Summary
Astrocytter fliser hjernebarken jevnt, noe som gjør analysen av deres komplekse morfologi utfordrende på cellenivå. Protokollen som tilbys her bruker flerfarget merking basert på in utero elektroporasjon for å utpekulere kortikale astrocytter og analysere deres volum og morfologi med en brukervennlig bildeanalyserørledning.
Abstract
Protoplasmaiske astrocytter (PrA) som ligger i musen hjernebarken er tett sidestilt, og danner en tilsynelatende kontinuerlig tredimensjonal matrise på voksenstadier. Så langt, ingen immunstaining strategi kan enkelt dem ut og segmentere sin morfologi i modne dyr og i løpet av kortikogenese. Kortikal PrA stammer fra forfedre som ligger i dorsal pallium og kan lett målrettes ved hjelp av in utero elektroporering av integrerende vektorer. En protokoll presenteres her for å merke disse cellene med multiaddressable genom-integrerende farge (MAGIC) Markører strategi, som er avhengig av piggyBac / Tol2 transposisjon og Cre /lox rekombinasjon til stochastically uttrykke distinkte fluorescerende proteiner (blå, cyan, gul og rød) adressert til bestemte subcellulære rom. Denne flerfargede skjebnekartleggingsstrategien gjør det mulig å markere in situ nærliggende kortikale stamfarer med kombinasjoner av fargemarkører før starten av gliogenese og å spore deres etterkommere, inkludert astrocytter, fra embryonale til voksne stadier på individcellenivå. Semi-sparsom merking oppnådd ved å justere konsentrasjonen av elektroporated vektorer og fargekontraster levert av Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC eller MM) gjør det mulig å individualisere astrocytter og utpeke deres territorium og komplekse morfologi til tross for deres tette anatomiske arrangement. Presentert her er en omfattende eksperimentell arbeidsflyt, inkludert detaljene i elektroporasjonsprosedyren, flerkanals bilde stabler oppkjøp av konfokal mikroskopi, og dataassistert tredimensjonal segmentering som gjør det mulig for eksperimentereren å vurdere individuell PrA-volum og morfologi. Oppsummert gir elektroporering av MAGIC en praktisk metode for å individuelt merke mange astrocytter og få tilgang til deres anatomiske egenskaper på ulike utviklingsstadier. Denne teknikken vil være nyttig for å analysere kortikale astrocytt morfologiske egenskaper i ulike musemodeller uten å ty til komplekse kors med transgene reporterlinjer.
Introduction
Astrocytter spiller mange vitale funksjoner i hjernens utvikling og fysiologi1. Ved siden av sin rolle ved blod-hjernebarrieren hvor de regulerer næringsopptak og blodstrøm, bidrar de aktivt til synapsedannelse og funksjon mens de produserer nevromodulatorer som kan endre nevronal aktivitetog atferd 2. Videre bidrar astrocyttdysfunksjon til en rekke nevrologiske lidelser3. Astrocytter som ligger i hjernebarken viser en forseggjort morfologi som muliggjør omfattende kontakt med nevronale prosesser. Disse kontaktene, avgjørende for kretsfunksjon, kontrollerer også astrocyttmorfogenese og synaptogenesis gjennom celle-vedheftproteiner4. Nevrologer trenger praktiske og robuste verktøy for å undersøke astrocyttutvikling og morfogenese i sine nevrologiske modeller av interesse. Men på grunn av den nære tilponeringen av astrocytter til sine naboer og deres ensartede tredimensjonale flislegging, er det utfordrende å utpeke kortikale astrocytter og grundig vurdere deres morfologi ved hjelp av immunmarkører.
