Detta protokoll beskriver den robusta generationen av makrofager från mänskliga inducerad pluripotenta stamceller och metoder för deras efterföljande karakterisering. Cell yta markör uttryck, genuttryck och funktionella analyser används för att bedöma fenotyp och funktion av dessa iPSC-härledda makrofager.
Makrofager finns i de flesta ryggradsdjur vävnader och omfattar allmänt spridda och heterogena cell populationer med olika funktioner. De är nyckelaktörer inom hälsa och sjukdom, fungerar som fagocyter under immunförsvaret och medla trofiska, underhåll och reparationsfunktioner. Även om det har varit möjligt att studera några av de molekylära processer som är involverade i människans makrofagfunktion, har det visat sig svårt att tillämpa genteknik på primära mänskliga makrofager. Detta har avsevärt hämmat vår förmåga att förhöra de komplexa genetiska vägar som är involverade i makrofagbiologi och att generera modeller för specifika sjukdomstillstånd. En off-the-shelf källa till mänskliga makrofager som är mottagliga för den stora arsenal av genetisk manipulation tekniker skulle därför ge ett värdefullt verktyg på detta område. Vi presenterar ett optimerat protokoll som möjliggör generering av makrofager från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) in vitro. Dessa iPSC-härledda makrofager (iPSC-DMs) uttrycker mänskliga makrofag cell yta markörer, inklusive CD45, 25F9, CD163 och CD169 och vår live-cell imaging funktionell analys visar att de uppvisar robust fagocytic aktivitet. Odlade iPSC-DMs kan aktiveras till olika makrofagtillstånd som visar förändrade genuttryck och fagocytisk aktivitet genom tillägg av LPS och IFNg, IL4 eller IL10. Således ger detta system en plattform för att generera mänskliga makrofager som bär genetiska förändringar som modell specifika mänskliga sjukdomar och en källa till celler för läkemedelsscreening eller cellterapi för att behandla dessa sjukdomar.
Embryonala stamceller (ESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) utgör en självförnyande cellkälla som kan differentieras för att producera celler av alla tre könsskiktshärstamningar. Teknik som möjliggör genetisk manipulering av mänskliga pluripotenta stamceller , såsom Zink Finger Nuclease, TALENS och CRISPR-Cas9, har revolutionerat medicinsk forskning1,,2,3,4. Genetisk manipulation av humana privata säkerhetsföretag är en särskilt attraktiv strategi när den primära cellen av intresse är svår att expandera och/eller att upprätthålla in vitro, eller är svår att genetiskt manipulera, såsom är fallet för makrofager5,,6,7,8,9. Eftersom mänskliga iPSC kan härledas från alla somatiska celler, kringgår de etiska begränsningar som är förknippade med ESC, och ger en strategi för att leverera personlig medicin. Detta inkluderar patientspecifik sjukdomsmodellering, drogtester och autolog cellterapi med minskad risk för immunavstötning och infektion6,,8,,10,11.
Protokoll som beskriver generering av makrofager från iPSC består av en trestegsprocess som omfattar: 1) Generering av embryoidkroppar; 2) Uppkomsten av hematopoietiska celler i suspension; 3) Terminal makrofag mognad.
Bildandet av tredimensionella aggregat, så kallade embryoid organ (EBs) initierar differentiering av iPSCs. Benmorfogenetiska protein (BMP4), stamceller faktor (SCF), och vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF) läggs till för att driva mesoderm specifikation och stödja nya hematopoietiska celler7,,8,9,11,12. De differentierande cellerna inom EBs initierar också aktivering av endogena signalvägar som Wnt och Activin. Vissa differentiering protokoll går inte igenom scenen i EB formation. I dessa fall läggs Wnt- och Activin-signalregulatorer, såsom rekombinanta humana Activin A och/eller Chiron, till differentiering av iPSC i ett monolagerformat13,14,15. Här fokuserar vi på ett protokoll som använder EB-formation. För det andra steget av differentiering, EBs är pläterade på en vidhäftning yta. Dessa bifogade celler utsätts sedan för cytokiner som främjar uppkomsten av suspensionsceller som inkluderar hematopoietiska och myeloiska förfäder. I dessa in vitro-odlingsförhållanden stöder interleukin-3 (IL3) sannolikt hematopoietic stam-stam-stamcellsbildning och spridning16,17, samt myeloiska prekursorer spridning och differentiering18. Makrofagkolonistimulerande faktor (CSF1) stöder produktionen av myeloiska celler och deras differentiering till makrofager19,20. Under den tredje etappen av differentiering, dessa suspension celler odlas i närvaro av CSF1 att stödja terminal makrofag mognad.
