Summary
Vi presenterar här ett förbättrat protokoll för hela monteringen beredning och immunostaining av Drosophila testikörer, lämplig för konfokal mikroskopi och även möjliggör reproducerbar och tillförlitlig märkning. Vi illustrerar detta protokoll genom 3D representation och kvantifiering av colocalization experiment på de stora S4-S5 spermatocyter.
Abstract
Drosophila testiestes är ett kraftfullt modellsystem för att studera biologiska processer inklusive stamcellsbiologi, kärnarkitektur, meios och spermieutveckling. Immunolabeling av hela Drosophila testikel är dock ofta förknippad med betydande icke-enhetlighet av färgning på grund av att antikropp penetration. Krossade preparat övervinner bara delvis problemet eftersom det minskar 3D-kvaliteten på analyserna. Häri beskriver vi ett helt mount protokoll med NP40 och heptan under fixering tillsammans med immunolabeling i flytande medier. Den bevarar den volym som lämpar sig för konfokal mikroskopi tillsammans med reproducerbar och tillförlitlig märkning. Vi visar olika exempel på 3D-rekonstitution av spermatocytkärnor från konfokala sektioner. Reproducerbarheten inom och mellan testiklar möjliggör 3D-kvantifiering och jämförelse av fluorescens mellan enstaka celler från olika genotyper. Vi använde olika komponenter i den intranukleära MINT-strukturen (Mad1-innehållande Intra Nuclear Territory) samt två komponenter associerade med kärnporkomplexet för att illustrera detta protokoll och dess tillämpningar på testiklarnas största celler, S4-S5-spermatocyterna.
Introduction
Drosophila testikörer är en värdefull modell för studier av kärnarkitektur. I mitotiska spermatogonial celler upptas kärnvolymen till stor del av kromatin. Dessa celler genomgår fyra omgångar av uppdelning, producerar en cyste av 16 primära spermatocyter. Under de kommande dagarna passerar spermatocyterna genom 6 utvecklingsstadier (S1-S6), kraftigt ökande i volym, ungefär 20 gånger1,2. De ändrar också sin nukleära morfologi. Konturen av kärnan, avslöjad av lamin Dm0, blir oregelbunden och visar djupa invaginations1,3. Detta åtföljs av omfattande genuttrycksförändringar och modifieringar i kromatinorganisationen1,4,5,6,7. Interfaskromosomerna är väldefinierade i steg S4-S5 och bildar tre distinkta massor som motsvarar de 2 stora bivalenta autosomerna och X-Y-paret dockade med kärnan.
Mad1 isolerades ursprungligen som en nyckelkomponent i den mitotiska kontrollpunkten (granskad i8). I interphase beskrivs det som beläget främst vid kärnhöljet men också i nukleoplasman9,10,11. I Drosophila testikel rapporterade vi att Mad1 är framträdande i kärnan, intimt associerad med de två stora autosomala kromatin massorna och i mindre utsträckning med XY chromatin. Vi definierade denna kromatin-associerade struktur som MINT (Mad1-innehållande IntraNuclear Territory)12. Fyra andra proteiner var associerade med MINT i spermatocyter: kärnan i Mtor/Tpr, SUMO-peptidasen Ulp1, mitotiska checkpointproteinet Mad2 och en underenhet till ett Polycomb-liknande komplex Raf212.
För att slutföra beskrivningen av MINT, vi behövde använda antikroppar och konfronterades med de tekniska problem som i allmänhet påträffas med immunostaining i testikel: en dålig permeabilitet som resulterar i en betydande icke-enhetlighet av färgning i djupet av testikel, särskilt i de stora spermatocyterna. Squashed preparat ökade antikroppsåtkomst men ledde till komprimerade bilder, begränsa 3D-analyserna och förhindra mätning av kvantitativ fluorescens, inklusive colocalization. Problemet med antikroppspenetration kan också åtgärdas genom genomsläppande medel som 0,3% Na deoxycholate13, men detta förfarande gav inte i våra händer reproducerbara resultat. Eftersom vi utförde många sammärkningsexperiment, såg vi ut att förbättra permeabiliseringsprotokollet. Kombinationen av 1% NP40 plus heptan resulterade i mer reproducerbarhet, särskilt i att studera de stora spermatocyterna.
