Denne protokollen beskriver den robuste generasjonen makrofager fra humane induserte pluripotente stamceller, og metoder for deres påfølgende karakterisering. Celleoverflatemarkøruttrykk, genuttrykk og funksjonelle analyser brukes til å vurdere fenotypen og funksjonen til disse iPSC-avledede makrofagene.
Makrofager er tilstede i de fleste virveldyrvev og består av vidt spredte og heterogene cellepopulasjoner med forskjellige funksjoner. De er sentrale aktører i helse og sykdom, fungerer som phagocytes under immunforsvar og mediering trofisk, vedlikehold, og reparasjon funksjoner. Selv om det har vært mulig å studere noen av de molekylære prosessene som er involvert i menneskelig makrofagfunksjon, har det vist seg vanskelig å anvende gentekniske teknikker på primære menneskelige makrofager. Dette har betydelig hindret vår evne til å avhøre de komplekse genetiske veiene som er involvert i makrofagbiologi og å generere modeller for spesifikke sykdomstilstander. En off-the-shelf kilde til menneskelige makrofager som er mottagelig for det store arsenalet av genetiske manipulasjonsteknikker, vil derfor gi et verdifullt verktøy på dette feltet. Vi presenterer en optimalisert protokoll som gjør det mulig for generering av makrofager fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCer) in vitro. Disse iPSC-avledede makrofagene (iPSC-DMs) uttrykker menneskelige makrofagcelleoverflatemarkører, inkludert CD45, 25F9, CD163 og CD169, og vår funksjonelle analyse av live-cellebilder viser at de viser robust fagocytisk aktivitet. Kultiverte iPSC-DMs kan aktiveres til forskjellige makrofagtilstander som viser endret genuttrykk og fagocytisk aktivitet ved tillegg av LPS og IFNg, IL4 eller IL10. Dermed gir dette systemet en plattform for å generere menneskelige makrofager som bærer genetiske endringer som modellerer spesifikk menneskelig sykdom og en kilde til celler for legemiddelscreening eller celleterapi for å behandle disse sykdommene.
Embryonale stamceller (ESCer) og indusertpluripotente stamceller (iPSCer) representerer en selvfornyende cellekilde som kan differensieres for å produsere celler av alle tre bakterielagslinjer. Teknologier som tillater genetisk manipulering av humane pluripotente stamceller (PSCer), som Zinc Finger Nuclease, TALENS og CRISPR-Cas9, har revolusjonert medisinsk forskning1,2,3,4.4 Genetisk manipulering av menneskelige PSCer er en spesielt attraktiv strategi når den primære cellen av interesse er vanskelig å utvide og / eller å opprettholde in vitro, eller er vanskelig å genetisk manipulere, slik som er tilfelle for makrofager5,6,7,8,9. Siden menneskelige iPSCer kan utledes fra en hvilken somhelst somatiske celle, omgår de de etiske begrensningene knyttet til EsCer, og gir en strategi for å levere personlig medisin. Dette inkluderer pasientspesifikk sykdomsmodellering, legemiddeltesting og autolog cellebehandling med redusert risiko for immunavvisning og infeksjon6,,8,10,11.
Protokoller som beskriver generering av makrofager fra iPSCer består av en tre-trinns prosess som inkluderer: 1) Generasjon embryoid organer; 2) Fremveksten av hematopoetiske celler i suspensjon; 3) Terminal makrofag modning.
