Summary
星形细胞均匀地平铺大脑皮层，使得对其复杂形态的分析在细胞水平上具有挑战性。此处提供的协议使用基于子宫电镀的多色标签，挑出皮质星形细胞，并使用用户友好的图像分析管道分析其体积和形态。
Abstract
位于小鼠大脑皮层的原质天体细胞（PrA）紧密并列，在成人阶段形成明显连续的三维矩阵。到目前为止，没有任何免疫控制策略可以挑出它们，并在成熟动物和皮质遗传过程中分割它们的形态。皮质PrA起源于位于鼻腔姑息的祖先，在综合载体的子宫电渗透中很容易被瞄准。这里提出了一个协议，为这些细胞贴上多地址基因组整合颜色（MAGIC）标记策略的标签，该策略依赖于小猪/Tol2的转换和Cre/lox 重组，以固态地表达特定的亚细胞隔间的不同荧光蛋白（蓝色、青色、黄色和红色）。这种多色命运映射策略能够在胶质发生之前用颜色标记的组合在附近的皮质祖先进行原位标记，并在单个细胞水平上跟踪其后代，包括星形细胞，从胚胎阶段到成人阶段。通过调整多地址基因组集成颜色标记（MAGIC 标记或 MM）提供的电冲积载体的浓度和颜色对比度实现的半稀疏标记，能够个性化星形细胞，并挑出其区域和复杂的形态，尽管它们具有密集的解剖排列。这里介绍的是一个全面的实验工作流程，包括电化过程的细节，多通道图像堆栈通过胸腔显微镜采集，以及计算机辅助的三维分割，使实验者能够评估单个PrA体积和形态。总之，MAGIC 标记器的电冲控提供了一种方便的方法，可以单独标记许多星形细胞，并在不同的发育阶段访问其解剖特征。这项技术将可用于分析各种小鼠模型中的皮质星形体形态特性，而无需使用具有转基因记者线的复杂十字架。
Introduction
天体细胞在大脑发育和生理学中起着许多重要作用。除了在调节营养吸收和血液流动的血脑屏障中发挥作用外，他们还积极促进突触的形成和功能，同时产生神经调节器，可以改变神经元活动和行为2。此外，天体细胞功能障碍导致各种神经系统疾病3.位于大脑皮层的星形细胞显示一个精心设计的形态，能够广泛接触神经元过程。这些接触，对电路功能至关重要，也通过细胞粘附蛋白4控制星形细胞形态生成和突触发生。神经科学家需要方便和可靠的工具来研究天体细胞发育和形态生成在他们的神经模型的兴趣。然而，由于星形细胞与邻居的紧密对接和均匀的三维平铺，因此，挑出皮质星形细胞并使用免疫标志物全面评估其形态是具有挑战性的。
目前，两种主要的基因工程策略使皮质天体在原位进行标记和个性化：利用记者质粒的电聚化，在转基因小鼠系或体细胞变代中稀疏的记者激活。第一个策略依赖于繁殖一个飞毛腿记者小鼠线与小鼠表示一种诱导形式的Cre重组酶激活专门在天体细胞后塔莫西芬交付（如Aldh1l1-CreERT25）。此策略存在几个缺点。首先，繁殖转基因小鼠需要大量的动物，通常需要多次检测来确定适当剂量的塔莫西芬，以提供皮质星形细胞的足够稀疏标签。分析感兴趣的遗传小鼠模型中的皮质星体表型将需要更多的繁殖和小鼠消费。此外，在子宫塔莫西芬注射已知干扰分体，使这一策略难以应用于研究天体细胞发育的最初阶段。体内DNA电聚是一种替代的无塔莫西芬策略，它依赖于最少数量的动物6。这种方法在胚胎阶段或产后阶段进行，包括在啮齿动物的横向心室中注射报告质粒，然后用电脉冲在细胞膜中产生毛孔，从而允许DNA进入心室内的祖细胞。随后，记者携带的电聚合质粒的转基因由目标细胞机械处理，并表达7。