Detta protokoll utför fixering och immunostaining av testiklar i suspension, förbättra provkvaliteten samt förbättra reproducerbarhet och göra det lämpligt för konfokal mikroskopi. Vi använde protokollet för att bättre definiera de rumsliga relationerna mellan vissa nukleära kuvertproteiner och de nukleoplasmiska strukturerna hos stora spermatocyter. Denna metod kommer att möjliggöra bättre undersökningar av de förändringar som åtföljer spermatocytutveckling, till exempel de dynamiska strukturella förändringarna i kärnan inklusive kromatin, nukleoplasma och nukleära porer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila testiklar samling
OBS: Unga män (0-15 h post-eclosion) är nödvändiga för att undersöka diploid könsceller (dvs. spermatogonia och spermatocyter).
- Välj unga flugor så mycket som möjligt för att minimera störningar från att utveckla spermatider.
- Söva flugor genom kort exponering för koldioxid och överför till en flugkudde14,15.
- Använd tång för att ta bort huvudet under ett dissekerande mikroskop (10x förstoring).
- Överför 5 till 10 halshuggna flugor till 100 μL ringerbuffert (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, komplett proteinhämmare, pH 6,8) på en silikonbelagd glasrutschbana på ett svart bakgrundsstöd.
- Med dissekerande mikroskop vid en 40x förstoring, använd ett par nummer 5 tång för att hålla en fluga mellan bröstkorgen och buken, och, med andra tång, dra buken bort från bröstkorgen. Isolera snabbt testiklar och intilliggande vävnader frånflugkroppen 15 och placera i en ny droppe ringerbuffert på samma glid.
- När alla testiklar är klara rengör du testiklarna från de återstående vävnaderna (tillbehörskörtel och yttre könsorgan).
- Ta bort överskottsbufferten från droppen som innehåller de dissekerade testikorna. Använd vanligtvis en p200-pipett med en 10 μL-spets monterad ovanpå en 200 μL-spets. Detta gör det möjligt att avlägsna vätskan överskott genom en liten bländare. Placera en droppe på 4% paraformaldehydfixativ ovanpå droppen som innehåller de dissekerade testiklar och överför sedan snabbt testiklar till ett rör som innehåller färsk fixativ lösning.
2. Fixering av paraformaldehyd
- Bered 2 ml fixativ lösning strax före användning: 600 μL 4% paraformaldehyd utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 30 μL NP40 20% plus 1200 μL heptan i ett 2 ml silikoniserat mikrocentrifugrör. Använd 4% paraformaldehyd i PBS beredd i 600 μL alikvoter och lagrad vid -20°C.
Varning: Heptan och paraformaldehyd är giftiga och bör hanteras i en rökhuv. Kassera dem enligt värdinstitutets föreskrifter. - Överför testikelerna med en p200-mikropipett med en bred bländarspets till PFA/NP40/heptanlösningen. Skaka röret upp och ner i 30 s för hand. Fortsätt att fästa testiklar på en roterande blandare vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Stoppa rotationsblandaren och placera röret i ett rörställ för att möjliggöra fasseparation och för testiklar att sätta sig till botten av röret.
- Ta bort all heptan och fixeringslösningen och skölj testiklar snabbt tre gånger med 1x PBS.
- Överför till ett rent 200 μL individuellt rör. Utför alla inkubationer i dessa små rör för att minimera mängden antikroppar som används.
- Ta bort överskottsbufferten med en 200 μL mikropipett med både en P200 och en P10-spets ansluten. Var försiktig så att du inte aspirerar testiklar.
- Förvara testiklar i 1x PBS på is tills alla prover är klara.
3. Antikroppsfärgning i lösning
- Kassera PBS och lämna testibiliteterna i 0,3% PBS-T i 30 min vid rumstemperatur för att permeabilisera cellmembran.
- Förinkubera i samma buffert plus 5% normalt getserum (NGS) i 1 timme.