Dannelsen av tredimensjonale aggregater, kjent som embryoidlegemer (EBs) initierer differensiering av iPSCer. Bone morfogenetisk protein (BMP4), stamcellefaktor (SCF) og vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) legges til for å drive mesoderm spesifikasjon og støtte nye hematopoetiske celler7,8,9,11,12. Differensierende celler i EBs også initiere aktivering av endogene signalveier som Wnt og Activin. Noen differensieringsprotokoller går ikke gjennom fasen av EB-formasjonen. I disse tilfellene, Wnt og Activin signalregulatorer, for eksempel rekombinant human Activin A og / eller Chiron legges til differensierende iPSCer i en monolayer format13,14,15. Her fokuserer vi på en protokoll som bruker EB-dannelse. For det andre trinnet av differensiering er EBs belagt på en tilhengeroverflate. Disse vedlagte cellene blir deretter utsatt for cytokiner som fremmer fremveksten av suspensjonsceller som inkluderer hematopoietiske og myeloide stamceller. I disse in vitro kulturforhold, interleukin-3 (IL3) støtter sannsynligvis hematopoietisk stem-stamcelledannelse og spredning16,17, samt myeloid forløpere spredning og differensiering18. Makrofagkolonistimulerende faktor (CSF1) støtter produksjon av myeloide celler og differensiering til makrofager19,,20. I løpet av den tredje fasen av differensiering dyrkes disse suspensjonscellene i nærvær av CSF1 for å støtte terminal makrofagmodning.
Differensieringen av menneskelige iPSCer til makrofager in vitro etterligner den tidlige bølgen av makrofagproduksjon under utvikling. Vevsbosatte makrofager er etablert under embryogenese og har en distinkt utviklingsavstamning fra voksne monocytter. Flere studier har vist at iPSC-DMs har en gensignatur som er mer sammenlignbar med føtale leveravledede makrofager enn blodavledede monocytter, noe som tyder på at iPSC-DMs er mer beslektet med vevsbosatte makrofager. iPSC-DMs uttrykker høyere nivåer av gener som koder for sekresjon av proteiner som er involvert i vevsmodellering og angiogenese og uttrykker lavere nivåer av gener koding for pro-inflammatorisk cytokin sekresjon og antigen presentasjonaktiviteter21,22. I tillegg har iPSC-DMs et analogt transkripsjonsfaktorkrav til vevsbosatte makrofager23,24. Ved hjelp av knockout iPSC cellelinjer som er mangelfulli transkripsjonsfaktorene RUNX1, SPI1 (PU.1) og MYB, viste Buchrieser et al. at genereringen av iPSC-DMs er SPI1 og RUNX1 avhengig, men MYB uavhengig. Dette indikerer at de er transkripsjonsmessig lik eggeplomme-sac avledet makrofager som genereres under den første bølgen av hematopoiesis under utvikling23. Derfor er det allment akseptert at iPSC-DMs representerer en mer hensiktsmessig cellemodell for å studere vevsbosatte makrofager som microglia14,,25 og Kupffer celler11, og en mer ønskelig kilde til celler som potensielt kan brukes i terapifor å reparere vev. For eksempel har det blitt vist at makrofager produsert in vitro fra mus ESCer var effektive i å lindre fibrose i en CCl4-indusert leverskademodell in vivo11. Videre var disse ESC-avledede makrofagene mer effektive enn benmargsavledede makrofager ved å repopulating Kupffer cellerom utarmet av makrofager ved hjelp av liposomal klomtrenate11 hos mus.
Her beskriver vi serum- og materfrie protokoller for vedlikehold, frysing og tining av menneskelige iPSCer, og for differensiering av disse iPSCene til funksjonelle makrofager. Denne protokollen er svært lik den som beskrives av Van Wilgenburg et al.12, med mindre endringer, inkludert: 1) iPSC-vedlikeholdsmedier; 2) ROCK-hemmer brukes ikke i EB-formasjonsstadiet; 3) En mekanisk tilnærming i stedet for en enzymatisk tilnærming brukes til å generere ensartede EBer fra iPSC kolonier; 4) Metoden for EB høsting og plating ned er annerledes; 5) Suspensjon celler høstes 2x i uken, snarere enn ukentlig; og 6) Høstet suspensjon celler er kultivert under CSF1 for makrofag modning i 9 dager i stedet for 7 dager. Vi beskriver også protokoller som brukes til å karakterisere iPSC-avledede makrofagfenotype og funksjon, inkludert analyser for genuttrykk (qRT-PCR), celleoverflatemarkøruttrykk (flow cytometri) og funksjonelle analyser for å vurdere phagocytose og polarisering.
