Summary
Здесь мы представляем улучшенный протокол для получения и иммуноокрашивания яичек Drosophila, подходящий для конфокальной микроскопии, а также позволяющий воспроизводимую и надежную маркировку. Мы иллюстрируем этот протокол 3D-представлением и количественной оценкой экспериментов по колокализации на больших сперматозоидах S4-S5.
Abstract
Яички Drosophila являются мощной модельной системой для изучения биологических процессов, включая биологию стволовых клеток, ядерную архитектуру, мейоз и развитие сперматозоидов. Однако иммуномаркировка всего яичка дрозофилы часто связана со значительной неравномерностью окрашивания из-за проникновения антител. Раздавленные препараты лишь частично преодолевают проблему, так как это снижает качество 3D анализов. Здесь мы описываем протокол цельного крепления с использованием NP40 и гептана во время фиксации вместе с иммуномаркировкой в жидких средах. Он сохраняет объем, пригодный для конфокальной микроскопии, вместе с воспроизводимой и надежной маркировкой. Показаны различные примеры 3D-восстановления ядер сперматоцитов из конфокальных срезов. Воспроизводимость внутри- и межясыков позволяет проводить 3D-количественную оценку и сравнение флуоресценции между отдельными клетками разных генотипов. Мы использовали различные компоненты внутриядерной структуры MINT (Mad1-содержащую Intra Nuclear Territory), а также два компонента, связанных с комплексом ядерных пор, чтобы проиллюстрировать этот протокол и его приложения на крупнейших клетках яичка, сперматоцитах S4-S5.
Introduction
Яички дрозофилы являются ценной моделью для изучения ядерной архитектуры. В митотических сперматозоидах ядерный объем в значительной степени занят хроматином. Эти клетки проходят четыре раунда деления, производя кисту из 16 первичных сперматоцитов. В течение следующих нескольких дней сперматоциты проходят через 6 стадий развития (S1-S6), значительно увеличиваясь в объеме, примерно в 20 разв 1,2раза. Они также меняют свою ядерную морфологию. Очертания ядра, выявленные ламином Dm0, становятся неровными и показывают глубокие инвагинации1,3. Это сопровождается обширными изменениями экспрессии генов и модификациями в организации хроматина1,4,5,6,7. Межфазные хромосомы хорошо определены на стадии S4-S5, образуя три различные массы, соответствующие 2 основным двухвалентным аутосомам и паре X-Y, состыковывающейся с ядрышком.
Mad1 был первоначально изолирован как ключевой компонент митотического контрольно-пропускного пункта (рассмотрен в8). В интерфазе он описывается как расположенный в основном в ядерной оболочке, но также и в нуклеоплазме9,10,11. В Drosophila testis мы сообщили, что Mad1 занимает видное место в нуклеоплазме, тесно связанной с двумя основными аутосомными массами хроматина и в меньшей степени с хроматином XY. Мы определили эту хроматин-ассоциированную структуру как MINT (Mad1-содержащая внутриядерная территория)12. Четыре других белка были связаны с MINT в сперматоцитах: нуклеопорин Mtor/Tpr, пептидаза SUMO Ulp1, белок митотической контрольной точки Mad2 и субъединица поликомбоподобного комплекса Raf212.
Чтобы завершить описание MINT, нам нужно было использовать антитела, и мы столкнулись с техническими проблемами, обычно встречающимися с иммуноокрашиванием в яичках: плохая проницаемость, приводящая к значительной неравномерности окрашивания в глубине яичка, особенно в крупных сперматоцитах. Sподавлял препараты, увеличивая доступ антител, но приводил к сжатию изображений, ограничивая 3D-анализы и предотвращая измерение количественной флуоресценции, включая колокализацию. Проблема проникновения антител также может быть решена с помощью пермеабилизирующих агентов, таких как 0,3% Na дезоксихолат13,но эта процедура в наших руках не дала воспроизводимых результатов. Поскольку мы провели много экспериментов по совместной маркировке, мы хотели улучшить протокол пермеабилизации. Комбинация 1% NP40 плюс гептан привела к большей воспроизводимости, особенно при изучении крупных сперматоцитов.