- Tillsätt 200 μL av den primära antikroppen utspädd i 0,3% PBS-T plus 5% NGS (Materialförteckning).
- Inkubera den primära antikroppen över natten vid 4 °C (eller rumstemperatur) med mild omrörning på en vipp.
- Tvätta 3 gånger i 0,3% PBS-T i 15 min på en vipp i rumstemperatur. Låt testiklar sätta sig till botten av röret genom gravitation.
- Tillsätt 200 μL sekundär antikropp utspädd 1:500 från DyLight konjugerade serien.
- Inkubera den sekundära antikroppen i en mörk kammare i 4 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta i 0,3% PBS-T i 15 min på en vipp i rumstemperatur. Upprepa sedan med 0,2% PBS-T och 0,1% PBS-T, varje gång i 30 min på en rocker vid rumstemperatur. Gör en sluttvätt i 1x PBS i 30 minuter för att ta bort tvättmedlet.
- Tillsätt 180 μL DAPI-lösning vid 1 μg/ml i 1x PBS i 15 minuter. Stamlösningen är 10 mg/ml i H2O. Undvik att göra stamlösning i PBS, vilket kan minska DAPI-färgningssignalen på diffus kromatin i större spermatocyter.
- Tvätta 3x i 5 min vardera.
- Använd en hydrofobisk barriärpenna för att rita en cirkel på en ren bild.
- Aspirera testikörer och sätt dem på bilden. Genom att förskölja den breda bländarspetsen med 0,1 % PBS-T förhindras testikelarna från att fastna på spetsen. Ta bort överflödig PBS.
- Tillsätt en droppe (cirka 100 μL) av Citifluor AF1.
- Placera försiktigt ett glaslock över vävnaden, var noga med att undvika att fånga luftbubblor.
- Försegla täckglaset till rutschkanan med rent nagellack.
- Observera diabilder på ett mikroskop.
4. Analys av colocalization
- Skaffa konfokala bilder. Vi använde ett Zeiss LSM 710 konfokalt mikroskop (63x Plan Apochromatic olja) med en z-upplösning på 0,5 eller 1 μm.
- Markera olika celler från oberoende testikörer.
- Importera bilder till bearbetningsprogram (t.ex. Imaris).
- Definiera kärnan genom manuell segmentering för att utesluta de närliggande kärnorna. Använd Coloc-programvaran; Den samlar pearsons korrelationskoefficienter (PCC) inuti hela volymen mellan 2 fluorforer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det största hindret för att få adekvat färgning av Drosophila-testiklar är den begränsade penetreringen av antikroppar, som delvis har lösts med hjälp av krossade preparat men till priset av att inducera en begränsning av 3D-analyserna (till exempel 3D-representation eller mått på colocalization). Förfarandet tillåter enhetlig märkning och bevarar volymen av alla celler i testiklar. Här har vi fokuserat illustrationen av metoden på 3D-representationen av S4-S5 spermatocyter, eftersom de är de största cellerna och därmed känsligare för deformation från squashing. Vi använde olika nukleära markörer, inklusive nukleoporiner och märkning av den intranukleära MINT-domänen (Mad1-innehållande Intra Nuclear Territory) som beskrivs av det mitotiska proteinet Mad112. Eftersom MINT kunde avslöjas av flera olika antikroppar, använde vi dem för att testa robustheten i protokollet för kvantitativ 3D-colocalization, en metod som kräver en korrekt rumslig upplösning.
Protokollet som beskrivs ovan tillåter förvärv av konfokala bilder av tillräcklig kvalitet för att sedan behandlas för 3D-rekonstitution. Fyra intilliggande seriella delar av ett stadium S5 spermatocyte avbildas i figur 1A, som visar en representativ immunostaining av MINT (Mad1 immunolabeling med GFP booster i rött) tillsammans med DAPI (i cyan). Kromosomerna är organiserade i de karakteristiska 3 stora distinkta klustren och MINT-strukturen visas i detalj runt DNA, intimt associerad med - men skiljer sig från - de autosomala kromatinmassorna. Resolutionen tillåter också upptäckt av förekomsten av Mad1 i kärnperiphery samt mellan de autosomala massorna av kromosomer 2 och 3. Vi använde Imaris programvara för 3D-representationen. Kärnytan definierades av mad1s låga närvaro vid kärnhöljet (i grått) och MYNT definierades av hög nivå ackumulering av Mad1 inuti kärnan (i rött) tillsammans med DAPI färgning (i blått) (Figur 1A). 3D-rekonstitutionsfilmen illustrerar väl volymen och förhållandet mellan Mad1 (vid kärnvapenkuvertet och i MINT) tillsammans med kromosomerna i steg S4-S5 spermatocyter.