For tiden, to viktigste genteknologi strategier muliggjør merking og individualisering av kortikale astrocytter in situ: sparsom reporter aktivering i transgene muselinjer eller somatisk transgenese ved hjelp av elektroporasjon av reporter plasmids. Den første strategien er avhengig av å avle en floxed reporter muselinje med mus som uttrykker en induserbar form for Cre recombinase aktivert spesielt i astrocytter ved tamoxifen levering (f.eks Aldh1l1-CreERT25). Flere ulemper er knyttet til denne strategien. For det første krever avl av transgene mus et stort antall dyr, og flere analyser er vanligvis nødvendig for å bestemme riktig dose tamoxifen for å gi tilstrekkelig sparsom merking av kortikale astrocytter. Analysere kortikale astrocytter fenotyper i en genetisk musemodell av interesse vil kreve enda mer avl og mus forbruk. Videre, in utero tamoxifen injeksjon er kjent for å forstyrre delurition, noe som gjør denne strategien vanskelig å gjelde for studien av de tidligste stadiene av astrocytt utvikling. In vivo DNA elektroporasjon er en alternativ tamoxifen-fri strategi som er avhengig av et minimum antall dyr6. Utført enten på embryonale eller postnatale stadier, består denne tilnærmingen av å injisere reporterplasmider i laterale ventrikler av gnagere etterfulgt av elektriske pulser som skaper porer i cellemembranen, og dermed tillater DNA å gå inn i stamceller som fôrer ventrikkelen. Deretter behandles reportertransgenes som bæres av de elektroporatede plasmidene av det målrettede cellemaskineriet og uttrykkes7. To elektroporasjonsmetoder har tidligere blitt beskrevet for å merke muskortikale astrocytter: 1) Postnatal Astrocyte Merking av Electroporation (PALE), som er avhengig av elektroporasjon av 1-2 enfarget episomal reporter plasmider i tidlige postnatale stadier4; 2) StarTrack strategi basert på in utero elektroporasjon (IUE) av flere single-color integrative reporter plasmids8,9,10. Selv om disse to teknikkene effektivt merker PrA i hjernebarken, presenterer de også noen begrensninger. I sin første versjon, begge metodene stole på en glial fibrillary surt protein (GFAP) promotor å drive uttrykk i astrocytter, som kan skjevhet merking mot radial glia samt pial og reaktive astrocytter som uttrykker GFAP sterkere enn normalt hvile PrA11,12. Når det gjelder PALE, andre ulemper er den sene fasen av elektroporasjon, som forhindrer merking av tidlig født PrA (eller de som stammer fra tidlig delaminerende stamfarier) og analyse av tidlige stadier av astroglia utvikling, og bruk av episomale vektorer som blir fortynnet gjennom påfølgende divisjoner under den massive spredningen som PrA gjennomgår i løpet av den første postnataluke 13,14. I motsetning til PALE er StarTrack basert på embryonal elektroporasjon av integrative reporterplasmider som tillater sporing av bidraget fra både embryonale og postnatale stamfarer til PrA. En oppdatert StarTrack-ordning som er avhengig av ubiquitin C-promoteren (UbC-StarTrack) oppnår bredere uttrykk for fluorescerende journalister i både nevronal og glial nedstigning (astrocytter inkludert) av nevrale stamfar15,16,17. Men i sin nåværende versjon er implementeringen av denne tilnærmingen kompleks, da den er avhengig av en equimolar blanding av 12 forskjellige plasmider som uttrykker seks fluorescerende proteiner (FP) med delvis eksitasjon og utslippspektra overlapping.
Presentert her er en enkel i utero elektroporasjon-basert flerfarget merking metode ved hjelp av integrerende reporter konstruksjoner drevet av en sterk og bredt aktiv promotor for å utpeke kortikale astrocytter14. I tillegg er en enkel bildeanalyserørledning ved hjelp av både lisensiert (f.eks. Imaris) og åpen tilgang (Vaa3D18,19,20) bildeanalyseprogramvare gitt til segmentastrocytt territorial volum og arborisering, henholdsvis. Sammenlignet med tidligere beskrevne metoder, Denne strategien er utelukkende avhengig av 1–2 flerfargede integrerende transgener Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC eller MM21) rettet mot cytoplasmatisk og (eventuelt) kjernefysisk cellerom hvis uttrykk drives av en syntetisk CAG-promoter bestående av en cytomegalovirusforsterker, kylling β-actin arrangør og kanin β-globin skjøte akseptor nettstedet22. Dette gjør det mulig å merke og spore kortikale astrocytter, fra embryonale til sene postnatale stadier, uavhengig av GFAP-uttrykk14,23. Hver av disse transgenene bærer følgende fire forskjellige FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP og tdTomato/mCherry, som viser minimal spektral overlapping som lett kan omgås med 1) Sekvensiell kanaloppkjøp; 2) Optimalisert excitation makt og samling gevinst; og 3) Spesifikke dichroic filtre for å samle smale FP utslipp vinduer. MM-strategien bruker Cre/lox-rekombinasjon med en selvutsigelig Cre-rekombinering (seCre) til å drive stokastisk uttrykk for FP i en cellulær befolkning. En enkelt kopi av MM transgene uttrykker FP på en gjensidig eksklusiv måte, mens flere transgener gir opphav til FP-kombinasjoner, noe som skaper dusinvis av forskjellige fargetoner. Genomisk integrasjon av transgenene drives av piggyBac (PB) eller Tol2 transposisjonssystem24,25,26. Derfor, gjennom in utero elektroporasjon, MM verktøykasse og flerfarget 'mosaikk' som den genererer muliggjør samtidig merking av flere tilstøtende kortikale stamfarer og sporing av deres glial nedstigning, inkludert kortikale astrocytter, over lange perioder. Fargekontraster som følge av uttrykk for distinkt FP tillater avgrensning av konturen av PrA og deretter trekke ut viktig informasjon om deres territoriale volum (ved hjelp av IMARIS) og kompleks morfologi (ved hjelp av Vaa3D). Flerfarget strategi presentert i detalj her er en praktisk og robust metode som gir rask og enkel tilgang til kortikale astrocytt overflate og morfologi i vill type mus på ulike utviklingsstadier, og er lett tilpasningsdyktig til å undersøke astrocytt anatomiske funksjoner i musemodeller av nevrologiske sykdommer uten å bruke transgene reporter linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer som er beskrevet her ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer. Dyreprotokoller er godkjent av Charles Darwin dyreksperimentering etisk styre (CEEACD/N°5).
