Summary
نقدم نهج أنبوب داخلي لتقنية الكفة لزراعة القلب غير الرحمي الماوس لمساعدة إيفرت السفينة على الكفة. وجدنا أن التعاون بين اثنين من الجراحين ذوي الخبرة بشكل ملحوظ يقصر وقت العملية.
Abstract
تم إجراء عملية زرع القلب مورين لأكثر من 40 عاما. مع التقدم في الجراحة المجهرية ، تم استخدام تقنيات جديدة معينة لتحسين الكفاءة الجراحية. في مختبرنا، قمنا بتحسين تقنية الكفة مع خطوتين رئيسيتين. أولاً، استخدمنا تقنية الأنبوب الداخلي لإدخال أنبوب داخلي مؤقت في الوريد الوداجي الخارجي والأوعية الدموية الشريان السباتي لتسهيل تحويل الوعاء على الكفة. ثانيا، قمنا بزراعة القلب غير الرحمية بالكامل من خلال تعاون جراحين من ذوي الخبرة. وقد خفضت هذه التعديلات بشكل فعال وقت التشغيل إلى 25 دقيقة، مع نسبة نجاح 95٪. في هذا التقرير، نحن وصف هذه الإجراءات بالتفصيل وتقديم فيديو إضافي. ونحن نعتقد أن هذا التقرير عن تحسين تقنية الكفة سوف تقدم التوجيه العملي لزرع القلب غير الرحمي المورين، وسوف تعزز فائدة هذا النموذج الماوس للبحوث الأساسية.
Introduction
وكان إنشاء زرع القلب الماوس غيريروتوبيك من خلال نهاية إلى نهاية anastomosis داخل البطن في عام 1973 معلما رئيسيا في البحوث الأساسية مناعة زرع1. قدم هذا النموذج أداة هامة وصالحة لتحليل آليات الإقفار إصابة2, رفض مناعي , و التسامح3,4. ومع ذلك، فإن الطبيعة المعقدة والمستهلكة للوقت للجراحة وكذلك احتمال الإصابة بالعدوى يمكن أن تؤدي إلى الالتصاقات البطنية الحادة حول العملية وردود الفعل الالتهابية، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة نموذج زرع القلب غيريروتوبيك.
وقد وصفت تقنية زرع القلب غير الرحمي عنق الرحم لأول مرة من قبل تشن في عام 19915. في هذا النموذج، يتم استنشاق الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي إلى الشريان الرئوي للكسب غير المشروع ويتم استئصال الشريان السباتي إلى الشريان الأورطي الصاعد. المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب هي الراحة للرصد والحد من الصدمة للمتلقي. في نفس العام، وصف ماتسورا تقنية محسنة، حيث تم ثني نهاية الوريد الوداجي الخارجي والشريان السباتي فوق كفة تفلون وثابتة بأربطة حريرية محيطية6. كما قام بعض الباحثين بسد الكفة إلى الشريان الرئوي الأيمن في قلب المتبرع قبل إدخال الكفة في الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي7. حتى الآن، وقد تم تطبيق تقنية الكفة على نطاق واسع في مختلف نماذج زرع الرّاقي الوعائيّة، بما في ذلك تلك الخاصة بالرئتين8،الكبد9،والزرع الكلوي10.
حتى الآن، هناك العديد من الصعوبات المرتبطة تقنية الكفة. على سبيل المثال، من الصعب على الشريان السباتي إلى إيفرت على الكفة بسبب مرونة إضافية، مما أدى إلى الأنسجة التقليب إلى الوراء. وبالتالي، قد تكون هناك حاجة إلى ممارسة إضافية ومتوسعة مجهرية لإكمال هذه الخطوة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يستغرق إعداد الأوعية العنقية ما يصل إلى 25 دقيقة.