此前曾描述过两种电冲洗方法，为小鼠皮质星形细胞贴上标签：1）产后星形细胞标签（PALE），它依赖于产后早期4-2个单色偶发性报告质粒的电冲洗：2）星轨策略基于在子宫电镀（IUE）的多色综合记者质粒8，9，10。虽然这两种技术在大脑皮层中有效地标记了PrA，但它们也存在一些局限性。在其初始版本中，这两种方法都依赖于胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 促进剂来驱动星形细胞中的表达，这可能将标签偏向径向胶质细胞，以及表达 GFAP 比正常休息 PrA11、12更强烈的皮亚和活性星形细胞。关于PALE，其他缺点是电冲洗的后期阶段，它防止标记早产的PrA（或那些源于早期脱脂的祖先）和分析天体发育的早期阶段，以及使用偶发性病媒，在PrA在第13、14周经历的大规模增殖期间通过连续的分裂被稀释。与 PALE 不同的是，StarTrack 基于集成记者质粒的胚胎电聚，允许跟踪胚胎和产后祖先对 PrA 的贡献。依靠泛素C促进剂（UbC-StarTrack）的更新星轨方案实现了荧光记者在神经祖祖15、16、17的神经元和胶质下降（包括星形细胞）的更广泛表达。然而，在其当前版本中，这种方法的实施是复杂的，因为它依赖于12种不同质粒的等效混合物，表达6种荧光蛋白（FP），部分激发和发射光谱重叠。
这里介绍的是一个直接的子宫电镀基多色标签方法使用综合记者结构驱动的强大和广泛活跃的促进者挑出皮质星形细胞14。此外，还分别提供了使用许可（如 Imaris）和开放访问（Vaa3D18、19、20）图像分析软件的简单图像分析管道，用于分割天体细胞的面积体积和树干。与之前描述的方法相比，此策略仅依赖于 1-2 个多色集成转基因多易处理基因组集成颜色标记（MAGIC 标记或 MM21），这些标记指向细胞质和（可选）核细胞隔间，其表达由由环状体增强剂组成的合成CAG促进器驱动， 鸡β蛋白推广器，兔β-红蛋白拼接接受网站22。这使得皮质星形细胞的标签和跟踪，从胚胎阶段到产后后期阶段，独立于GFAP表达14，23。这些转基因中的每一种都具有以下四种不同的FP：eBFP、绿松石2/mCerulean、EYFP和tdTomato/mCherry，它们显示最小的光谱重叠，可以很容易地绕过1）顺序通道采集：2） 优化激发能力和收集增益：和3）特定的二氯气过滤器，以收集狭窄的FP排放窗口。MM 策略使用Cre/lox重组与自切除的 Cre 重组 （seCre） 来驱动蜂窝群中 FP 的随机表达。MM转基因的单个副本以相互排斥的方式表达FP，而多个转基因则产生FP组合，产生几十种不同的色调。转基因的基因组整合是由小猪巴克（PB）或托尔2转位系统24，25，26驱动的。因此，通过子宫电冲，MM工具包和多色"马赛克"，它产生启用多个相邻的皮质祖先的同步标记和跟踪其胶质下降，包括皮质星形细胞，在很长一段时间内。颜色对比产生于对 PrA 轮廓的明显 FP 允许线的表达，随后提取有关其领土体积（使用 IMARIS）和复杂形态（使用 Vaa3D）的关键信息。这里详细介绍的多色策略是一种方便而可靠的方法，可在各种发育阶段快速、便捷地访问野生型小鼠的皮质星形细胞表面和形态，并且无需使用转基因记者线即可轻松适应研究神经系统疾病小鼠模型中的天体细胞解剖特征。
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Protocol