Этот протокол выполняет фиксацию и иммуноокрашивание яичек во суспензии, улучшая качество образца, а также повышая воспроизводимость и делая его пригодным для конфокальной микроскопии. Мы использовали протокол для лучшего определения пространственных отношений определенных белков ядерной оболочки с нуклеоплазмическими структурами крупных сперматоцитов. Этот метод позволит лучше изучать изменения, которые сопровождают развитие сперматоцитов, например, динамические структурные изменения ядра, включая хроматин, нуклеоплазму и ядерные поры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Коллекция яичек дрозофилы
ПРИМЕЧАНИЕ: Молодые самцы (0-15 ч после эклозии) необходимы для исследования диплоидных половых клеток (т.е. сперматогонии и сперматоцитов).
- Выбирайте молодых мух как можно больше, чтобы свести к минимуму помехи от развивающихся сперматид.
- Обезболивают мух при кратковременном воздействии углекислого газа и переносят на налетную площадку14,15.
- Под рассекающим микроскопом (10-кратное увеличение) используйте щипцы для удаления головы.
- Перенесите от 5 до 10 обезглавленных мух в 100 мкл буфера Рингера (183 мМ KCI, 47 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCI, 1 мМ ЭДТА, полный ингибитор белка, рН 6,8) на стеклянной горке с силиконовым покрытием на черной фоновой подложке.
- С рассекающим микроскопом при 40-кратном увеличении используйте одну пару щипцов числа 5, чтобы удерживать муху между грудной клеткой и брюшком, а с другими щипцами оттягивайте брюшную полость от грудной клетки. Быстро изолируют яички и прилегающие ткани от туши мухи15 и помещают в новую каплю буфера Рингера на том же слайде.
- Как только все яички будут готовы, очистите яички от оставшихся тканей (дополнительной железы и наружных половых органов).
- Удалите из капли лишний буфер, содержащий рассеченные яички. Как правило, используйте пипетку p200 с наконечником 10 мкл, установленным поверх наконечника 200 мкл. Это позволяет удалить избыток жидкости через небольшое отверстие. Поместите каплю 4% параформальдегида фиксатора поверх капли, содержащей рассеченные яички, а затем быстро перенесите яички в пробирку, содержащую свежий фиксаторный раствор.
2. Фиксация параформальдегида
- Перед применением готовят 2 мл фиксаторного раствора: 600 мкл 4% параформальдегида, разведенного в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) с 30 мкл NP40 20% плюс 1200 мкл гептана в 2 мл силиконизированной микроцентрифужной трубки. Используйте 4% параформальдегид в PBS, приготовленный в 600 мкл аликвот и хранящийся при -20°C.
Внимание: Гептан и параформальдегид токсичны и должны обрабатываться в вытяжном капюшоне. Распоряжайтесь ими в соответствии с правилами принимающего института. - Перенесите яички с помощью микропипетки p200 с широким наконечником диафрагмы в раствор PFA/NP40/гептан. Встряхните трубку вверх и вниз в течение 30 с вручную. Продолжайте фиксацию яичек на ротационном смесителе при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Остановите вращающийся смеситель и поместите трубку в стойку для труб, чтобы обеспечить разделение фаз и чтобы яички осели на дно трубки.
- Удалите весь гептан и фиксаторный раствор и быстро промойте яички три раза с 1x PBS.
- Переложить в чистую индивидуальную трубку 200 мкл. Выполните все инкубации в этих небольших трубках, чтобы свести к минимуму количество используемых антител.
- Удалите лишний буфер с помощью микропипетки 200 мкл с прикрепленными наконечниками P200 и P10. Позаботьтесь о том, чтобы не аспирировать яички.
- Держите яички в 1x PBS на льду, пока все образцы не будут готовы.
3. Окрашивание антител в растворе
- Откажитесь от PBS и оставьте яички в 0,3% PBS-T в течение 30 мин при комнатной температуре для пермеабилизации клеточных мембран.