لحل هذه القضايا، نقدم تقنية الأنبوب الداخلي، والتي تعتمد على تقنية الكفة وتشمل تثبيت الكفة على الوريد الوداجي الخارجي والشريان السباتي باستخدام أنبوب داخلي للمساعدة في الإباء من جدار الوعاء. وبالإضافة إلى ذلك، مع التدريب البسيط، يتم تخفيض إعداد المتلقي إلى 15.5 دقيقة. هذه التقنية يقلل من تعقيد العملية ولا تتطلب ممارسة إضافية أو استخدام موسع الأوعية الدموية. ويمكن تطبيقها في جميع البحوث المناعية زرع، وخاصة للتحقق من طرف ثالث التسامح المناعي الذي يتلقى المتلقي اثنين من allografts القلب، واحد داخل البطن والآخر في الرقبة11. كما نوصي بالتعاون بين جراحين ماهرين لإنشاء هذا النموذج، حيث يقوم أحد الجراحين بإعداد الحيوان المتلقي والآخر الذي يقوم بحصاد وزرع قلب المتبرع. ويمكن لهذا التعاون تقصير وقت التشغيل إلى 25 دقيقة. باستخدام هذا الإجراء الأمثل، أنشأنا syngeneic، الزوج12،,13،,14،,15،,16،,17،,18،,19،وxenogeneic فأر زرع القلب نماذج20.
وكان الأساس المنطقي لتطوير تقنية الأنبوب الداخلي هو تقليل وقت التشغيل لإنشاء نموذج زرع قلب الفأر بمعدل نجاح مرتفع. تحسين نموذج زراعة القلب العنقي يسهل الحصول على معدلات نجاح عالية في فترة قصيرة من وقت الجراحة مقارنة مع تقنية الخياطة التقليدية والكفة21. علاوة على ذلك، يمكن لنموذج التعاون تقليل الوقت الإقفار الدافئ للقلب المانح مقارنة بالعمليات الجراحية التي تتم مع مشغل واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الحيوانات (BALB / c، C57BL/6، الذكور، 8-12 أسبوعا) يتم إيواء في منشأة محددة خالية من مسببات الأمراض في جامعة شيامن مركز الحيوانات المختبرية. ويستخدم C57BL/6 كمتلقي ويستخدم BALB/c كمتبرع. يتم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (IACUC).
ملاحظة: مجموعة من الأدوات الجراحية الدقيقة، بما في ذلك مقص الصغرى، ملقط مستقيمة الصغرى، ملقط منحنية الصغرى وأصحاب الإبرة الصغيرة، ضرورية للعملية (الجدول والمواد، الشكل 1B، C، D، E). زوج واحد من المشابك البلدغ واحد الاستخدام(الشكل 1F)وهناك حاجة. يتم إعداد الأصفاد اثنين للورد الوداجي الخارجي والشريان السباتي عن طريق قطع أنابيب البولي أميد المخصصة مع مشرط رقم 10 تحت المجهر. قطر الوريد والشريان هو 0.9 مم و 0.55 ملم ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قطر الأنبوب الداخلي للوقي المقابل للرقي هو 0.6 مم ، وهذه من الأنبوب الداخلي للصفة الشريانية المقابلة هي 0.28 مم (الشكل 1G).
1 - إعداد المتلقي
- تخدير الفأرة المتلقي مع pentobarbital (60 ملغم / كغ ، i.p). استخدام المقصات الميكانيكية الاتراومية لإزالة الشعر في منطقة عنق الرحم الجانبي الأيمن.
- استخدام قضيب طرف القطن العقيمة لمسح المنطقة الجراحية مع مطهر اليود تليها 70٪ الإيثانول.
- ضع الماوس في موضع supine على منصة التشغيل. تغطية الماوس مع الشاش العقيمة.
- استخدم مقصًا لـ ophthalmic لإجراء شق مستعرض من خط منتصف الرقبة السفلي من الثلث إلى مفصل الكتف الترقوة الأيمن.
- عزل الوريد الوداجي الخارجي الأيمن مع ملقط منحنية صغيرة لفضح ما يكفي من الطول، وقطع الفروع عن طريق التخثر الكهربائي، وligate السفينة في نهاية القعر باستخدام خياطة الحرير 6-0.
- المشبك الوريد الوداجي الخارجي proximally باستخدام المشبك بلدغ ومن ثم تحويل الوريد proximally إلى الرباط باستخدام مقص صغير.
- غسل تجويف السفينة مع 100 U/mL 0-4 ° C heparinized المالحة لإزالة أي الدم المتبقية.