此处描述的所有动物程序都是按照机构准则进行的。动物协议已得到查尔斯·达尔文动物实验伦理委员会（CEEACD/N+5）的批准。
1. 子宫电镀中魔法标记物的无毒素质粒制备
- 细菌转化
- 在冰上，解冻DH5阿尔法能力细胞存储在-70°C。
- 在 37 °C 下加热含有适当抗生素（100μg/mL 氨基林或 50μg/mL 卡纳霉素）的琼脂板。
- 在解冻的DH5α能力细胞中加入1 μL的5-50克魔法标记质粒DNA，并在冰上孵育10分钟而不混合。
- 对于热冲击转换，将方位放在42°C的水浴中45秒，然后立即放在冰上，等待3-5分钟。
- 在无菌条件下，加入 230 μL 的 SOC 介质，并在 37 °C 下孵育 1 小时。
- 将方位引用的内容分散在琼脂板上，并在 37 °C 下孵育过夜。
- 普拉斯米德文化
- 第二天早上，在无菌条件下，从琼脂板中拾取一个菌落，用适当的抗生素将其放入含有2毫升LB介质的14毫升管中。让它在 300 rpm 的摇晃孵化器中以 37 °C 孵育一天。
- 在一天结束时，300 mL 的 LB 种子使用抗生素使用 2 mL 起动机培养从步骤 1.2.1 和孵育过夜在 37 °C 在摇动孵化器在 300 rpm.
- 普拉斯米德DNA制备
- 第二天早上，使用制造商的协议，使用无毒素 maxiprep 套件，对魔法标记质粒 DNA（即 PB-CAG-Cytbow 和 Tol2-CAG-Nucbow 以及表达 PB 和 Tol2 转体酶和 Cre 重组酶的 CAG 驱动质粒进行纯化）。
- 在200μL的无菌水中排出DNA，并在储存前使用光谱仪估计其浓度-20°C。
2. 子宫电镀中魔法标记的准备（MM IUE）
- 解决方案准备
- 在水浴中以 37 °C 加热 30 mL 的 0.9% 盐溶液，并在手术的整个过程中保持温暖。
- 准备含有PB-CAG-细胞弓和托尔 2-CAG-努博的质粒混合物（最终浓度， 0.8 微克/μL），PB 和 Tol2 转置酶（最终浓度，每个 0.4 微克/μL），CAG-seCre（最终浓度，0.16μg/μL），和 0.01% 快速绿色染料在 PBS 中无 Ca2+和 Mg2+。
注：出于天体细胞解剖重建的目的，可以省略 托尔2-CAG-努博的 构造。然而，这种质粒是有用的，以区分密切并列的星形细胞的双，当使用魔术标记，以探索天体细胞14之间的克隆关系。 - 准备麻醉液，含有100μL氯胺酮（100毫克/mL）和100μL的西拉津（20毫克/mL）稀释在2mL盐溶液中。
- 通过稀释盐水溶液中的 0.3 毫克/mL 丁丙诺啡库存溶液 1：10 来准备镇痛溶液。
- 准备手术材料
- 在高温下用玻璃珠消毒器或等价物对手术工具（见 材料表）进行消毒。
- 将一滴电极凝胶放入 35 mm 盘中。
- 将微点插入微喷射器支架中，打破微点的尖端，并渴望DNA溶液。
- 放置 1 μL 快速绿色解决方案 （0.01%）在 3 厘米盘的盖子中，并以它作为参考，通过用细钳子打破其尖端来调整微尖端的直径。调整压力参数，使微喷射器产生等量大小的滴落，从而使每次注射可输送大约 1μL 的 DNA 溶液。
- 准备怀孕的雌性小鼠
- 称重 Rjorl： 瑞斯怀孕的老鼠。
- 用麻醉剂溶液每克体重 （BW） 12.5 μL 进行腹内注射。等待 5 分钟，通过捏脚趾验证鼠标是否睡着了。