1. Fremstilling av endotoksinfrie plasmider for MAGIC Markører i utero elektroporasjon
- Bakteriell transformasjon
- På is, tine DH5 alfa kompetente celler lagret ved -70 °C.
- Varm opp agarplatene som inneholder riktig antibiotika (100 μg/ml ampicillin eller 50 μg/ml kanamycin) ved 37 °C.
- Tilsett 1 μL av 5–50 ng magic markører plasmid DNA i 10 μL av tinte DH5 alfa kompetente celler og inkubere på is i 10 min uten blanding.
- For varmesjokktransformasjonen, plasser aliquot i et 42 ° C vannbad i 45 s, legg deretter umiddelbart på is og vent 3-5 min.
- Under sterile forhold tilsetter du 230 μL SOC-medium og inkuber i 1 time ved 37 °C.
- Spre innholdet i aliquot over agar plate og inkuber over natten ved 37 °C.
- Plasmid kultur
- Neste morgen, under sterile forhold, plukke opp en koloni fra agar plate og sette den i en 14 ml rør som inneholder 2 ml LB medium med passende antibiotika. La det inkubere for dagen ved 37 ° C i en risting inkubator ved 300 rpm.
- På slutten av dagen, frø 300 ml LB med antibiotika ved hjelp av 2 ml startkultur fra trinn 1.2.1 og inkubere over natten ved 37 ° C i en risting inkubator ved 300 rpm.
- Plasmid DNA forberedelse
- Neste morgen fortsette med rensing av MAGIC plasmid DNA (det vil si PB-CAG-Cytbow og Tol2-CAG-Nucbow samt CAG-drevne plasmids uttrykker PB og Tol2 transposaser og Cre recombinase) ved hjelp av en endotoksin-fri maxiprep kit etter produsentens protokoll.
- Elute DNA i 200 μL sterilt vann og estimer konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer før lagring ved -20 °C.
2. Forberedelse til MAGIC Markører i utero elektroporasjon (MM IUE)
- Forberedelse av oppløsning
- Varm 30 ml 0,9% saltvannsløsning ved 37 °C i et vannbad og hold den varm under hele operasjonen.
- Forbered en plasmidblanding som inneholder PB-CAG-Cytbow og Tol2-CAG-Nucbow (endelig konsentrasjon, 0,8 μg/μL hver), PB- og Tol2 transposaser (endelig konsentrasjon, 0,4 μg/μL hver), CAG-seCre (endelig konsentrasjon, 0,16 μg/μL) og 0,01 % fast grønn fargestoff i PBS uten Ca2+ og Mg2+.
MERK: For astrocyttana anatomiske rekonstruksjonsformål kan Tol2-CAG-Nucbow-konstruksjonen utelates. Imidlertid er denne plasmid nyttig å skille doublets av nært sammenstilt astrocytter og når du bruker MAGIC Markører for å sondere klonnale relasjoner blant astrocytter14. - Klargjør bedøvelsesoppløsning som inneholder 100 μL ketamin (100 mg/ml) og 100 μL xylazin (20 mg/ml) fortynnet i 2 ml saltoppløsning.
- Klargjør smertestillende oppløsning ved å fortynne 0,3 mg/ml buprenorfin lageroppløsning 1:10 i saltoppløsning.
- Utarbeidelse av operasjonsmaterialet
- Steriliser de kirurgiske verktøyene (se Materialtabell)ved høy temperatur i en glassperlesterilisator eller tilsvarende.
- Legg en dråpe elektrodegel i en 35 mm tallerken.
- Sett mikropipetten i mikroinjektorholderen, bryt tuppen av mikropipetten og aspirer DNA-løsningen.
- Plasser en 1 μL dråpe fast grønn oppløsning (0,01 %) i lokket på en 3 cm tallerken og, ved hjelp av den som referanse, juster diameteren på mikropipettens spiss ved å bryte spissen med fine tang. Juster trykkparameteren slik at tilsvarende størrelsesfall produseres av mikroinjektoren, og dermed muliggjør levering av ca. 1 μL DNA-oppløsning per injeksjon.
- Fremstilling av den gravide kvinnelige musen
- Vei rjorl: swiss gravid mus.
- Utfør en intraperitoneal injeksjon med 12,5 μL per gram kroppsvekt (BW) anestesioppløsning. Vent i 5 min og kontroller at musen sover ved å klemme tåen.
- Når dyret ikke reagerer på å klemme, injiser det subkutant med 1,6 μL/g BW smertestillende oppløsning.
- Tilsett en dråpe okulær gel på hvert øye for å forhindre tørking under operasjonen og plasser dyremagen opp på varmeputen.
- Barber forsiktig magen, rengjør den med en pute gjennomvåt med jod, og saner det barberte området med en alkoholpute.
- Ordne et operasjonsfelt ved å plassere sterile komprimerer rundt det barberte, rengjorte og sanitiserte området.