- سحب الوريد الوداجي الخارجي من خلال الكفة الوريدية باستخدام ملقط مستقيمة الصغرى; إدراج الوريد الداخلي أنبوب في التجويف باعتباره الدعامة، و evert جدار السفينة على الكفة مع ملقط مستقيمة الصغرى(الشكل 2A).
- إصلاح endothelium السفينة everted في الطرف القريب من الكفة باستخدام 8-0 ظرفي خياطة الحرير (الشكل 2B).
- استخدام ملقط مستقيمة الصغرى لسحب الوريد الداخلي أنبوب من وعاء الوريد.
- قم بإجراء تشريح حاد مع ملقط منحنية صغيرة لعزل الشريان السباتي الأيمن المجاور للحافة الداخلية للرونميوماستوئي.
- المشبك الشريان السباتي الأيمن proximally باستخدام المشبك البلدغ، ligate الشريان السباتي distally باستخدام خياطة الحرير 6-0، واستخدام مقص صغير لإعادة تحديد الشريان السباتي proximally إلى الرباط.
- غسل الشريان السباتي مع 100 U/mL 0-4 درجة مئوية heparinized المالحة لإزالة أي الدم المتبقية.
- تمرير الشريان السباتي من خلال كفة الشريان وأدخل الشريان الداخلي أنبوب في وعاء الشريان باستخدام ملقط مستقيم الصغرى(الشكل 2C).
- إيفرت السفينة على الكفة باستخدام ملقط مستقيمة الصغرى; إصلاح endothelium السفينة everted باستخدام circumferential 8-0 خياطة الحرير (الشكل 2D).
- سحب الأنبوب الداخلي الشريان من وعاء الشريان مع ملقط مستقيمة الصغرى.
ملاحظة: الحفاظ على الغدة دون المهاوية للمستلم.
2 - إعداد المانحين
- تخدير الفأر المانح باستخدام pentobarbital (60 ملغم/كغ، i.p). استخدام المقصات الميكانيكية الاتراومية لإزالة الشعر في منطقة البطن.
- ضع الماوس في موضع supine على منصة التشغيل. تغطية الماوس مع الشاش العقيمة.
- استخدام قضيب طرف القطن العقيمة لمسح المنطقة الجراحية مع مطهر اليود تليها 70٪ الإيثانول.
- إجراء شق في منتصف البطن مع مقص العيون وفضح تجويف البطن.
- استخدام ملقط المنحنية الصغرى لفضح الوريد السفلي cava، ومن ثم حقن عن طريق الوريد 200 ميكرولتر من 100 U/mL 0-4 °C heparinized المالحة لكل 20 غرام من وزن الجسم من خلال الوريد السفلي الكافا.
- أداء thoracotomy مع مقص العيون، وقطع الأضلاع من خلال شقوق خط منتصف الساكسل الثنائية، الوجه جدار الصدر الأمامي إلى الخارج لفضح تجويف الصدر.
- اكوس الغدة الصعترية مع ملقط منحنية صغيرة.
- فضح الشريان الأورطي، ومن ثم 200 μL من 100 U/mL 0-4 درجة مئوية heparinized المالحة إلى الشريان التاجي من خلال القوس الأبهر.
ملاحظة: تجنب الضخ أي فقاعات الغاز في قلب المانحة. - استخدام مقص صغير لتنقص الشريان الأورطي التصاعدي في بداية القوس الأبهري.
- احول الشريان الرئوي في بداية الفرعين الرئيسيين مع مقص صغير.
- Ligate فينا كافا متفوقة وسفاح الوريد السفلية cava بالوكالة باستخدام خياطة الحرير 6-0 واستخدام مقص صغير لتنفط الوريد distally إلى الرباط.
- Ligate الأوردة الرئوية معا، محيطا، وذلك باستخدام خياطة حريري واحد 6-0، وقطع فروع الوريد distally إلى الرباط باستخدام مقص صغير.
- إزالة الكسب غير المشروع القلب من الأنسجة الرخوة المحيطة بها; الحفاظ عليه في 0-4 درجة مئوية heparinized المالحة.
3. زرع القلب
- ضع قلب المتبرع رأساً على عقب في منطقة الرقبة اليمنى للمتلقي.
- أدخل الشريان الرئوي للقلب المانح إلى حلقة حريرية 6-0 مع ملقط مستقيمة صغيرة.