- 一旦动物没有反应捏，注射1.6 μL/g BW镇痛液皮下。
- 在每个眼睛上加入一滴眼凝胶，以防止在手术过程中干燥，并将动物腹部放在加热垫上。
- 轻轻剃光腹部，用用碘浸泡的垫子清洁，用酒精垫消毒剃光的区域。
- 通过在剃光、清洁和消毒区域周围放置无菌压缩来安排操作字段。
3. 子宫内电镀（IUE）
- 静脉注射
- 沿着中线切开一个2厘米垂直的切口，从腹部的下部开始，穿过皮肤，然后穿过底层肌肉。通过轻轻操纵胚胎袋来暴露子宫角，并评估子宫颈的位置和子宫颈两侧的胚胎袋数量。
- 将E15.5胚胎的大脑定向到电压中，以观察其位置，很容易识别为与沿着脑裂口运行的三个主要血管的交界处相匹配。
- 想象一下，在布雷格玛（通过头骨可见）和眼睛之间有一条虚拟线：引入虚拟线和纵向裂变之间的微点，然后按下喷油器的脚踏板，在目标半球的横向心室中提供 1 μL 的 DNA 溶液。
注：在适当位置注射时，填充的横向心室呈蓝色，表明它已填充 DNA 溶液。
- 穿孔
- 将电极（见 材料表）涂抹在注射胚胎的两侧，用覆盖注射半球的节点浸入电极凝胶中。按下电脉冲器的脚踏板，提供 35 V 的四个 50 毫秒脉冲系列，每个脉冲间隔为 950 毫秒。
- 用加热盐水溶液抑制胚胎。
注意：在整个手术过程中，胚胎应使用加热盐水溶液保持湿润，子宫不应干涸。 - 每个胚胎重复步骤 3.1.2-3.2.2。
- 一旦所有目标胚胎都经过电镀，用钳子轻轻将子宫角推回原位，以取代腹部的子宫角。用加热的盐水溶液填充腹腔，防止子宫在缝合时干燥。
- 首先用连续的可吸收缝合关闭腹部肌肉，然后用4-0缝合多针（~10）的皮肤。
- 将动物放在一个干净的笼子里，用干净的纸巾躺在它的一侧，每5-10分钟把动物转向另一边，直到它醒来，开始自己移动。
- 第二天评估动物的状态，特别是如果已经筑巢的话。
注：无需手术后治疗。在没有巢的情况下，任何疼痛的迹象（例如，垂垂、毛茸茸的皮毛）和/或大出血，动物应立即被安乐死。
4. 组织收获和剖腹产
- 组织收集
- 在所需的收获时间，在腹内注射酚巴比妥（100毫克/千克BW），进行末期麻醉。在这种情况下，收获时间为产后 （P） 天 P4、P7 和 P21。
- 使用冷预制的副醛基溶液进行颅内敷液。
- 解剖大脑，将其放置在4°C的准甲醛基溶液中过夜，用于修复后。
- 组织学
- 第二天早上用1x PBS冲洗大脑3次10分钟。
- 将大脑嵌入3%的阿加罗斯溶解在1x PBS中。
- 使用振动刀片微切除术切割 80μm 部分。
- 在预填充 1x PBS 的 24 个井板中收集部分。
- 在滑梯和盖片之间安装介质中的安装部分（见 材料表）。将安装的幻灯片保持在 -20 °C，以实现最佳荧光蛋白保存和长期存储。
5. 多通道心目成像
- 显微镜设置
- 设置胸镜的配置，分别使用440、515和559nm激光线激发mCerulean/m绿松石2、EYFP、tdTomato/mCherry。
- 使用 20x 0.8 NA（或更高 NA）目标，并根据奈奎斯特标准调整 XY 采样和 Z 步尺寸。
注：以更高的分辨率（例如，60x 1.4 NA 油目标）和去电算法获得的图像将支持重建星形细胞 arbors 的更精细细节。然而，实验者应该记住，最好的天体细胞过程可能不会通过传统的光学成像来解决。
- 图像采集
- 在电镀区找到最亮的星形细胞。