3. In utero elektroporasjon (IUE)
- Intraventrikulær injeksjon
- Skjær et 2 cm vertikalt snitt langs midtlinjen som starter i den nedre delen av magen, gjennom huden, og deretter gjennom den underliggende muskelen. Utsett livmorhornene ved å forsiktig manipulere embryonale poser og vurdere plasseringen av livmorhalsen og antall embryonale poser på hver side av livmorhalsen.
- Orienter hjernen til E15.5-embryoet som skal elektroporeres for å se bregmaen, lett gjenkjennelig som sin plassering samsvarer med krysset mellom de tre viktigste blodkarene som går langs hjernefissurene.
- Tenk deg en virtuell linje mellom bregma (synlig gjennom skallen) og øyet; innføre mikropipetten mellom den virtuelle linjen og den langsgående sprekken, og trykk deretter på injektorens fotpedal for å levere 1 μL DNA-løsning i den laterale ventrikkelen på den målrettede halvkule.
MERK: Når den injiseres på riktig sted, vises den fylte sideartikkelen blå, noe som indikerer at den er fylt med DNA-løsningen.
- Elektroporasjon
- Påfør elektrodene (se Materialtabell), tidligere dyppet i elektrodegel, på begge sider av det injiserte embryoet med anoden som dekker den injiserte halvkule. Trykk på fotpedalen på elektroporen for å levere en serie på fire 50 ms pulser på 35 V, hver atskilt med et intervall på 950 ms.
- Fukt embryoet med oppvarmet saltvannsløsning.
MERK: Embryoene skal holdes fuktige ved hjelp av oppvarmet saltvannsløsning under hele kirurgisk drift, og livmoren skal ikke tørke ut. - Gjenta trinn 3.1.2–3.2.2 for hvert embryo.
- Når alle målrettede embryoer har blitt elektroporert, erstatte livmorhornene i magen ved å forsiktig skyve dem med tang tilbake til sin opprinnelige posisjon. Fyll bukhulen med oppvarmet saltvannsløsning for å hindre livmoren i å tørke mens suturer er laget.
- Først lukk magemuskelen med en kontinuerlig absorberbar sutur, og deretter huden med flere individuelle masker (~ 10) ved hjelp av 4-0 sutur.
- Sett dyret i et rent bur, liggende på siden på et rent papirhåndkle og snu dyret til den andre siden hver 5-10 min til det våkner opp og begynner å bevege seg på egen hånd.
- Vurder dyrets tilstand neste dag, spesielt hvis det er laget en rede.
MERK: Ingen postsurgery behandling er nødvendig. I fravær av en rede, noen tegn på smerte (f.eks, uttredelse, shaggy pels), og / eller kraftig blødning, bør dyret euthanized uten forsinkelse.
4. Vev høsting og snitting
- Innsamling av vev
- Injiser fenobarbital (100 mg/kg BW) intraperitonealt for terminalbedøvelse ved ønsket høstingstid. I dette tilfellet var høstingstidene på postnatale (P) dager P4, P7 og P21.
- Utfør intrakarardiakperfusjon ved hjelp av kald premade paraformaldehydbasert oppløsning.
- Disseker hjernen og legg den over natten ved 4 °C i den paraformaldehydbaserte løsningen for etterfiksering.
- Histologi
- Neste morgen skyll hjernen 3x i 10 min med 1x PBS.
- Bygg inn hjernen i 3% agarose oppløst i 1x PBS.
- Klipp 80 μm seksjoner ved hjelp av en vibrerende bladmikrotom.
- Samle seksjoner i en 24 brønnplate forhåndsutfylt med 1x PBS.
- Monter delene i monteringsmediet (se Materialtabell) mellom glideren og dekkglasset. Hold de monterte lysbildene ved -20 °C for optimal fluorescerende proteinbevaring og langvarig lagring.
5. Multikanals konfokal avbildning
- Innstillinger for mikroskop
- Sett opp konfigurasjonen av det konkkale mikroskopet til å opphisse mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry ved hjelp av henholdsvis 440, 515 og 559 nm laserlinjer.
- Bruk et mål på 20 x 0,8 NA (eller høyere NA) og juster XY-prøvetaking og Z-trinnsstørrelse i henhold til Nyquist-kriteriene.
MERK: Bilder ervervet med høyere oppløsning (f.eks. 60x 1.4 NA oljemål) og dekonigrasjonsalgoritmer vil muliggjøre rekonstruksjon av de finere detaljene i astrocytt arbors. Eksperimentereren bør imidlertid huske på at de fineste astrocyttprosessene kanskje ikke løses ved konvensjonell optisk avbildning.
- Bildeanskaffelse
- Finn de lyseste astrocytter i elektroporert området.
- Fordi merkede celler som ligger nær overflaten, kan virke lysere enn de som er dypere i skiven, justerer du oppkjøpsinnstillingene på overflatecellene for å unngå å mette bildene.
- Juster anskaffelsesinnstillingene separat for hver av de tre kanalene samtidig som du unngår pikselmetning ved hjelp av HiLo LUT, som viser nullverdier som blå og maksimumspikselverdier som røde.