- التفاف تجويف السفينة حول الكفة الوريد، ومن ثم تشديد حلقات خياطة الحرير 6-0 حول الكفة لتربط مفصل السفينة.
- إجراء استئصال الشريان الأورطي من الكسب غير المشروع وكفة الشريان باتباع الخطوات الموضحة في الخطوة 3.2.
- حرر الوريد الوداجي المشبك متبوعاً بالشريان الوداجي المشبك. الحفاظ على السفينة المشتركة untwisted وضمان أن تدفق الدم هو دون عائق.
ملاحظة: يعتبر إيقاع الجيوب الأنفية العائد إلى أكثر من 200 مرة في غضون 1 دقيقة طبيعي. - ترطيب القلب المانح باستخدام ماء ملحي دافئ (37 درجة مئوية) وفحص ما إذا كان الكسب غير المشروع ينزف أم لا. تعيين الكسب غير المشروع القلب النابض في الفضاء تحت الجلد، ومن ثم خياطة شق.
4. الرعاية بعد الجراحة وتقييم الكسب غير المشروع
- سجل الوقت إلى إيقاع الجيوب الأنفية الطبيعية والحفاظ على إيقاع الجيوب الأنفية الطبيعية لمدة 5 دقائق على الأقل بعد إطلاق المشبك لمراقبة وظيفة الكسب غير المشروع بعد العملية الجراحية.
- ضع المتلقي وحده على بطانية دافئة حتى يستيقظ المتلقي من التخدير. إدارة مسكة البوبرينورفين، 0.05 ملغم / كغ، s.c، في نهاية الجراحة وكل 12 ساعة لمدة 72 ساعة بعد الجراحة.
- تسجيل الوزن وحالة الاسترداد بعد العملية الجراحية للمستلم يوميًا. في حالة > 15٪ فقدان الوزن بالنسبة إلى ذلك في تاريخ الجراحة، شلل الشلل العضلي، أو العدوى، euthanize المتلقي عن طريق استنشاق isoflurane محطة21.
- مراقبة البقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع عن طريق الجس يوميا. تعتبر الجراحة ناجحة إذا نجا المورين allograft لمدة >72 ساعة. الصف وظيفة الكسب غير المشروع, كما ذكر سابقا22: مقياس 3 - نبض بقوة والتردد; الجدول 2 - أقل نبض؛ مقياس 1- الرجفان والرفض الوشيك؛ أو مقياس - 0، وفقدان ضربات القلب والرفض الكامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقت العملية الجراحية
بعد التدريب، يمكن للجراح الماهر إجراء العملية بنجاح في غضون 35 دقيقة باستخدام تقنية الأنبوب الداخلي، حيث يلزم حوالي 15.5 دقيقة لإعداد المتلقي، و10.9 دقيقة لإعداد المتبرع، و4.4 دقيقة مطلوبة لمصابي حشرات القلب المانحة. يتم تقليل وقت الإقفار البارد والدافئ (من إعداد المانحين إلى زرع القلب) إلى 15.3 دقيقة مقارنة بالعملية باستخدام تقنية الكفة دون تقنية الأنبوب الداخلي وتقنية الخياطة(الجدول 1)21.
لقد صممنا نموذج تعاون لزيادة تحسين كفاءة العملية. كما هو مبين في التخطيطي (الشكل 3)، يبدأ أحد الجراحين في إجراء إعداد المتلقي أولاً ، يليه بدء إعداد المتبرع من قبل جراح ثان بعد 4-5 دقائق. بعد 15-16 دقيقة، يجب أن يكون الجراح الأول قد انتهى من إعداد المتلقي، وعند هذه النقطة الجراح الثاني بعد الانتهاء من حصاد قلب المانحة، يجب أن تبدأ anastomosing قلب المتبرع داخل المتلقي. يتطلب نموذج التعاون هذا أن يتم تدريب كل جراح على جزء واحد فقط من تقنية الكفة ويقصر وقت العملية الإجمالية إلى 25 دقيقة تقريبًا. تحليل > 600 زرع المورين غيريروتوبيك التي أجريت عن طريق التعاون بين اثنين من الجراحين على مدى العامين الماضيين في معهد زرع الأعضاء في جامعة شيامن يشير إلى معدل نجاح زرع القلب باستخدام هذه التقنية تصل إلى 95٪.