- Предварительно инкубировать в том же буфере плюс 5% нормальную козью сыворотку (NGS) в течение 1 ч.
- Добавьте 200 мкл первичного антитела, разведенного в 0,3% PBS-T плюс 5% NGS(Таблица материалов).
- Инкубировать первичное антитело в течение ночи при 4 °C (или комнатной температуре) с легким перемешиванием на коромысле.
- Промыть 3 раза по 0,3% PBS-T в течение 15 мин на коромысле комнатной температуры. Дайте яичкам осязить на дно трубки под действием силы тяжести.
- Добавьте 200 мкл вторичного антитела, разбавленного 1:500 из конъюгированного ряда DyLight.
- Инкубируют вторичное антитело в темной камере в течение 4 ч при комнатной температуре.
- Промывайте в 0,3% PBS-T в течение 15 мин на коромысле комнатной температуры. Затем повторяют с 0,2% PBS-T и 0,1% PBS-T, каждый раз в течение 30 мин на коромысле при комнатной температуре. Сделайте окончательную стирку в 1x PBS в течение 30 минут, чтобы удалить моющее средство.
- Добавьте 180 мкл раствора DAPI при 1 мкг/мл в 1x PBS в течение 15 мин. Стандартный раствор составляет 10 мг/мл вH2O. Избегайте приготовления стока раствора в PBS, который может уменьшить сигнал окрашивания DAPI на диффузном хроматине в более крупных сперматоцитах.
- Стирайте по 3 раза по 5 минут.
- Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать круг на чистом слайде.
- Аспирируйте яички и положите их на слайд. Предварительное промывание широкоугольного наконечника отверстия с 0,1% PBS-T предотвращает прилипание яичек к наконечнику. Удалите излишки PBS.
- Добавьте каплю (примерно 100 мкл) Citifluor AF1.
- Осторожно поместите стеклянную крышку поверх ткани, заботясь о том, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха.
- Запечатайте крышку на слайде прозрачным лаком для ногтей.
- Наблюдайте за слайдами на микроскопе.
4. Анализы колокализации
- Получайте конфокальные изображения. Мы использовали конфокальный микроскоп Zeiss LSM 710 (63x План Апохроматическое масло) с z-разрешением 0,5 или 1 мкм.
- Выделите разные клетки из независимых яичек.
- Импорт изображений в программное обеспечение для обработки (например, Imaris).
- Определите ядро путем ручной сегментации, чтобы исключить соседние ядра. Использовать программное обеспечение Coloc; он собирает коэффициенты корреляции Пирсона (PCC) внутри всего объема между 2 флуорофорами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основным препятствием для получения адекватного окрашивания яичек Drosophila является ограниченная проникаемость антител, которая была частично устранена с помощью раздавленных препаратов, но за счет ограничения 3D-анализов (например, 3D-представление или мера колокализации). Процедура позволяет равномерно маркировать и сохраняет объем всех клеток яичка. Здесь мы сосредоточили иллюстрацию метода на 3D-представлении сперматоцитов S4-S5, так как они являются самыми крупными клетками и, следовательно, более чувствительны к деформации от раздавливания. Мы использовали различные ядерные маркеры, включая нуклеопорины и маркировку внутриядерного домена MINT (Mad1-содержащая внутриядерная территория), описанного митотическим белком Mad112. Поскольку MINT могут быть выявлены несколькими различными антителами, мы использовали их для проверки надежности протокола количественной 3D-колокализации, метода, который требует правильного пространственного разрешения.