Fördelningen av nukleoporiner har bara beskrivits dåligt i dessa celler, förmodligen på grund av svårigheten att upptäcka dem i dessa stora missbildskärnor. Fördelningen av Nup154 har endast rapporterats en gångtidigare 16 och Nup153 och Nup98 studerades endast i spermatogonia och små, tidiga spermatocyter17. 3D-rekonstitutioner av stora S5-spermatocyter färgade av nukleoporinnup62 och genom importin β (produkt av ketelgenen) var genomförbara och representerade i figur 1C respektive figur 1D. Dessa nukleära porrelaterade komponenter verkar icke-enhetligt fördelade över kärnvapenkanten som prickar av oregelbunden storlek. Till exempel samlas importin β runt autosomalkromatin på samma sätt som där ett laminnätverk redan har beskrivits3. Denna typ av fördelning med porrika områden och stora porfria områden har beskrivits av elektronmikroskopi i gnagare spermatocyter18. Att förstå förändringarna i lamin och nukleoporinfördelning skulle bidra till att förstå kärnhöljestrukturen i dessa G2-celler strax före manlig meios.
Samtidigt som 3D-volymen av cellerna bevaras tillåter detta protokoll också antikroppar att tränga in enhetligt i djupet av varje cell, vilket möjliggör kvantitativ analys som colocalization. Pearsons korrelationskoefficient (PCC) är ett väletablerat mått. Det kan variera från +1 (betecknar perfekt positiv korrelation) till −1 (perfekt negativ korrelation)19. För att utvärdera lokaliseringen av MINT-partnerproteiner i förhållande till Mad1 i spermatocyter har vi tidigare uppskattat PCC på en enda sektion på 0,5 μm med ImageJ i S5-spermatocyter12 (Figur 2A, B). Vi testade protokollet djupare genom att använda 3D-colocalization på hela kärnan istället för bara en yta. Volymen av atomkärnorna definierades genom manuell segmentering och PCC mättes med hjälp av Colocation-verktyget. Vi analyserade åtta S5 spermatocytkärnor, från samma testiklar eller olika testiklar. Figur 2B visar en 3D-representation av en kärna som tjänade till att mäta PCC. Figur 2D visar mätningen av PCC på åtta olika S5 spermatocytkärnor från tre olika testiklar. PCC-värdena skiljer sig inte åt, från 0,6 och 0,75, vilket indikerar ett högt värde för colocalization. Dessa kan inte avskiljas från PCC som definieras i ett enda avsnitt. Förfarandet medger således en reproducerbar enhetlig märkning och bevarar en god volym av alla testikelceller.
Eftersom protokollet tillåter tillförlitlig mätning av colocalization från oberoende testikörer, tillät det jämförelse av färgning från olika fluggenotyper. Detta illustrerades här i jämförelse med WT flugor och flugor RNAi utarmat för Mtor (genereras av uttryck av dsRNA UAS linjer och Bam-Gal4 föraren som uppnår betydande utarmning i sena spermatogonia och tidiga spermatocyter20). Som beskrivits för colocalization experiment, Mtor-RNAi-utarmade testiment och vilda typer testikör var dissekerade och fixerade tillsammans och de konfokala bilderna förvärvades under konstanta inställningar. Med respekt för dessa villkor blir jämförelsen av enskilda celler möjlig. Vi observerade att MYNTA påverkas mer än kärnhöljet av förlusten av Mtor som visas av representativa Mtor RNAi-utarmade (övre) och wt (nedre) celler (Figur 3)12.