بقاء الـ Major Histocompatibility مجمع القلب غير متطابق ومطابقة ترقيع القلب
وقد استخدم مجمع الهيستوتيايتيال الرئيسي (MHC)، المسمى "H-2"، لتحديد أوجه التفاوت والتشابه الجينية. يمكن أن تؤدي مستضدات MHC غير المتطابقة من المانحين إلى رفض الكسب غير المشروع من خلال التفاعل المباشر مع الخلايا التائية المتلقية أو بشكل غير مباشر باعتبارها الببتيدات المشتقة من MHC المانحة التي تم التعبير عنها على جزيئات MHC المتلقي23. يمكن رفض قلب allograft غير متطابقة تماما MHC بالب / ج (H-2d)، مع متوسط وقت البقاء على قيد الحياة من 7.5 أيام بعد زرع في C57BL /6 (H -2ب)الفئران المتلقية (الشكل 4A). في دراساتنا، نجت عمليات زرع القلب السينيجينية أكثر من 100 يوم، باستثناء حالة نادرة واحدة بسبب فقدان الوزن بنسبة 15٪ مقارنة بالوزن الطبيعي قبل العملية.
يمكن حصاد allografts القلب لفحص الأمراض الهستوولوجية في وقت الرفض. يظهر الشكل 4B ظهور خصائص الرفض بوساطة الخلايا، مثل تسلل الخلايا الالتهابية، وذمة الأنسجة، وانسداد الأوعية الدموية الدقيقة. الطعوم السينيجينية قريبة من الطبيعي مع عدم وجود دليل على نخر myocyte أو تسلل الخلايا الالتهابية.
تأثير الأنبوب الداخلي على إندورفيليوم الأوعية الدموية
لتقييم الضرر على endothelium الأوعية الدموية بعد إدخال الأنبوب الداخلي في تجويف، بعد 100 يوم من زرع القلب syngeneic، يمكن جمع بطانة الأوعية الدموية من موقع مرض الاستئصال وملطخة بالفلورس المناعي. في هذا التحليل، لم يلاحظ تضييق واضح من جدار الأوعية الدموية، تجلط الدم، أو سماكة من intima(الشكل 4C). كشف التصوير المجهري الإلكتروني أن بطانة ناعمة وتشكيل قمة طولية منتظمة ، مع الخلايا البطانية مرتبة بدقة وعن كثب ، مع عدم وجود رواسب واضحة على السطح (الشكل 4D).
الشكل 1: مجموعة من الأدوات الجراحية العقيمة:
(أ) الملقط الناعم والمقص العيني؛ (B) ملقط منحنية صغيرة؛ (C) المهازكات الصغرى مستقيمة؛ (د)أصحاب الإبر الصغرى؛ (E) مقص صغير؛ (F) بلدغ المشابك؛ (G) الشريان الداخلي أنبوب (السهم الأحمر منقط) والكفة (السهم الأحمر الصلبة) ، جنبا إلى جنب مع الوريد الداخلي أنبوب (السهم المنقط الأسود) و الكفة (السهم الأسود الصلبة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد المتلقي.