Протокол, описанный выше, позволяет получить конфокальные изображения достаточного качества, чтобы затем их можно было обработать для 3D-восстановления. Четыре смежных последовательных участка сперматоцита стадии S5 изображены на рисунке 1А,показывая репрезентативное иммуноокрашивание MINT (иммуномаркировка Mad1 с использованием бустера GFP красного цвета) вместе с DAPI (в синяком). Хромосомы организованы в характерные 3 основных отдельных кластера, и структура MINT показана в мельчайших деталях вокруг ДНК, тесно связанной с аутосомными массами хроматина, но отличной от них. Резолюция также позволяет обнаружить присутствие Mad1 на ядерной периферии, а также между аутосомными массами хромосом 2 и 3. Мы использовали программное обеспечение Imaris для 3D-представления. Ядерная поверхность определялась низким уровнем присутствия Mad1 в ядерной оболочке (серым цветом), а MINT определялся высоким уровнем накопления Mad1 внутри ядра (красным) вместе с окрашиванием DAPI (синим)(рисунок 1A). Фильм о 3D-восстановлении хорошо иллюстрирует объем и связь Mad1 (в ядерной оболочке и в MINT) вместе с хромосомами на стадии S4–S5 сперматоцитов.
Распределение нуклеопоринов было плохо описано в этих клетках, вероятно, из-за трудностей с их обнаружением в этих больших деформированных ядрах. Распределение Nup154 было зарегистрировано только один разранее 16, а Nup153 и Nup98 были изучены только в сперматогониях и небольших ранних сперматоцитах17. 3D-восстановление крупных сперматоцитов S5, окрашенных нуклеопорином Nup62 и импортом β (продукт гена кетеля), было осуществимым и представлено на рисунке 1C и рисунке 1Dсоответственно. Эти ядерные пороассированные компоненты кажутся неравномерно распределенными по ядерному ободу в виде точек нерегулярного размера. Например, импорт в β собирается вокруг аутосомного хроматина аналогично тому, где уже описана ламинная сеть3. Этот вид распределения с богатыми порами областями и большими безпоровыми областями был описан электронной микроскопией в сперматоцитах грызунов18. Понимание изменений в распределении ламина и нуклеопорина поможет понять структуру ядерной оболочки в этих клетках G2 непосредственно перед мужским мейозом.
Сохраняя 3D-объем клеток, этот протокол также позволяет антителам равномерно проникать в глубину каждой клетки, что позволяет проводить количественный анализ, такой как колокализация. Коэффициент корреляции Пирсона (PCC) является хорошо заявилой метрикой. Он может варьироваться от +1 (обозначающий идеальную положительную корреляцию) до −1 (идеальная отрицательная корреляция)19. Чтобы оценить локализацию партнерских белков MINT относительно Mad1 в сперматоцитах, мы ранее оценили PCC на одном участке 0,5 мкм с помощью ImageJ в сперматоцитах S512 (Рисунок 2A,B). Мы проверили протокол более глубоко, используя 3D-колокализацию на целых ядрах, а не только на поверхности. Объем ядер определяли ручной сегментацией, а PCC измеряли с помощью инструмента Колокейшн. Мы проанализировали восемь ядер сперматоцитов S5 из одного и того же яичка или разных яичек. На рисунке 2B показано 3D-представление ядра, которое служило для измерения PCC. На рисунке 2D показано измерение PCC на восьми различных ядрах сперматоцитов S5 из трех разных яичек. Значения PCC не отличаются, варьируясь от 0,6 до 0,75, что указывает на высокое значение для колокализации. Они неотличимы от PCC, определенных на одном участке. Таким образом, процедура позволяет воспроизвести однородную маркировку и сохраняет хороший объем всех клеток яичка.
Поскольку протокол позволяет надежно измерять колокализацию с независимых яичек, он позволяет сравнивать окрашивание из разных генотипов мух. Это было проиллюстрировано здесь сравнением WT мух и мух RNAi, истощенных для Mtor (генерируемых экспрессией линий dsRNA UAS и драйвера Bam-Gal4, которые достигают существенного истощения при поздней сперматогонии и ранних сперматоцитах20). Как описано для экспериментов по колокализации, тесты, обедненные Mtor-RNAi и дикие типы яичек были рассечены и зафиксированы вместе, а конфокальные изображения были получены при постоянных настройках. Соблюдая эти условия, становится возможным сравнение отдельных клеток. Мы заметили, что МИНТ больше, чем ядерная оболочка, подвержена потере Mtor, как показано репрезентативными Mtor RNAi-истощенными (верхними) и wt (нижними) ячейками(Рисунок 3)12.
