षर है जो रक्त-व्युत्पन्न मोनोसाइट्स की तुलना में भ्रूण यकृत मैक्रोफेज के बराबर है, जिससे यह सुझाव दिया गया है कि आईपीएससी-डीएम ऊतक-निवासी मैक्रोफेज के समान हैं । आईपीएससी-डीएम जीन के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं जो ऊतक रीमॉडलिंग और एंजियोजेनेसिस में शामिल प्रोटीन के स्राव के लिए एन्कोड करते हैं और प्रो-भड़काऊ साइटोकिन स्राव और एंटीजन प्रस्तुति गतिविधियों21,22के लिए एन्कोडिंग जीन के निचले स्तर को व्यक्त करते हैं । इसके अलावा, आईपीएससी-डीएम के पास ऊतक-निवासी मैक्रोफेज23,,24के लिए एक अनुरूप प्रतिलेखन कारक की आवश्यकता है। नॉकआउट आईपीएससी सेल लाइनों का उपयोग करना जो ट्रांसक्रिप्शन कारकों RUNX1, SPI1 (PU.1) और MYB, Buchrieser एट अल में कमी कर रहे हैं, ने दिखाया कि आईपीएससी-डीएम की पीढ़ी SPI1 और RUNX1 निर्भर है, लेकिन MYB स्वतंत्र है। यह इंगित करता है कि वे23विकास के दौरान हेमेटोपोइसिस की पहली लहर के दौरान उत्पन्न होने वाले जर्क-थैली व्युत्पन्न मैक्रोफेज के समान हैं। इसलिए, यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि आईपीएससी-डीएम ऊतक-निवासी मैक्रोफेज जैसे माइक्रोग्लिया14,,25 और कुफर कोशिकाओं11का अध्ययन करने के लिए अधिक उपयुक्त सेल मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, और कोशिकाओं का एक अधिक वांछनीय स्रोत है जिसका उपयोग ऊतकों की मरम्मत के लिए उपचारों में संभवतः किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि माउस ईएससीएस से विट्रो में उत्पादित मैक्रोफेज वीवो11में सीसीएल 4-प्रेरित यकृत चोट मॉडल में फाइब्रोसिस को सुधारने में प्रभावी थे। इसके अलावा, ये ईएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज चूहों में लिपोसोमल क्लोड्रेनेट11 का उपयोग करके मैक्रोफेज के समाप्त कुफर सेल डिब्बों को फिर से आबाद करने में बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की तुलना में अधिक कुशल थे।
यहां, हम मानव आईपीएससी के रखरखाव, ठंड और विगलन के लिए सीरम और फीडर-मुक्त प्रोटोकॉल और कार्यात्मक मैक्रोफेज में इन आईपीएससी के भेदभाव के लिए वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल वैन विल्गेनबर्ग एट अल.12द्वारा वर्णित के समान है, जिसमें मामूली परिवर्तन शामिल हैं: 1) आईपीएससी-रखरखाव मीडिया; 2) ईबी गठन चरण में रॉक अवरोधक का उपयोग नहीं किया जाता है; 3) आईपीएससी कॉलोनियों से समान ईबी उत्पन्न करने के लिए एक एंजाइमैटिक दृष्टिकोण के बजाय एक यांत्रिक दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है; 4) ईबी फसल और चढ़ाना के लिए विधि अलग है; 5) निलंबन कोशिकाओं को साप्ताहिक के बजाय एक सप्ताह में 2x काटा जाता है; और 6) काटा निलंबन कोशिकाओं को 7 दिनों के बजाय 9 दिनों के लिए मैक्रोफेज परिपक्वता के लिए CSF1 के तहत सुसंस्कृत हैं। हम आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज फेनोटाइप और फंक्शन की विशेषता के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल ों का भी वर्णन करते हैं, जिसमें जीन अभिव्यक्ति (क्यूआरटी-पीसीआर), सेल सरफेस मार्कर अभिव्यक्ति (प्रवाह साइटोमेट्री) के लिए विश्लेषण और फागोसाइटोसिस और ध्रुवीकरण का आकलन करने के लिए कार्यात्मक परख शामिल हैं।
यहां वर्णित आईपीएससी-डीएम की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल मजबूत है और अपेक्षाकृत कम संख्या में आईपीएससी से बड़ी संख्या में सजातीय कोशिकाओं के उत्पादन के लिए अनुमति देता है । लगभग 1 x 106 आईपीएससी के प्रारंभिक भेदभाव के बाद, बाद की संस्कृतियों को 2-3 महीनों तक हर 4 दिनों में काटा जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उस समय कम से कम 6.5 x 107 मैक्रोफेज का उत्पादन होता है। ये इन-जेनरेटेड ह्यूमन मैक्रोफेज प्राथमिक मानव मैक्रोफेज के समान रूप से हैं, प्रमुख मैक्रोफेज सेल सतह मार्कर को व्यक्त करते हैं, और फागोसाइटिक गतिविधि का प्रदर्शन करते हैं। मैक्रोफेज भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल प्रजनन योग्य है और अन्य hiPSC और एचएसएससी सेल लाइनों पर लागू किया जा सकता है, लेकिन मैक्रोफेज अग्रदूत की पहली फसल का सटीक समय और उत्पन्न की जा सकने वाली कोशिकाओं की पूर्ण संख्या आईपीएससी लाइनों के बीच भिन्न होती है।