Differentiering av mänskliga iPSCs i makrofager in vitro härmar den tidiga vågen av makrofag produktion under utveckling. Vävnad-bosatt makrofager är etablerade under embryogenesis och har en distinkt utvecklingsmässiga härstamning från vuxna monocyter. Flera studier har visat att iPSC-DMs har en gensignatur som är mer jämförbar med fetala lever-härledda makrofager än blod-härledda monocyter, vilket tyder på att iPSC-DMs är mer besläktad med vävnad-bosatt makrofager. iPSC-DMs uttrycka högre nivåer av gener som kodar för utsöndring av proteiner som deltar i vävnad remodellering och angiogenes och uttrycka lägre nivåer av gener kodning för proinflammatoriska cytokin sekretion och antigen presentation verksamhet21,22. Dessutom har iPSC-DMs ett motsvarande krav på transkriptionsfaktor som gäller för makrofager med vävnadsboende23,,24. Med hjälp av knockout iPSC cellinjer som är bristfälliga i transkriptionsfaktorer RUNX1, SPI1 (PU.1), och MYB, Buchrieser et al. visade att genereringen av iPSC-DMs är SPI1 och RUNX1 beroende, men MYB oberoende. Detta tyder på att de är transkriptionellt liknar äggula-säcken härledda makrofager som genereras under den första vågen av hematopoiesis under utveckling23. Därför är det allmänt accepterat att iPSC-DMs representerar en lämpligare cellmodell för att studera vävnadsboende makrofager som microglia14,,25 och Kupffer celler11, och en mer önskvärd källa till celler som potentiellt skulle kunna användas i terapier för att reparera vävnader. Det har till exempel visats att makrofager som produceras in vitro från mus ESCs var effektiva vid förbättring av fibros i en CCl4-inducerad leverskada modell in vivo11. Dessutom var dessa ESC-härledda makrofager effektivare än benmärgsbaserade makrofager vid återbefolkande Kupffer cellrum utarmat av makrofager med liposomala clodronate11 hos möss.
Här beskriver vi serum- och matarfria protokoll för underhåll, frysning och upptining av mänskliga iPSCs och för differentiering av dessa iPSCs i funktionella makrofager. Detta protokoll är mycket lik det som beskrivs av Van Wilgenburg et al.12, med mindre ändringar inklusive: 1) iPSC-underhåll media; 2) ROCK-hämmare används inte i EB-formationsstadiet; 3) En mekanisk metod snarare än en enzymatisk metod används för att generera enhetliga EBs från iPSC kolonier; 4) Metoden för EB skörd och plätering ner är annorlunda; 5) Suspensionsceller skördas 2x i veckan, snarare än varje vecka; och 6) Skördade suspensionsceller odlas under CSF1 för makrofag mognad i 9 dagar snarare än 7 dagar. Vi beskriver också protokoll som används för att karakterisera iPSC-härledda makrofagen fenotyp och funktion, inklusive analyser för genuttryck (qRT-PCR), cell yta markör uttryck (flöde cytometri) och funktionella analyser för att bedöma fagocytos och polarisering.