(أ) أدخل الأنبوب الداخلي الوريدي في وعاء الوريد الوداجي الخارجي؛ (B) إيفرت وعاء الوريد فوق الكفة وإصلاحه باستخدام 8-0 circumferential خياطة الحرير ، ولكن (C) أدخل الأنبوب الداخلي الشرياني في تجويف الأوعية الشريانية؛ (D)إيفرت وعاء الوريد فوق الكفة وإصلاحه باستخدام 8-0 circumferential خياطة الحرير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: وقت التشغيل لكل خطوة في زرع المورين غيرين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: (أ) الكسب غير المشروع القلبي الوقت البقاء على قيد الحياة. كابلان ماير مؤامرة عرض بقاء allografts القلب (BALB / c) والطعوم syngeneic (C57BL /6) من الفئران المانحة المزروعة في C57BL / 6 الفئران المتلقية (ن = 12 الفئران / المجموعة) ؛ (ب) الفحص المجهري لـ C57BL/6 (يسار) الأيزوجرافت والوحشية من النوع BALB/c Allograft (يمين) في اليوم 7 بعد الزرع (قضبان المقياس، 50 أم؛ تكبير × 400)؛ (C)Immunofluorescence (أشرطة مقياس, 50 ميكرومتر; التكبير × 400) (D) مسح المجهر الإلكتروني من Endothelium الأوعية الدموية في زرع (يسار) والسذاجة (يمين) المتلقي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تقنية مرض الانستومات | وقت إعداد المستلم | وقت إعداد المانحين | زرع القلب مرة | الباردة والدافئة نقص التروية الوقت | إجمالي وقت التشغيل | |
| 5 عنق الرحم هيتروتوبيك | خياطه | ن | ن | ن | < 45 دقيقة | ن |
| 6 عنق الرحم هيتروتوبيك | الكفه | 45 دقيقة | 15 دقيقة | 10 دقيقة | ن | ن |
| 24 غيريروتوبيك عنق الرحم | الكفه | 15 دقيقة | 20 دقيقة | 15 دقيقة | 25-40 دقيقة | < 60 دقيقة |
| 25 البطن هيتروتوبيك | خياطه | ن | ن | ن | ن | 35 دقيقة |
| 7 عنق الرحم هيتروتوبيك | الكفه | ن | 20 دقيقة | ن | 30 دقيقة | 35 دقيقة |
| 26 عنق الرحم هيتروتوبيك | الكفه | ن | 20 دقيقة | 20 دقيقة | < 35 دقيقة | ن |
| 4 البطن هيتروتوبيك | خياطه | 60-70 دقيقة | 6-7 دقائق | ن | ن | 75 دقيقة |
| 21 عنق الرحم هيتروتوبيك | الكفه | ن | ن | 7 دقائق | 20 دقيقة | 45 دقيقة |
| 27 البطن هيتروتوبيك | خياطه | ن | 10-15 دقيقة | ن | ن | 45-60 دقيقة |
| 28 عنق الرحم هيتروتوبيك | الكفه | 25 دقيقة | 20 دقيقة | 15 دقيقة | 20 دقيقة | 60 ± 8 دقائق |
| 29 عنق الرحم هيتروتوبيك | الكفه | 31.9 دقيقة | 21.1 دقيقة | 5.1 دقيقة | 28.5 دقيقة | 57.8 ± 3.9 دقيقة |
| 29 عنق الرحم هيتروتوبيك | خياطه | 25.2 دقيقة | 20.5 دقيقة | 30.8 دقيقة | 51.3 دقيقة | 83.9 ± 2.9 دقيقة |
| عنق الرحم Heterotopic في بروتوكول لدينا | الكفه | 15.5 دقيقة | 10.9 دقيقة | 4.4 دقيقة | 15.3 دقيقة | 35 دقيقة |
| (عملية واحدة) | ||||||
| 23 دقيقة | ||||||
| (التعاون) |
الجدول 1: مقارنة الزمن من مراحل مختلفة في مختلف تقنيات زرع القلب ماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نماذج زرع قلب الماوس هي أدوات مهمة لأبحاث علم المناعة زرع، والأدوات والمواد اللازمة لتقييم الآليات المناعية لهذا النموذج وعدد كبير من الفئران المعدلة الجينات المتاحة. ومع ذلك، فإن التحديات التقنية المجهرية، مثل خياطة السفن والإيجاز، حدت من استخدامها على نطاق واسع. في هذه الدراسة، قمنا بدراسة بعض التحديات التقنية الأساسية لزراعة القلب murine وحصلنا على نتائج جيدة. خطوة حاسمة من البروتوكول إدخال أنبوب داخلي في التجويف كدعامة ل إيفرت جدار السفينة فوق الكفة. هذه الخطوة الأمثل يحل التحدي التقني من everting الأوعية الشريان بسبب الحاجة إلى امتداد واسعة. يمكن للأفراد الذين ليس معهم مهارة الجراحة الدقيقة البدء في تنفيذ هذه التقنية بعد شهرين من التدريب ، والتي ستساعد أيضًا في التطبيق الواسع لهذا النموذج.