यह दर्शाया गया है कि आईपीएससी से मैक्रोफेज उत्पन्न किए जा सकते हैं जिन्हें आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया गया है। उदाहरण के लिए, संविलियन कैग प्रमोटर के नियंत्रण में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जेडएसग्रीन से मिलकर एक ट्रांसजीन कैसेट को SFCi55 iPSC लाइन के AAVS1 लोकस में डाला गया था, और बाद में यह दिखाया गया कि इस आईपीएससी लाइन को जेडग्रीन-व्यक्त मैक्रोफेज8में अंतर किया जा सकता है । इन फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज का उपयोग भविष्य में रोग के मॉडलमें चिकित्सीय मैक्रोफेज के प्रवास और स्थिरता को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। एक अन्य अध्ययन में, मैक्रोफेज एक आईपीएससी लाइन से उत्पन्न हुए थे जिसे टैमोक्सिफेन-प्रेरित ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर, KLF1 को व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया गया था। आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में केएलएफ1 की सक्रियता के परिणामस्वरूप एरिथ्रोइड द्वीप9के मैक्रोफेज के बराबर फेनोटाइप के साथ मैक्रोफेज का उत्पादन हुआ। संभवतः, इस रणनीति का उपयोग आनुवंशिक रूप से आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज को अन्य ऊतक-विशिष्ट मैक्रोफेज आबादी जैसे जिगर की कुफर कोशिकाओं या त्वचा की लैंगरहंस कोशिकाओं से जुड़े फेनोटाइप में प्रोग्राम करने के लिए किया जा सकता है। इन सेल प्रकारों को परिभाषित करने वाले प्रमुख प्रतिलेखन कारकों की पहचान किए जाने के बाद यह संभव होगा।
प्रोटोकॉल के लिहाज से यह ध्यान रखना बेहद जरूरी है कि सफल भेदभाव के लिए आईपीएससी की शुरुआती आबादी की हालत नाजुक है। मानव आईपीएससी संस्कृतियों को कई मार्गों पर कायोआम असामान्य उपआबादी के साथ उग आ सकता है, इसलिए आईपीएससी स्टॉक और जीनोम गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन बड़े बैच मास्टर स्टॉक के मजबूत क्यूरेशन की सिफारिश की जाती है। हमारे हाथों में, यहां वर्णित रखरखाव प्रोटोकॉल निरंतर संस्कृति में 2 महीने तक के लिए karyoआम तौर पर सामान्य आईपीएससी बनाए रख सकते हैं, लेकिन यह विभिन्न सेल लाइनों और विभिन्न प्रयोगशालाओं के लिए भिन्न हो सकता है। यदि समस्याओं का सामना करना पड़ता है, तो प्रत्येक विभेदन प्रयोग के लिए अविभेदित आईपीएससी की एक ताजा शीशी का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, अविभेदित आईपीएससी की प्रारंभिक संस्कृति 80% से अधिक अभिप्रवाह नहीं होनी चाहिए। ईबी चढ़ाना चरण में, केवल 10-15 ईबी को 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रति अच्छी तरह से चढ़ाया जाना चाहिए, और यह महत्वपूर्ण है कि ये ईबी समान रूप से अच्छी तरह से फैले हुए हैं। अच्छी तरह से केंद्र में ईबी की अधिक संख्या और/या झुरमुट का उत्पन्न मैक्रोफेज की संख्या पर नकारात्मक प्रभाव पड़ा । ध्यान रखा जाना चाहिए जब मीडिया की भरपाई और ईबी संस्कृतियों से मोनोसाइट की तरह जनक निलंबन कोशिकाओं की कटाई के लिए लेपित संस्कृति प्लेटों की सतह के लिए EBs के आसंजन परेशान से बचने के लिए । प्रत्येक फसल के साथ धीरे-धीरे उत्पादित हेमेटोपोइटिक निलंबन कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है, जिसमें भेदभाव के 40-72 दिनों के बीच इष्टतम उत्पादन होता है(चित्रा 2)। उत्पादन उत्तरोत्तर दिन ६८ और प्लेटों के बाद गिरावट आती है २.५ महीने के बाद निकास करते हैं, हालांकि सटीक समय iPSC लाइन के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
हमारे प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि स्टेज 2 के अंत में उत्पन्न हेमेटोपोइटिक निलंबन कोशिकाओं को क्रायोसंरक्षित करना संभव नहीं हो पाया है। प्रोटोकॉल जो क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद 40% वसूली दर के बारे में डब्ल्यूएनटी रिपोर्ट के एक्सोजेनस सक्रियण पर भरोसा करते हैं, लेकिन ये प्रोटोकॉल केवल एक सेल फसल की रिपोर्ट करते हैं, इसलिए उत्पन्न मैक्रोफेज की पूर्ण संख्याकम 30है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल, ईबी के गठन के माध्यम से एंडोजेनस सिग्नलिंग को प्रेरित करते हुए, द्विसाप्ताहिक काटा जा सकता है, जिससे बहुत अधिक कुल मैक्रोफेज उपज का उत्पादन होता है।
सारांश में, हम कार्यात्मक आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं। स्वास्थ्य और रोग में मैक्रोफेज जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के साथ इन विट्रो प्रयोगों की स्थापना मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एमडीएम) के साथ प्रयोगों पर कई फायदे हैं । इन फायदों में सामग्री तक पहुंच में आसानी (उदाहरण के लिए, किसी दानदाताओं की आवश्यकता नहीं है), बहुत बड़ी मात्रा में मैक्रोफेज का उत्पादन किया जा सकता है, और आनुवंशिक रूप से संशोधित मैक्रोफेज का उत्पादन करना संभव और अपेक्षाकृत सरल है। इसके अलावा, आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज ऊतक-निवासी मैक्रोफेज जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए बेहतर संसाधन हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लो साइटोमेट्री, इओघन ओ ‘डुइथिर और बर्ट्रेंड वर्ने के साथ सहायता के लिए फियोना रॉसी और क्लेयर क्रायर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को CONACYT (M.L.-Y.), वेलकम ट्रस्ट (१०२६१०) और इनोवेट यूके (एल.एम.एफ.), वेलकम ट्रस्ट पीएचडी स्टूडेंटशिप (ए.एम.एम.), एमआरसी प्रिसिजन मेडिसिन स्टूडेंटशिप (टीवी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । एलसी और J.W.P. वेलकम ट्रस्ट (101067/जेड/13/जेड), मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एमआर/N022556/1), और कॉस्ट एक्शन BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu) द्वारा समर्थित थे ।