Protokollet för generering av iPSC-DMs som beskrivs här är robust och möjliggör produktion av ett stort antal homogena celler från ett relativt litet antal iPSC. Efter den första differentieringen av cirka 1 x 106 iPSC kan de efterföljande kulturerna skördas var fjärde dag i upp till 2–3 månader, vilket resulterar i produktion av minst 6,5 x 107 makrofager under den tiden. Dessa in vitro-genererade mänskliga makrofager är morfologiskt liknar primära mänskliga makrofager, uttrycka de viktigaste makrofag cellytan markörer, och uppvisar fagocytisk aktivitet. Protokollet för makrofagdifferentiering kan reproduceras och kan tillämpas på andra hiPSC- och hESC-cellinjer, men den exakta tidpunkten för den första skörden av makrofagenprekursorer och det absoluta antalet celler som kan genereras varierar mellan iPSC-linjer.
Det har visat sig att makrofager kan genereras från iPSCs som har manipulerats genetiskt. Till exempel sattes en transgenkassett bestående av den fluorescerande reportern ZsGreen under kontroll av den konstituerande CAG-promotorn in i AAVS1-lokaliseringen av SFCi55 iPSC-linjen, och det visades senare att denna iPSC-linje kunde differentieras till ZsGreen-expressing macrophages8. Dessa fluorescerande makrofager skulle kunna användas i framtiden för att spåra migration och stabilitet av terapeutiska makrofager i sjukdomsmodeller. I en annan studie genererades makrofager från en iPSC-linje som hade manipulerats genetiskt för att uttrycka en tamoxifen-inducerad transkriptionsfaktor, KLF1. Aktivering av KLF1 i iPSC-härledda makrofager resulterade i produktion av makrofager med en fenotyp jämförbar med makrofager på erytoidön9. Potentiellt, denna strategi kan användas för att genetiskt programmera iPSC-härledda makrofager i fenotyper som är associerade med andra vävnadsspecifika makrofag populationer såsom Kupffer celler i levern eller Langerhans celler i huden. Detta skulle vara möjligt när de viktigaste transkriptionsfaktorerna som definierar dessa celltyper identifieras.
När det gäller protokollet är det mycket viktigt att notera att villkoret för startpopulationen av iPSC är avgörande för en lyckad differentiering. Mänskliga iPSC kulturer kan invaderas med karyotypically onormala subpopulationer över flera passager, så robust kurering av iPSC lager och stora lager parti mästare utsätts för genom kvalitetskontroll rekommenderas. I våra händer kan underhållsprotokollen som beskrivs här upprätthålla karyotypiskt normala iPSC i upp till 2 månader i kontinuerlig kultur, men detta kan variera för olika cellinjer och i olika laboratorier. Om problem uppstår är det lämpligt att använda en ny injektionsflaska med odifferentierade iPSC för varje differentieringsexperiment. Dessutom bör startkulturen för odifferentierade iPSC inte vara mer än 80 % konfluent. Vid EB-pläteringsstadiet bör endast 10–15 EBs pläteras per brunn av en 6-brunnsvävnadsodlingsplatta, och det är viktigt att dessa EBs är jämnt utspridda över brunnen. Ett större antal EBs och / eller klumpar av EBs i mitten av brunnen hade en negativ effekt på antalet makrofager genereras. Försiktighet bör iakttas vid påfyllning av media och skörd av monocytliknande stamfaderfjädringsceller från EB-kulturerna för att undvika att störa EBs vidhäftning till ytan av de belagda kulturplattorna. Antalet hematopoietiska suspensionsceller som produceras ökar gradvis med varje skörd, med optimal produktion mellan dag 40–72 av differentiering (figur 2). Produktionen minskar gradvis efter dag 68 och plattor tenderar att avgas efter 2,5 månader, även om den exakta tidpunkten kan variera beroende på iPSC-linjen.
En begränsning av vårt protokoll är att det inte har varit möjligt att cryopreserve hematopoietic suspension celler som genereras i slutet av steg 2. Protokoll som förlitar sig på exogen aktivering av WNT rapport om en 40% återvinning efter cryopreservation, men dessa protokoll rapporterar bara en cell skörd, så det absoluta antalet makrofager genereras är låg30. Det protokoll som beskrivs här, förmå endogen signalering via bildandet av EBs, kan skördas varannan vecka, vilket ger en mycket högre total makrofag avkastning.