Figur 1: Illustration av immunostaining av Drosophila S4-S5 spermatocyter atomkärnor med hjälp av olika sonder. (A) Bilder av en enstegs 5 spermatocytkärna immunstained med α-GFP antikroppar (GFP booster) som detekterar MINT-strukturen av Mad1-GFP (röd) tillsammans med DAPI färgning (blå). Det visar med precision förhållandet mellan Mad1 och de två autosomala kromatinmassorna (representerade som asterisker). Mad1 upptäcks också svagt i kärnans periferi. Alla bilder är seriella Z-projektioner av en stapel på 3 (0,5 μm) på varandra följande konfokala skivor. Konfokala bilder förvärvades på ett konfokalt mikroskop (63x, Plan Apochromatic oil DIC objektiv). Skalstänger är 5 μm. (B) Ram från en filmåtergivning av samma spermatocytkärna. Kärnytan definierades av lågt uttryck av Mad1 vid kärnhöljet (i grått) och MINT definierades av högt uttryck av Mad1 inuti kärnan (i rött). a, B) Omtryckt med tillstånd från tidigare publicerad figur (från12). (C) 3D-bild av en spermatocytkärna i stadium 5 med samtidig immunostaining av Nup62 (gul) och MINT (GFP booster i rött). Skalstången är 4 μm. (D) 3D-bild av en spermatocytkärna i stadium 5 med samtidig immunostaining av importin-β Ketel (gul) tillsammans med DNA (DAPI i blått). Skalstänger är 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: 2D- och 3D-colocalization kvantifiering av Mad1 tillsammans med Ulp1. (A) Sammanslagna bilder av en spermatocytkärna i stadium 5 immunostained med GFP booster antikropp som detekterar Mad1 (grön) och med anti-Ulp1 antikroppar (röd) representeras som en 1 μm tjock stack av en spermatocytkärna. Till höger anges Pearson-intensitetskorrelationskoefficienten beräknad med Coloc-2 ImageJ-plugin. PCC uppskattades till 0,73 (omtryckt med tillstånd från Raich12). (B) Sammanslagen bild av stadium 5 spermatocytkärna (motsvarande kärnan G i det intilliggande bordet) immunostained med GFP booster antikroppar som detekterar Mad1 (grön) och med anti-Ulp1 antikroppar (röd) representeras i en 3D-projektion. Kärnans volym definierades genom manuell segmentering. Till höger listar tabellen Pearson-intensitetskorrelationskoefficienterna beräknade på 8 olika spermatocyter (A till H) från 3 olika testiklar (1 till 3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Immunofluorescensanalys av Mtor RNAi-behandlade spermatocyter jämfört med vilda typer. Celler som tömts på Mtor med MtorRNAi(ID 110218) celler (övre paneler) och vilda typceller (nedre paneler) var färgade för Mad1-, Raf2- och Mtor-proteiner. Testikrarna var fixerade och färgade tillsammans, monterade på samma bild och bilder förvärvade med samma parametrar. RNAi-cellerna kan särskiljas från WT genom frånvaro eller närvaro av Mad1-GFP. Siffran är representativ för maximala prognoser på 4 x 0,5 μm staplar. Skalstrecket är 5 μm (Tryckt med tillstånd från tidigare publicerad figur i12). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en metod för framgångsrik immunolabeling av hela mount vuxna Drosophila testikörer. Som rapporterats i andra förfaranden måste unga män användas (vi förkortade till och med åldern till mindre än 20 timmar efter eclosion) för att minimera närvaron av utveckla spermier, vilket riskerar att hindra spermatocyterna. Dissekeringen ska vara snabb och antikroppsutspädningen måste justeras för att optimera signal-till-brusförhållandet21,22,23. Eftersom med hjälp av andra protokoll observerade vi inte färgning genom hela djupet av testiklar, vi utvecklat en fixeringsmetod som kombinerar PFA tillsammans med NP40 och heptan. Vi använder nu rutinmässigt 600 μL 4% paraformaldehyd i PBS med 30 μL 20% NP40 plus två volymer heptan. Detta är avgörande för att möjliggöra tillräcklig permeabilisering. Om du minskar mängden NP40 till 10 μL minskar märkningen på ett synligt sätt. Alla efterföljande steg utfördes i suspension och överskottsbufferten avlägsnades genom att testiklar kunde sjunka försiktigt till botten av röret genom gravitation. För det sista steget som överför prover till en bild sköljer vi spetsen i 0,1% PBS-T för att förhindra att testikelerna fastnar på konen. Enligt observationer fungerar det immunohistologiska färgningsprotokollet bra med en mängd olika nukleära proteiner, inklusive de markörer som används här, liksom sonder av epigenetiska histonmodifieringar, lamin och nukleoporiner. Vi noterar att protokollet också kan användas för larvtest, i vilket fall heptan bör utelämnas, eftersom det gör testiklar svårare att återställa intakta.