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350010 | |
Abtibody CD64-APC -CY7 | Biolegend | 305026 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody 25F9-EFLUOR 660 | Ebioscience | 15599866 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CCR2-PE-Cy7 | Biolegend | 357212 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CCR5 PE | Biolegend | 313707 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CCR8 PE | Biolegend | 360603 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD11b-PE | Biolegend | 301305 | Dilution factor: 1:50 |
Antibody CD14-APC | Ebioscience | 10669167 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CD163-PE-CY7 | BIolegend | 333614 | Dilution factor: 1:25 |
Antibody CD169-APC | Biolegend | 346007 | Dilution factor: 1:25 |
Antibody CD206-PE | Biolegend | 321106 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD209-PE-CY7 | Biolegend | 3310114 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD274-PE-CY7 | Biolegend | 329718 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD43-PE | Ebioscience | 10854419 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD45-APC | Ebioscience | 15577936 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CD86-APC | Biolegend | 305412 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD93-PE | Ebioscience | 10804637 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CX3CR1-PE | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody HLA-DR-BV650 | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
Antiboy CD115-PE | Biolegend | 347308 | Dilution factor: 1:40 |
Cell Dissociation Buffer, enzyme free | Thermofisher | 13151014 | |
Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS | Gibco | 13151014 | |
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well | PerkinElmer | 6055302 | |
CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain | Thermofisher | C10046 | Cryopreservation media |
Cryostor CS10 | Sigma | C2874 | |
CTS CELLstart Substrate | Invitrogen | A1014201 | Stem cell substrate |
DAPI | Merck | D9542-1MG | Final concentration 1 μg/mL |
DPBS, calcium, magnesium (500ml) | Thermofisher | 14040091 | |
FcR Blocking Reagent, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHG0021 | |
GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
Human Recombinant IFNY | Thermofisher | 14-8319-80 | |
Human Serum Albuminum | Irvine Scientific | 9988 | |
Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli | Sigma | L2630 | |
NucBlue (Hoechst33342) | Thermofisher | R37605 | |
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis | Thermofisher | P35365 | |
Porcine Skin Gelatin | Sigma | G9136 | |
Recombinant Human BMP4 Protein | R&D | 314-BP-010 | |
Recombinant Human IL10 | Preprotech | 200-10 | |
Recombinant Human IL3 | Preprotech | 200-03-10 | |
Recombinant Human IL4 | Preprotech | 200-04 | |
Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100ug | Biolegend | 574806 | |
Recombinant Human VEGF Protein | R&D | 293-VE-010 | |
Rock Inhibitor Y-27632 | Merck | SCM075 | |
SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHC2111 | |
StemPro hESC SFM | Thermofisher | A1000701 | |
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | Thermofisher | 23181010 | |
Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface | Greiner | 657970 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
X-Vivo 15 500 mL bottle | Lonza | BE02-060F |