MERK: Et tilstrekkelig balansert bilde skal bare vise noen få blå og nesten ingen røde piksler. - Skaff deg flislagte 1024 x 1024 piksler Z-stabler ved hjelp av det motoriserte stadiet av mikroskopet, med en 10% overlapping mellom tilstøtende stabler for senere å muliggjøre mosaikkrekonstruksjoner av det elektroporerte området eller interessesonen.
6. Astrocytt territorial volumsegmentering
MERK: Dette utføres ved hjelp av et kommersielt program (f.eks. IMARIS).
-
Utarbeidelse av datasettet
- Beskjær de merkede astrocytter innenfor 3D rekonstruksjon (250 x 250 piksler) ved å velge celler helt omsluttet i den avbildede vev delen.
MERK: Det er også mulig å arbeide direkte på større volumer hvis datamaskinen som brukes kan håndtere dem. - Klikk på Blå Overflate-knappen på objektverktøylinjen i Overgått-visningen for å opprette en ny Surface for hver astrocytt.
- For å få bedre visualiseringskontrast, juster først de minimale og maksimale fargekontrastverdiene ved å klikke på Rediger | Vis alternativet for skjermjustering og dra begge håndtakene. Endre om nødvendig kanalfargen ved å klikke direkte på kanalnavnet i vinduet Skjermjustering for å velge en ny farge.
MERK: Arbeid fortrinnsvis alltid med samme fargeskjerm for å forhindre visuell skjevhet. - Klikk på Rediger | Bildeegenskaper for å angi voxelstørrelsen manuelt i mikrometer. Hvis voxelstørrelsen ikke er nøyaktig, vil volumberegningene være feil.
- Lagre de nye innstillingene.
- Beskjær de merkede astrocytter innenfor 3D rekonstruksjon (250 x 250 piksler) ved å velge celler helt omsluttet i den avbildede vev delen.
-
Overflatesegmentering
- Bruk det blå ikonet til å introdusere en overflate. Et Surface-ikon og -boks vises i Scene-listen. En Volum-boks gjør det mulig å se/skjule datasettet.
- Velg overflatelinjen og klikk på Hopp over automatisk | Rediger manuelt.
- Klikk på Contour | Synlighet, og klikk Ingen. Deretter flytter du til Velg-visningen og klikker på Tegne-knappen.
- Klikk på Modus for å velge tegningsmodus.
- Bruk det raske og effektive Isoline halvautomatisert tegneverktøyet. Definer celleomrisset ved å flytte musepekeren over den. Hvis isoline forhåndsvisningen ikke samsvarer med astrocytt disposisjon, justere musepekeren posisjon. For å validere forhåndsvisningen, venstreklikk på det merkede området. Hvis du vil rette opp potensielle feil, bruker du tavlevinduet til å slette gjeldende Z-plankontur eller trykke Ctrl + Z.
- Bruke Slice | Posisjon til å navigere gjennom Z-flyene, flytt til neste plan ved å endre Z-plannummeret og starte en ny kontur. Fortrinnsvis starte fra midten av cellen og deretter flytte til ekstremiteter.
- Når konturer er tegnet i alle Z-planene som inneholder astrocytten, klikker du på Opprett overflate. Før du oppretter en overflate, må du kontrollere at alle komponentene er koblet til. Hvis ikke, velger du de største eller kobler til relevante før du eksporterer volumdata.
- Kontroller de kvantitative dataene som vises i datapanelet, og eksportstatistikk i regnearkformat, og lagre volumverdi og enhet.
- Lagre overflaten under et nytt navn for å få tilgang til den senere.
7. Sporing astrocytt arborization
MERK: Dette gjøres ved hjelp av open access-programmet Vaa3D.
- Utarbeidelse av datasettet
- Last inn bildestakken, og søk etter isolerte astrocytter eller astrocytter i nærheten som viser forskjellige farger.
MERK: Oppløsningen av rekonstruksjonen kan forbedres ved å øke objektiv NA og prøvetaking. Til syvende og sist, men på grunn av oppløsningsgrensen for konfokal mikroskopi, kan de fineste astrocyttprosessene ikke spores nøyaktig. Forsiktighet bør tas for å unngå oversegmentering utover oppløsningen av de oppkjøpte bildene. - Bruk Fiji til å beskjære 250 x 250 pikslers bildestakker rundt hver astrocytt.
- Siden Vaa3D-sporing utføres på bare én farge, velger du én kanal og deaktiverer de andre kanalene.
- Konverter bildet til RGB og lagre det i .tiff format.
- Last inn bildestakken, og søk etter isolerte astrocytter eller astrocytter i nærheten som viser forskjellige farger.
- Arbor sporing
- Åpne RGB-bildet i Vaa3D. Gå til Bilde | Data | Geometri deretter bilde resampling, og justere X / Y og Z voxel størrelse verdier.