في تجربتنا، فإن أنبوب داخلي مناسب يعزز نتائج الزرع. يجب أن يكون القطر الخارجي للأنبوب الداخلي أصغر قليلاً من القطر الداخلي للوعاء الدموي المتلقي. وعلاوة على ذلك، ينبغي استخدام أنابيب البولي بروبلين حادة أو اسطوانات مع سطح زلق كما النوى الداخلية المؤقتة لتجنب إتلاف بطانة الأوعية الدموية. في أيدينا ، لم يحدث تجلط في 5 ٪ من النماذج التي فشلت ، على الرغم من الخثرة هو عامل رئيسي للفشل بعد التهاب الدم باستخدام تقنية الغرز. باستخدام هذه النماذج الناضجة ، نشرت مختبراتنا العديد من المقالات البحثية الأساسية التي تم التعرف عليها من قبل المراجعين الأقران14،15،16،17،18،19.
لم تكن العمليات الجراحية التي أجريت في غضون 35 دقيقة مختلفة بشكل كبير مقارنة بتقنية الكفة التقليدية ، ولكن وقت نقص التروية البارد والدافئ كان أقل بكثير من التقنيات الأخرى(الجدول 1). استخدام نموذج التعاون يقلل من متوسط وقت العملية إلى 23-25 دقيقة، وهو ما ينعكس في وقت التخدير من الماوس المتلقي وفي وقت زرع القلب المانح. ميزة أخرى من تقنية الكفة أنه يحد من الوقت الحار الإقفارية (الجدول 1). كما لا يتم استخدام كيس الثلج لحماية الكسب غير المشروع للقلب من درجة حرارة الجسم الدافئة من المتلقي الماوس، والوقت هوتورية دافئة ما يعادل الوقت anastomosis. تقنية الكفة الأمثل ينطوي على إعداد كل من الأصفاد على المتلقي لتبسيط إجراء تناضح الدم وبناء عليه يقصر الوقت تانتومسيس. ولذلك، فإن تقنية الكفة تحد من الوقت الحار لـ 4.4 دقيقة في المتوسط.
ومع ذلك، هناك بعض الخطوات الرئيسية لملاحظة مع تقنية جديدة مناقشتها. تأكد من الحفاظ على الغدة دون الرمدية من الفأر المتلقي في زرع القلب غير المتغايرة العنق30، كما يمكن استخدام الغدة دون المناظرة لإصلاح الكسب غير المشروع للقلب وتجنب التواء الأوعية. تجنب إتلاف العصب المبهم عند عزل الوريد الوداجي الخارجي والشريان السباتي، حيث يمكن أن تؤدي الإصابة إلى هبتة الرقبة في المستلم. وينبغي الحفاظ على الضغط من المشابك البلدغ في 20-25 غراما لتجنب إصابة مقطع أو تسرب السفينة. غسل تجويف الأوعية والأصفاد مع 0-4 درجة مئوية heparinized المالحة لإزالة أي فقاعات الدم والغاز المتبقية؛ وهذا يمنع الانسداد في الطعوم بعد إعادة ضخ. استخدام حقنة 1 مل لضخ المتبرع مع 0-4 درجة مئوية heparinized المالحة وزيادة السرعة إلى 50 ميكرولتر في الثانية للحفاظ على الضغط المناسب. أثناء التهاب الأوعية، لا ينقّز الـ 8-0 المحيطي الغرز (تستخدم لإصلاح endothelium الأوعية الدموية everted إلى الأصفاد) في تجويف الشرايين الكسب غير المشروع.
على الرغم من وجود قيود على نموذج التعاون ، والتي تشمل الحاجة إلى تقنيات الجراحة المجهرية ، وتوافر مجاهر متزامنة ، ومضاعفة عدد الجراحين المهرة ، فقد أظهرت مع ذلك أنها نهج ناجح لإجراء زرع الأعضاء الوعائية. وقد يسهم تطبيقها الأوسع في تطوير بروتوكولات جديدة مثبطة للمناعة ودراسة آليات الرفض الحاد والمزمن في منطقة الزراعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل مشروع البحوث المشتركة للتثقيف الصحي في مقاطعة فوجيان (WKJ2016-2-20)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81771271 و81800664)، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2018YFA010) 8304) ومشروع التعليم والبحث العلمي للمعلمين الشباب ومتوسطي العمر في مقاطعة فوجيان (JAT170714)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هونان الصينية (2019JJ50842) والمواهب الشبابة Huxiang من مقاطعة هونان (2019RS2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artery cuff | Self-made | Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm | |
| Artery inner tube | Self-made | Polyamide tube. Diameter: 0.28mm | |
| Micro curved forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA3050 | 1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook |
| Micro needle holders | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA2050 | 0.2-mm tip |
| Micro scissors | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA1050 | Straight, blade length: 10 mm |
| Micro straight forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA3060 | 0.15-mm tip without a hook |
| Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps | Scanlan International Inc | 1001-531 | Clamping pressure 20–25 grams |
| Vein cuff | Self-made | Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm | |
| Vein inner tube | Self-made | Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).