Protokollet är särskilt utformat för att upprätthålla oskadade staplar av spermatocyterna tillsammans för en effektiv och enhetlig märkning av testiklarna. Vi illustrerade protokollet med de stora sena spermierna, vars missbildar kärnkärnor gör dem bland de svåraste cellerna att bevara. Dessutom, i dessa spermatocyter blir nukleär märkning ofta utspädd förmodligen på grund av kärnans storlek. Till exempel observeras det ofta att DAPI- eller laminmärkning är starkare i cellerna vid testis apex och blir gradvis svagare och mer spridd när spermatocyternaväxer 3,24. Detta kan också vara en av anledningarna till att fördelningen av nukleoporiner endast har beskrivits i tidigare stadium celler (spermatogonia och tidiga spermatocyter)17.
Utmärkta bilder av immunostaining av Drosophila S5 spermatocyter har publicerats, särskilt för testiklar-specifika t-BRD och dany proteiner25,26 med antingen 0,3% natrium deoxycholate protokoll eller efter squashing avvävnaden 21,22. I våra händer leder squasher till en betydande icke-likformighet av färgning i djupet av organet och också offra 3D-strukturen. Även om användningen av 0,3% natriumdeoxycholat gav bättre resultat, observerade vi fortfarande icke-enhetlighet. Således föredrar vi NP40 för dess reproducerbarhet och kvalitet på märkning. De konfokala bilderna tillåter rekonstruktion av 3D-bilder för nukleära proteiner. Till exempel har vi framgångsrikt tillämpat denna metod med många olika sonder, illustrerade här av den intranukleära MINT-domänen, intimt associerad med autosomala kromatinmassor och kärnpornätverket. Spännande 3D-fördelning av nukleära porer av dessa spermatocytkärnor är nu tillgänglig för ytterligare studier. Bilderna tillåter reproducerbar kvantifiering av colocalization från olika spermatocyter från samma testikel och från olika testiklar. Vår kännedom om detta är första gången som korrekt kvantifiering av Pearson korrelationskoefficient har mätts på sådana prover. Det ger det förtroende som krävs för korrekt immunolabelled protein nivåer jämförelse av olika testikörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura för antikroppar och A. Debec, Bloomington och Wien lager för flugor. Tack till C. Jackson för förslag och stimulerande diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Vienna Drosophila RNAi Center |
| Materials | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | Stock solution must be prepared in H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Wide Bore Pipette Tips | Fisherbrand | 11917744 | Wide aperture tip |
| Thermo Scientific 0.2 mL Individual Tube | Thermo | AB-0620 | |
| 2 ml micro centrifuge tubes | Sigma | T3531-200EA | Siliconized 2ml tube |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyde 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X ; aliquot by 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, no calcium, no magnesium |
| 0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T | PBS 1X containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, for molecular biology, | Sigma | T8787 | |
| Antibodies | |||
| GFP booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Mouse anti-Mtor | 1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University | ||
| Rat anti-Nup62 | 1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK | ||
| Guinea-pig anti-Ulp1 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| Rabbit anti-Raf2 | 1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam | ||
| DyLight conjugated series | Thermo | 1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse, rabbit or rat) as second antibodies |
References
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
- Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
- Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
- Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
- White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
- Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).
- Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
- Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
- Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S.
- Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
- Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
- Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
- White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
- Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
- Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
- Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).