MERK: Mens du rekonstruerer astrocytt arbors, bør det tas hensyn til ikke å spore detaljer finere enn oppløsningen gitt av bildene. - Åpne et 3D-vindu ved å klikke visualiser | 3D-visningsprogram for hele bildet. Høyreklikk på et 3D-bilde og velg 1-høyreklikk for å definere markøren. Pek med markøren midt på astrocytten, og høyreklikk deretter for å angi en markør.
MERK: Klikk på Escape for å få tilgang til 3D-visningen igjen. - Gå til Avansert | 3D-sporing | Vaa3D-Neuron2-auto-sporing.
- I det nyåpnede vinduet velger du kanalen du vil bruke plugin-modulen på.
- Velg en bakgrunnsterskel (ofte mellom 30 og 90). Tilpass denne verdien for hver astrocytt om nødvendig.
- Fjern merket for Radius fra 2D, og hold auto-down-prøven og automatisk resample kontrollert.
- Sett cnn_type på 3, length_thresh på 1, og SR_ratio på 0,1.
- Når du har klikket ok, må du kontrollere at plugin-modulen automatisk genererer to filer basert på det opprinnelige navnet. Suffikset –ini.swc og -coordinateX–coordinateY-coordinateZ-app2.swc vil bli lagt til. Legg manuelt til en særegen etikett i disse navnefilene for ikke å overskrive dem mens du fortsetter å kjøre plugin-modulen.
- Åpne Object Manager, gå til Neuron | Linjestruktur, velg den sporede astrocytten, klikk på Visningsmodusog velg Alltid linjemodus.
- Gå tilbake til 3D-vinduet, hvor et skjelett av astrocytten vises.
MERK: Hvis segmentering og signal ikke samsvarer, gjentar du trinn 7.2.3–7.2.10 og justerer terskelen til de gjør det. Pass på at du angir de andre parameterne på nytt etter hvert som plugin-modulen startes på nytt. - Høyreklikk på skjelettet og velg førstevalg neuron | linje # 1 ... APP2_Tracing for å få tilgang til kvantitative målinger som vises på et nytt vindu Surface| Objektmerknad.
MERK: På grunn av den begrensede oppløsningen av lett mikroskopi, målinger som vises under de oppførte elementene Antall grener og Antall bifurcations gir bare et grovt estimat av astrocytt arbor kompleksitet.
- Åpne RGB-bildet i Vaa3D. Gå til Bilde | Data | Geometri deretter bilde resampling, og justere X / Y og Z voxel størrelse verdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroporasjon av MAGIC Markører i embryonale kortikale stamfarer gjør det mulig å merke astrocytter fra tidlige til sene stadier av hjernebarkutvikling (figur 1). Disse astrocytter ble funnet i alle kortikale lag på ulike postnatale stadier (P4, P7, P21) som de spredte seg mye inn i hele hjernebarken. De ble vurdert med skrånende konfokale bilder ervervet med en 20x 0,8 NA (eller høyere NA) mål og montert som Z-stack rekonstruksjoner (Figur 2). MAGIC Markører kombinatorisk merking aktivert individualisering av kortikale astrocytter og utvinning av informasjon om deres volum og morfologi. Ved hjelp av den kommersielle bildeanalyseprogramvaren ble konturen av individuelle astrocytter avgrenset på hver enkelt optiske del av konokkale bildestabler for å segmentere og rekonstruere det territoriale domenet okkupert av hver astrocytt (figur 3). Fra de samme Z-bildestablene ble den forgrenede morfologien til utrektkortikale astrocytter segmentert ved hjelp av åpen tilgangsprogramvare som tillater ekstraksjon av skjelettet av de viktigste astrocyttprosessene (figur 4). Disse segmenterings- og sporingsverktøyene ga en halvkvantitativ vurdering av økningen av territorialvolum (figur 3) og morfologisk kompleksitet (figur 4) som skjedde for individuelle kortikale astrocytter fra tidlig til sent postnatal stadier14. Disse tilnærmingene avslørte også heterogeniteten av volum og morfologi som vises ved distinkte kortikale astrocytter på samme utviklingsstadium, som illustrert i figur 2, figur 3og figur 4.