Рисунок 1: Иллюстрация иммуноокрашивания ядер сперматоцитов Drosophila S4-S5 с помощью различных зондов. (A)Изображения ядра сперматоцита одной стадии 5, иммуноокрашенного антителом α-GFP (бустер GFP), обнаруживающего структуру MINT с помощью Mad1-GFP (красный) вместе с окрашиванием DAPI (синий). Он с точностью показывает связь между Mad1 и двумя аутосомными массами хроматина (представленными в виде звездочек). Mad1 также слабо обнаруживается на периферии ядра. Все изображения представляют собой последовательные Z-проекции стека из 3 (0,5 мкм) последовательных конфокальных срезов. Конфокальные изображения были получены на конфокальном микроскопе (63x, объективная линза Plan Apochromatic oil DIC). Шкала баров 5 мкм.(B)Кадр из фильма рендеринга того же ядра сперматоцита. Ядерная поверхность определялась низкой экспрессией Mad1 в ядерной оболочке (в серых цветах), а MINT определялся высокой экспрессией Mad1 внутри ядра (красным цветом). (А, Б) Перепечатано с разрешения ранее опубликованного рисунка (от12). (C)3D-изображение ядра сперматоцита стадии 5 с одновременным иммуноокрашиванием Nup62 (желтый) и MINT (бустер GFP красным цветом). Шкала бара представляет собой 4 мкм.(D)3D-изображение ядра сперматоцита стадии 5 с одновременным иммуноокрашивающим импорт-β Кетеля (желтый) вместе с ДНК (DAPI синим). Шкалы 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Количественное увеличение 2D и 3D колокализации Mad1 вместе с Ulp1. (A) Объединенные изображения ядра сперматоцита стадии 5, иммуноокрашенного бустерным антителом GFP, обнаруживающим Mad1 (зеленый), и антителом против Ulp1 (красным), представленным в виде стека ядра сперматоцита толщиной 1 мкм. Справа указан коэффициент корреляции интенсивности Пирсона, рассчитанный с помощью плагина Coloc-2 ImageJ. PCC был оценен в 0,73 (Перепечатано с разрешения Райха12). (B)Объединенное изображение ядра сперматоцита стадии 5 (соответствующего ядру G в соседней таблице), иммуноокрашенного бустерным антителом GFP, обнаруживающим Mad1 (зеленый), и антителом анти-Ulp1 (красным), представленным в 3D-проекции. Объем ядра определялся ручной сегментацией. Справа в таблице перечислены коэффициенты корреляции интенсивности Пирсона, рассчитанные на 8 различных сперматоцитах (от A до H) из 3 разных яичек (от 1 до 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Иммунофлуоресцентный анализ сперматоцитов, обработанных Mtor RNAi, по сравнению с диким типом. Клетки, истощенные Mtor с использованием клеток MtorRNAi (ID 110218) (верхние панели) и клетки дикого типа (нижние панели), были окрашены для белков Mad1, Raf2 и Mtor. Яички были зафиксированы и окрашены вместе, смонтированы на одном слайде и получены изображения с одинаковыми параметрами. Клетки РНКи можно отличить от WT по отсутствию или наличию соответственно Mad1-GFP. Рисунок репрезентативен для максимальных проекций 4 х 0,5 мкм стеков. Шкала шкалы составляет 5 мкм (Перепечатано с разрешения ранее опубликованного рисунка в12). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает метод успешной иммуномаркировки цельноукладных яичек взрослых дрозофил. Как сообщалось в других процедурах, необходимо использовать молодых мужчин (мы даже сократили возраст до менее чем 20 часов после эклозии), чтобы свести к минимуму наличие развивающейся спермы, которая рискует затруднить сперматоциты. Рассечение должно быть быстрым, а разбавление антител должно быть скорректировано для оптимизации отношения сигнал/шум21,22,23. Поскольку, используя другие протоколы, мы не наблюдали окрашивания по всей глубине яичка, мы разработали метод фиксации, сочетающий PFA вместе с NP40 и гептаном. В настоящее время мы обычно используем 600 мкл 4% параформальдегида в PBS с 30 мкл 20% NP40 плюс два объема гептана. Это имеет решающее значение для обеспечения достаточной пермеабилизации. Уменьшение количества NP40 до 10 мкл заметно снижает маркировку. Все последующие этапы проводили во суспензии, а избыточный буфер удаляли, позволяя яичкам мягко опускаться на дно трубки под действием силы тяжести. На последнем этапе переноса образцов на слайд мы промываем наконечник в 0,1% PBS-T, чтобы яички не прилипли к конусу. Согласно наблюдениям, протокол иммуногистологического окрашивания хорошо работает с различными ядерными белками, включая используемые здесь маркеры, а также зонды эпигенетических модификаций гистонов, ламинов и нуклеопоринов. Отметим, что протокол может быть использован и для личинок яичек, и в этом случае гептан следует опустить, так как это затрудняет восстановление яичек неповрежденными.