- Que, W., et al. Prolonged cold ischemia time in mouse heart transplantation using supercooling preservation. Transplantation. , (2019).
- Wang, C. Y., et al. Suppression of murine cardiac allograft arteriopathy by long-term blockade of CD40-CD154 interactions. Circulation. 105 (13), 1609-1614 (2002).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52 (6), 1099-1101 (1991).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
- Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. 25 (1), 76-79 (2005).
- Li, W., et al. Surgical technique for lung retransplantation in the mouse. Journal of Thoracic Disease. 5 (3), 321-325 (2013).
- Kamada, N., Calne, R. Y. A surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), Pt 1 64-69 (1983).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PLoS One. 8 (10), 77278 (2013).
- Miller, M. L., et al. Spontaneous restoration of transplantation tolerance after acute rejection. Nature Communications. 6, 7566 (2015).
- Lin, Y., et al. Overexpression of Jagged-1 combined with blockade of CD40 pathway prolongs allograft survival. Immunology and Cell Biology. 93 (2), 213-217 (2015).
- Xie, B., et al. Combined costimulation blockade inhibits accelerated rejection mediated by alloantigen-primed memory T cells in mice. Immunological Investigations. 38 (7), 639-651 (2009).
- Shao, W., et al. Combination of monoclonal antibodies with DST inhibits accelerated rejection mediated by memory T cells to induce long-lived heart allograft acceptance in mice. Immunology Letters. 138 (2), 122-128 (2011).
- Dai, H., et al. Blockade of CD27/CD70 pathway to reduce the generation of memory T cells and markedly prolong the survival of heart allografts in presensitized mice. Transplant Immunology. 24 (4), 195-202 (2011).
- Yan, G., et al. Inhibition of accelerated rejection mediated by alloreactive CD4(+) memory T cells and prolonged allograft survival by arsenic trioxide. Immunological Investigations. 42 (5), 438-454 (2013).
- Yan, G., et al. Inhibiting accelerated rejection mediated by alloreactive CD4(+) memory T cells and prolonging allograft survival by 1alpha,25-dihydroxyvitamin D(3) in nude mice. Immunology Letters. 149 (1-2), 54-61 (2013).
- Lin, Y., et al. Arsenic trioxide is a novel agent for combination therapy to prolong heart allograft survival in allo-primed T cells transferred mice. Transplant Immunology. 25 (4), 194-201 (2011).
- Shao, W., et al. CD44/CD70 blockade and anti-CD154/LFA-1 treatment synergistically suppress accelerated rejection and prolong cardiac allograft survival in mice. Scandinavian Journal of Immunology. 74 (5), 430-437 (2011).
- Li, Y., et al. A highly reproducible cervical cuff technique for rat-to-mouse heterotopic heart xenotransplantation. Xenotransplantation. , (2017).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Felix, N. J., et al. H2-DMalpha(-/-) mice show the importance of major histocompatibility complex-bound peptide in cardiac allograft rejection. Journal of Experimental Medicine. 192 (1), 31-40 (2000).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64 (11), 1598-1601 (1997).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Wang, K., Zhang, N., Li, H. Improved technique of mouse heterotopic heart graft retransplantation. Microsurgery. 26 (3), 200-202 (2006).
- Plenter, R. J., Grazia, T. J. Murine heterotopic heart transplant technique. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Ratschiller, T., et al. Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Experimental and Clinical Transplantation. 8 (3), 245-249 (2010).
- Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Submandibular Gland-preserving Technique for Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice. Transplantation. 102 (11), 464-465 (2018).