Figur 1: Skjematisk representasjon av MAGIC Markører (MM) i utero elektroporasjon (IUE) for å merke kortikale stamfarer og deres nedstigning under hjerneutvikling. (A)MM verktøysettet består av flere plasmider koding PB-Cytbow, Tol2-Nucbow,PB og Tol2 transposaser, og selvutslettelig Cre recombinase (seCre). I MM-konstruksjoner flankerer tre forskjellige FP-kodesekvenser (EBFP2, mTurquoise2/mCerulean, EYFP, tdTomato/mCherry) og skaper gjensidig eksklusive muligheter for eksisjon ved Cre-rekombinasjon. Før Cre-handlingen uttrykkes bare det første genet (EBFP2). Etter cre-mediert eksisjon indusert av seCre, uttrykkes enten tdTomato/mCherry (rød FP), EYFP (grønn FP) eller mTurquoise2/mCerulean (cyan FP). Co-uttrykk for FP fra flere MAGIC Markører kopier gir fargekombinasjoner i cytoplasma (PB-CAG-Cytbow) eller kjerne (Tol2-CAG-Nucbow) av merkede celler. PB og Tol2 transposition endfeet innramming MM kassetter tillate deres integrering i genomet av kortikale stamfar når MM konstruksjoner er coelectroporated sammen med PB og Tol2 transposaser koding plasmider. (B–G) Grafisk illustrasjon av IUE påfølgende trinn, inkludert laparotomi av bedøvet gravide mus (B), injeksjon av MM plasmid mix (C) i de laterale ventriklene til embryoene (D), levering av elektriske pulser gjennom nøye plasserte pinsetttroder (E) for å målrette kortikale stamfar i en av de to hjernehalvdelene (F), og suturering av gravid musmagen (G). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Etter in utero elektroporasjon av MAGIC verktøykasse, ble flerfargede astrocytter funnet spredt i hele hjernebarken på postnatale stadier. IUE av plasmider som kjører MM, seCre, PB og Tol2 transposases uttrykk i E15.5 mus kortikale stamfar resulterte i merking av lag 2-3 nevroner og astrocytter på P4, P7, og P21. Uttrykksnivå og fargepalett var avhengig av antall MM-transgener integrert i genomet til kortikale stamfarer. Montasje av maksimal intensitet projeksjoner fra flislagte confocal bilde stabler kjøpt på 80 μm sagittal hjerneseksjoner. Skala bar: 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Segmentering av kortikale astrocytt territoriale domene på forskjellige utviklingsstadier. Maksimal intensitet projeksjoner av beskåret confocal Z-stack innramming individuelle astrocytter (A-F) og deres tilknyttede territoriale domene segmentert med den kommersielle programvaren (A'-F') på tre forskjellige utviklingsstadier: P4 (A-B, A'-B'), P7 (C-D, C'-D') og P21 (E-F, E'-F '), henholdsvis. Skala bar: 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sporing av kortikale astrocytt arborization. Eksempler på to distinkte astrocytter beskåret fra confocal Z-stabler (A-D) og rekonstruksjon av deres arborisering grovt segmentert med Vaa3D (A'-D') samlet på to forskjellige utviklingsstadier: P7 (A-B, A'-B') og P21 (C-D, C'-D'), henholdsvis. Skala bar: 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In utero electroporation (IUE) av MAGIC Markører i kortikale stamfar (figur 1) aktivert merking av astrocytter gjennom postnatal hjernebark på ulike postnatale stadier (P4-P7-P21, Figur 2). Interessant, scenen av IUE er ikke kritisk, som elektroporasjon utført fra E13.5 til E15.5 gir lignende merking mønstre om kortikale astrocytter14. Plasseringen av merkede pyramidale nevroner i kortikal parenchyma varierer imidlertid med elektroporasjonsstadiet. Faktisk, IUE utført på E15 markerer lag 2-3 nevroner mens IUE utført på E13 etiketter pyramidale nevroner i alle kortikale lag, fra lag 5 til lag 2-36,27. Denne felles merkingen av kortikale pyramidale nevroner etter MM IUE er hovedbegrensningen av denne metoden, da det forhindrer halvautomatisert segmentering av astrocyttmorfologi i lag der tett nevronal merking forstyrrer astrocyttprosesser anerkjennelse. Skulle det være et problem, kan MM bli elektroporert på postnatale stadier som i PALE. På P4 kan merking av radiale gliafibre som fortsatt er tilstede på dette stadiet, også forstyrre Vaa3D arborsegmentering. Mens tungvint, en løsning hvis man ønsker å fortsette med astrocytt arbor rekonstruksjon på dette stadiet er å manuelt fjerne radial glial fibre ved gradvis å erstatte radial fiber signal med svarte piksler rundt astrocytten av interesse ved hjelp av Adobe Photoshop.
Til tross for denne begrensningen er MM IUE en kraftig teknikk når den utføres tilstrekkelig. Noen kritiske skritt må håndteres med forsiktighet: 1) embryoer må holdes fuktig under hele operasjonsprosedyren og nøye manipulert for å øke overlevelsen; 2) ved hjelp av glasskapillærer med stor diameter eller klemme embryonale poser for tett kan føre til posebrudd og derfor embryoer død; 3) under DNA-injeksjon, må blodkar unngås for å hindre blødning; 4) hele prosedyren bør ikke vare mer enn 40 minutter fra anestesi til sutur for å maksimere embryo overlevelse; 5) stress spiller en kritisk rolle i IUE suksess og derfor ekstra kilder til stress som endring av bur, transport, lyder og vibrasjon må unngås fra 5 dager før kirurgi til 7 dager etter fødselen for å hindre abort og kannibalisme.