Протокол специально разработан для поддержания неповрежденных стеков сперматоцитов вместе для эффективной и равномерной маркировки яичка. Мы проиллюстрировали протокол большими сперматоцитами поздней стадии, чьи деформированные ядра делают их одними из самых сложных клеток для сохранения. Кроме того, в этих сперматоцитах ядерная маркировка часто разбавляется, вероятно, из-за размера ядер. Например, обычно наблюдается, что маркировка DAPI или ламина сильнее в клетках на вершине яичка и становится все слабее и более дисперсной, поскольку сперматоциты растутна 3,24. Это также может быть одной из причин того, что распределение нуклеопоринов было описано только в клетках более ранней стадии (сперматогония и ранние сперматоциты)17.
Были опубликованы превосходные изображения иммуноокрашивания сперматоцитов Drosophila S5, особенно для специфических для яичек t-BRD и белков дани25,26 с использованием протокола 0,3% дезоксихолата натрия или после раздавливанияткани 21,22. В наших руках кабачки приводят к значительной неравномерности окрашивания в глубинах органа, а также к принесению в жертву 3D-структуры. Даже если использование 0,3% дезоксихолата натрия дало лучшие результаты, мы все равно наблюдали неравномерность. Таким образом, мы предпочитаем NP40 за его воспроизводимость и качество маркировки. Конфокальные изображения позволяют реконструированы 3D-изображения для ядерных белков. Например, мы успешно применили этот метод, используя множество различных зондов, проиллюстрированные здесь внутриядерным доменом MINT, тесно связанным с аутосомными хроматиновыми массами и ядерной поровой сетью. Интригующее 3D-распределение ядерных пор этих ядер сперматоцитов теперь доступно для дальнейших исследований. Изображения позволяют воспроизводимую количественную оценку колокализации из разных сперматоцитов из одного и того же яичка и из разных яичек. Насколько нам известно, это первый случай, когда точная количественная оценка коэффициентом корреляции Пирсона была измерена на таких образцах. Это дает уверенность, необходимую для точного сравнения уровней иммуномаркированного белка различных яичек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим. Веррийзера, Й. Йохансена Х., Охуру за антитела и А. Дебека, Блумингтонский и Венский центры для мух. Спасибо К. Джексону за предложения и стимулирующие дискуссии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Vienna Drosophila RNAi Center |
| Materials | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | Stock solution must be prepared in H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Wide Bore Pipette Tips | Fisherbrand | 11917744 | Wide aperture tip |
| Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube | Thermo | AB-0620 | |
| 2 ml micro centrifuge tubes | Sigma | T3531-200EA | Siliconized 2ml tube |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyde 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| 0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T | PBS 1X containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, for molecular biology, | Sigma | T8787 | |
| Antibodies | |||
| GFP booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Mouse anti-Mtor | 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University | ||
| Rat anti-Nup62 | 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK | ||
| Guinea-pig anti-Ulp1 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| Rabbit anti-Raf2 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| DyLight conjugated series | Thermo | 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse, rabbit or rat) as second antibodies |
References
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
- Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
- Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
- Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
- White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
- Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).
- Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
- Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
- Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S.
- Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
- Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
- Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
- White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
- Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
- Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
- Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).