Sammanfattningsvis presenterar vi ett detaljerat protokoll för produktion av funktionella iPSC-härledda makrofager. Att sätta upp in vitro-experiment med makrofager som härrör från iPSC för att studera makrofagbiologi i hälsa och sjukdom har många fördelar jämfört med experiment med monocytbaserade makrofager. Dessa fördelar omfattar enkel tillgång till materialet (t.ex. inga givare krävs), mycket stora mängder makrofager kan produceras, och det är möjligt och relativt enkelt att producera genetiskt modifierade makrofager. Dessutom kan iPSC-härledda makrofager vara bättre resurs för studier av vävnad-bosatt makrofag biologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Fiona Rossi och Claire Cryer för hjälp med flödescytometri, Eoghan O’Duibhir och Bertrand Vernay med mikroskopi. Detta arbete finansierades av CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) och Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD studentship (A.M), MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. och J.W.P. stöddes av Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) och COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350010 | |
Abtibody CD64-APC -CY7 | Biolegend | 305026 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody 25F9-EFLUOR 660 | Ebioscience | 15599866 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CCR2-PE-Cy7 | Biolegend | 357212 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CCR5 PE | Biolegend | 313707 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CCR8 PE | Biolegend | 360603 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD11b-PE | Biolegend | 301305 | Dilution factor: 1:50 |
Antibody CD14-APC | Ebioscience | 10669167 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CD163-PE-CY7 | BIolegend | 333614 | Dilution factor: 1:25 |
Antibody CD169-APC | Biolegend | 346007 | Dilution factor: 1:25 |
Antibody CD206-PE | Biolegend | 321106 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD209-PE-CY7 | Biolegend | 3310114 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD274-PE-CY7 | Biolegend | 329718 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD43-PE | Ebioscience | 10854419 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD45-APC | Ebioscience | 15577936 | Dilution factor: 1:20 |
Antibody CD86-APC | Biolegend | 305412 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CD93-PE | Ebioscience | 10804637 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody CX3CR1-PE | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
Antibody HLA-DR-BV650 | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
Antiboy CD115-PE | Biolegend | 347308 | Dilution factor: 1:40 |
Cell Dissociation Buffer, enzyme free | Thermofisher | 13151014 | |
Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS | Gibco | 13151014 | |
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well | PerkinElmer | 6055302 | |
CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain | Thermofisher | C10046 | Cryopreservation media |
Cryostor CS10 | Sigma | C2874 | |
CTS CELLstart Substrate | Invitrogen | A1014201 | Stem cell substrate |
DAPI | Merck | D9542-1MG | Final concentration 1 μg/mL |
DPBS, calcium, magnesium (500ml) | Thermofisher | 14040091 | |
FcR Blocking Reagent, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHG0021 | |
GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
Human Recombinant IFNY | Thermofisher | 14-8319-80 | |
Human Serum Albuminum | Irvine Scientific | 9988 | |
Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli | Sigma | L2630 | |
NucBlue (Hoechst33342) | Thermofisher | R37605 | |
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis | Thermofisher | P35365 | |
Porcine Skin Gelatin | Sigma | G9136 | |
Recombinant Human BMP4 Protein | R&D | 314-BP-010 | |
Recombinant Human IL10 | Preprotech | 200-10 | |
Recombinant Human IL3 | Preprotech | 200-03-10 | |
Recombinant Human IL4 | Preprotech | 200-04 | |
Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100ug | Biolegend | 574806 | |
Recombinant Human VEGF Protein | R&D | 293-VE-010 | |
Rock Inhibitor Y-27632 | Merck | SCM075 | |
SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHC2111 | |
StemPro hESC SFM | Thermofisher | A1000701 | |
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | Thermofisher | 23181010 | |
Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface | Greiner | 657970 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
X-Vivo 15 500 mL bottle | Lonza | BE02-060F |