Merk at eksperimenterere som ønsker å spesifikt målrette celler født på et gitt stadium, kan bruke MM-verktøykassen uten å legge til piggyBac- og Tol2-transposaser slik at bare cellene som er født på tidspunktet for elektroporasjonen, uttrykker kombinatoriske etiketter. En annen fordel med metoden er fleksibiliteten som den gir når det gjelder tettheten av merkede celler og deres plassering i ulike hjerneregioner. Faktisk kan tyngre merking av kortikale astrocytter oppnås ved å øke den totale konsentrasjonen av MM transgener samtidig som plasmidsforholdet er konstant (1:10-forhold for Cre rekombinase / MM konstruksjoner og 1:2-forhold for transposaser / MM konstruksjoner). I motsetning til monokrome tilnærminger, for eksempel elektroporering av enfargetransposoner eller Cre-elektroporasjon i Ai9-mus, hvor evnen til å utpeke individuelle astrocytter krever sparsom merking, gjør fargekontraster som tilbys av MAGIC Markers-strategien individuellisering av astrocytter over et bredt spekter av merkingstettheter. I tillegg tillater posisjonering av elektrodeproben i distinkte retninger rettet mot distinkte hjerneregioner som den potensielle striatum (anoden i ventral stilling, motsatt av den dorsale posisjonen som kreves for å oppnå elektroporasjon i hjernebarken), eller hippocampus (anode i medial stilling)28. Til slutt kan IUE utføres i forskjellige musstammer som utavlet (OF1, Swiss) og innavlede (C57BL/6J eller N) mus, som åpner veien for bruk av MM verktøykasse i transgene dyresykdomsmodeller. For å oppnå IUE i innavlede mus bør man imidlertid tilpasse antall pulser (tre pulser for C57BL/6 mus versus fem pulser i sveitsisk), spenning (30 V i stedet for 35 V) og smertestillende dose (0,15 mg/ml buprenorfinlagerløsning og et injisert volum på 0,8 μL/g BW).
Sammenlignet med transgen dyreavl eller PALE- og StarTrack-tilnærmingene, gir denne metoden flere fordeler. Til å begynne med, i motsetning til avlsstrategien, bruker den få dyr. Det tillater også merking av kortikale astrocytter siden de tidligste stadiene av utviklingen, inkludert embryonale stadier, i motsetning til PALE4, som er avhengig av postnatal elektroporasjon. Videre, i forhold til de tolv reporterkonstruksjonene som brukes i StarTrack-tilnærmingen8,er denne strategien avhengig av bare to flerfargede transgener, og gjør dermed DNA-blandingsforberedelse og bildebehandling enklere. Videre er balansen mellom de forskjellige fargene stochastically uttrykt av MM iboende bestemt av strukturen av transgenene og er ikke avhengig av blanding av forskjellige komponenter av eksperimentereren. I tillegg kan denne strategien strekke seg utover enkel anatomisk vurdering og kan med hell brukes til multiklonal analyse av astrocyttutvikling, som vist i tidligere publisert arbeid14. Dette arbeidet, ved hjelp av sjeldne fargekombinasjoner av cytoplasmatiske og kjernefysiske markører for å definere kortikale astrocyttkloner, viste at de viser omfattende variasjon når det gjelder romlig distribusjon, strukturell organisering, antall og undertype av genererte celler.
Kortikale astrocytter født fra MM-merkede kortikale stamfarer viste betydelig fargekontrast og spredte seg mye over hele hjernebarken (figur 2). Enkle flerkanals Z-stack oppkjøp ved hjelp av konfokal mikroskopi ble brukt til å få tilgang til viktige astrocytt funksjoner som deres territoriale volum (Figur 3) og deres morfologiske kompleksitet (Figur 4) på flere postnatale stadier. Utover astrocytter kan denne metodikken tilpasses for å studere morfologien til andre glialceller som oligodendrocytes. Det bør imidlertid huskes at den begrensede oppløsningen som tilbys av konfokal mikroskopi bare kan gi en delvis gjengivelse av astrocytt morfologisk kompleksitet. Mens bilder innhentet med høyere oppløsning (f.eks. 63x 1.4 NA oljemål) og dekonigrasjon algoritmer kan brukes til å rekonstruere finere detaljer om astrocytt arbors14,de fineste prosessene kan ikke løses med konvensjonell optisk bildebehandling. Likevel vil strategien som presenteres her være av interesse for å screene effektivt for en potensiell fenotype som påvirker kortikal astrocyttvolum eller morfologi i musemodeller av nevrologiske sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker S. Fouquet og bilde- og dyrekjernefasilitetene til Institut de la Vision og Institut des Neurosciences de Montpellier (MR og RAM) for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av stipender fra Région Ile-de-France og Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer to S.C, og fra Université Paris-Saclay (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) til LA, ved finansiering fra European Research Council (ERC-SG 336331, PI J. Valette) til E.H., av Agence Nationale de la Recherche under kontrakter ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (Frankrike BioImaging) , av Fondation pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), av European Research Council (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) og av ATIP-Avenir program (PI K. Loulier).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
- García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
- Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039 (2013).
- Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
- Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896 (2016).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87 (2015).
- Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
- Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342 (2014).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662 (2019).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
- Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, suppl 1 120-125 (2009).
- Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163 (2012).