Protokollen for generering av iPSC-DMs beskrevet her er robust og tillater produksjon av et stort antall homogene celler fra et relativt lite antall iPSCer. Etter den første differensieringen av ca. 1 x 106 iPSCer, kan de påfølgende kulturene høstes hver fjerde dag i opptil 2–3 måneder, noe som resulterer i produksjon av minst 6,5 x 107 makrofager i løpet av den tiden. Disse in vitro-genererte humane makrofagene er morfologisk lik primære menneskelige makrofager, uttrykker de viktigste makrofagcelleoverflatemarkørene og viser fagocytisk aktivitet. Protokollen for makrofagdifferensiering er reproduserbar og kan brukes på andre hiPSC- og hESC-cellelinjer, men den nøyaktige tidspunktet for den første innhøstingen av makrofagforløperne og det absolutte antallet celler som kan genereres varierer mellom iPSC-linjer.
Det har blitt vist at makrofager kan genereres fra iPSCer som har blitt genetisk manipulert. For eksempel ble en transgenekassett bestående av den fluorescerende reporteren ZsGreen under kontroll av den konstituerende CAG-arrangøren satt inn i AAVS1-locus av SFCi55 iPSC-linjen, og det ble senere vist at denne iPSC-linjen kunne differensieres i ZsGreen-uttrykkende makrofager8. Disse fluorescerende makrofagene kan brukes i fremtiden til å spore migrasjonen og stabiliteten til terapeutiske makrofager i sykdomsmodeller. I en annen studie ble makrofager generert fra en iPSC-linje som hadde blitt genetisk manipulert for å uttrykke en tamoxifen-indusert transkripsjonsfaktor, KLF1. Aktivering av KLF1 i iPSC-avledede makrofager resulterte i produksjon av makrofager med en fenotype som kan sammenlignes med makrofager på den erytroide øya9. Potensielt kan denne strategien brukes til genetisk program iPSC-avledede makrofager i fenotyper forbundet med andre vevsspesifikke makrofagpopulasjoner som Kupffer-celler i leveren eller Langerhans-cellene i huden. Dette ville være mulig når de viktigste transkripsjonsfaktorene som definerer disse celletypene er identifisert.
Når det gjelder protokollen, er det svært viktig å merke seg at tilstanden til startpopulasjonen av iPSCer er avgjørende for vellykket differensiering. Menneskelige iPSC kulturer kan overkjøres med karyotypisk unormale underpopulasjoner over flere passasjer, så robust kurering av iPSC aksjer og store batch master aksjer utsatt for genom kvalitetskontroll anbefales. I våre hender kan vedlikeholdsprotokollene som er beskrevet her, opprettholde karyotypisk normale iPSCer i opptil 2 måneder i kontinuerlig kultur, men dette kan variere for forskjellige cellelinjer og i forskjellige laboratorier. Hvis det oppstår problemer, er det tilrådelig å bruke et nytt hetteglass med udifferensierte iPSCer for hvert differensieringseksperiment. I tillegg bør startkulturen til udifferensierte iPSCer ikke være mer enn 80% konfluent. På EB plating scenen, bare 10-15 EBs bør være belagt per brønn av en 6 brønn vev kultur plate, og det er avgjørende at disse EB er spredt jevnt over brønnen. Et høyere antall EBs og /eller klumping av EB i midten av brønnen hadde en negativ effekt på antall makrofager generert. Det bør utvises forsiktighet ved etterfylling av medier og høsting av monocyttlignende stamceller fra EB-kulturene for å unngå å forstyrre vedhemingen av EB-er til overflaten av de belagte kulturplatene. Antall hematopoetiske suspensjonsceller som produseres gradvis øker med hver høst, med optimal produksjon mellom dag 40–72 differensiering (figur 2). Produksjonen avtar gradvis etter dag 68 og plater har en tendens til å eksos etter 2,5 måneder, selv om den nøyaktige timingen kan variere avhengig av iPSC-linjen.
En begrensning av vår protokoll er at det ikke har vært mulig å kryobevare hematopoietiske suspensjonsceller generert på slutten av trinn 2. Protokoller som er avhengige av eksogene aktivering av WNT rapporterer om en 40% utvinning saterate etter kryopreservation, men disse protokollene rapporterer bare en celle innhøsting, så det absolutte antallmakrofager generert er lav30. Protokollen som er beskrevet her, indusereende endogene signalering via dannelsen av EBs, kan høstes annenhver uke, noe som gir en mye høyere total makrofag utbytte.
Oppsummert presenterer vi en detaljert protokoll for produksjon av funksjonelle iPSC-avledede makrofager. Å sette opp in vitro-eksperimenter med iPSC-avledede makrofager for å studere makrofagbiologi i helse og sykdom har mange fordeler fremfor eksperimenter med monocytt-avledede makrofager (MDMer). Disse fordelene inkluderer enkel tilgjengelighet til materialet (f.eks. ingen givere er nødvendig), svært store mengder makrofager kan produseres, og det er mulig og relativt enkelt å produsere genmodifiserte makrofager. Videre kan iPSC-avledede makrofager være bedre ressurs for studiet av vevsbosatt makrofagbiologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Fiona Rossi og Claire Cryer for hjelp med flow cytometri, Eoghan O’Duibhir og Bertrand Vernay med mikroskopi. Dette arbeidet ble finansiert av CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) og Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD studentship (A.M), MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. og J.W.P. ble støttet av Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) og COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350010 | |
Abtibody CD64-APC -CY7 | Biolegend | 305026 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody 25F9-EFLUOR 660 | Ebioscience | 15599866 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CCR2-PE-Cy7 | Biolegend | 357212 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CCR5 PE | Biolegend | 313707 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CCR8 PE | Biolegend | 360603 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD11b-PE | Biolegend | 301305 | Dilution factor: 1:50 |
Antibody CD14-APC | Ebioscience | 10669167 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CD163-PE-CY7 | BIolegend | 333614 | Dilution factor: 1:25 |
Antibody CD169-APC | Biolegend | 346007 | Dilution factor: 1:25 |
Antibody CD206-PE | Biolegend | 321106 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD209-PE-CY7 | Biolegend | 3310114 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD274-PE-CY7 | Biolegend | 329718 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD43-PE | Ebioscience | 10854419 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD45-APC | Ebioscience | 15577936 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CD86-APC | Biolegend | 305412 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD93-PE | Ebioscience | 10804637 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CX3CR1-PE | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody HLA-DR-BV650 | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
Antiboy CD115-PE | Biolegend | 347308 | Dilution factor: 1:40 |
Cell Dissociation Buffer, enzyme free | Thermofisher | 13151014 | |
Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS | Gibco | 13151014 | |
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well | PerkinElmer | 6055302 | |
CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain | Thermofisher | C10046 | Cryopreservation media |
Cryostor CS10 | Sigma | C2874 | |
CTS CELLstart Substrate | Invitrogen | A1014201 | Stem cell substrate |
DAPI | Merck | D9542-1MG | Final concentration 1 μg/mL |
DPBS, calcium, magnesium (500ml) | Thermofisher | 14040091 | |
FcR Blocking Reagent, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHG0021 | |
GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
Human Recombinant IFNY | Thermofisher | 14-8319-80 | |
Human Serum Albuminum | Irvine Scientific | 9988 | |
Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli | Sigma | L2630 | |
NucBlue (Hoechst33342) | Thermofisher | R37605 | |
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis | Thermofisher | P35365 | |
Porcine Skin Gelatin | Sigma | G9136 | |
Recombinant Human BMP4 Protein | R&D | 314-BP-010 | |
Recombinant Human IL10 | Preprotech | 200-10 | |
Recombinant Human IL3 | Preprotech | 200-03-10 | |
Recombinant Human IL4 | Preprotech | 200-04 | |
Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100ug | Biolegend | 574806 | |
Recombinant Human VEGF Protein | R&D | 293-VE-010 | |
Rock Inhibitor Y-27632 | Merck | SCM075 | |
SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHC2111 | |
StemPro hESC SFM | Thermofisher | A1000701 | |
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | Thermofisher | 23181010 | |
Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface | Greiner | 657970 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
X-Vivo 15 500 mL bottle | Lonza | BE02-060F |