- 由于位于靠近表面的标记细胞可能看起来比切片中较深的细胞更亮，因此调整表面单元格上的采集设置以避免图像饱和。
- 使用 HiLo LUT 分别调整三个通道中的每个通道的收购设置，同时确保避免像素饱和，HiLo LUT 将零值显示为蓝色，最大像素值显示为红色。
注意：一个足够平衡的图像应该只显示几个蓝色和几乎没有红色像素。 - 使用显微镜的电动阶段获取瓷砖 1，024 x 1，024 像素 Z 堆栈，相邻堆栈之间有 10% 的重叠，以便随后对电镀区或感兴趣区域进行马赛克重建。
6. 星形细胞区域体积分割
注：这是使用商业软件程序（例如，IMARIS）执行的。
-
准备数据集
- 通过选择完全封闭在图像组织部分的细胞，在 3D 重建（250 x 250 像素）中裁剪标记的星形细胞。
注：如果使用的计算机能够处理它们，也可以直接在更大的容量上工作。 - 单击"超越视图"对象工具栏中的蓝色表面按钮，为每个天体细胞创建一个新的表面。
- 为了获得更好的可视化对比度，请首先通过单击 "编辑 |调整最小和最大颜色对比度值 显示显示调整 选项并拖动两个句柄。如果需要，请通过直接单击 显示器调整 窗口中的通道名称来更改通道颜色，以便选择新颜色。
注意：最好始终使用相同的彩色显示屏，以防止视觉偏差。 - 单击 编辑|在 微米中手动指示voxel大小的图像属性。如果voxel大小不准确，音量计算将不正确。
- 保存新设置。
- 通过选择完全封闭在图像组织部分的细胞，在 3D 重建（250 x 250 像素）中裁剪标记的星形细胞。
-
表面分割
- 使用蓝色图标引入表面。场景列表中将显示表面图标和框。容积框允许查看/隐藏数据集。
- 选择表面线并单击 跳过自动创建|手动编辑。
- 单击 轮廓|可见性和 单击 "无"。然后移动到 "选择" 视图，然后单击 "绘制 "按钮。
- 单击 "模式 "以选择绘图模式。
- 使用快速高效的 同位素 半自动绘图工具。通过移动鼠标指头来定义单元格轮廓。如果 同位素 预览与天体细胞轮廓不匹配，则调整鼠标指点位置。要验证预览版，请左键单击选择。要纠正潜在的错误，请使用 板 窗口删除当前的 Z 平面轮廓或按 Ctrl + Z。
- 使用 切片|通过 Z 平面导航的位置，通过更改 Z 平面编号移动到下一架飞机，然后启动新的轮廓。优先从细胞中间开始，然后移动到四肢。
- 当所有包含天体细胞的 Z 平面绘制轮廓时，请单击 "创建表面"。在创建表面之前，请检查所有组件是否有连接。如果没有，请在导出量数据之前选择最大数据或连接相关数据。
- 检查 数据面板 中显示的定量数据和电子表格格式的出口统计数据，从而节省体积值和单位。
- 以新名称保存表面以稍后访问它。
7. 追踪天体细胞植树
注意：这是使用开放访问软件程序 Vaa3D 完成的。
- 准备数据集
- 加载图像堆栈并搜索显示不同颜色的孤立的星形细胞或附近的星形细胞。
注：可以通过增加目标NA和抽样来改进重建的分辨率。然而，最终，由于结肠显微镜的分辨率限制，无法准确追踪到最好的星体细胞过程。应小心避免超出所获取图像分辨率的过度分解。 - 使用斐济，每个星体细胞周围都有 250 x 250 像素的图像堆栈。
- 由于 Vaa3D 跟踪仅在一种颜色上执行，请选择一个通道并停用其他通道。
- 将图像转换为 RGB 并将其保存 .tiff 格式。
- 加载图像堆栈并搜索显示不同颜色的孤立的星形细胞或附近的星形细胞。
- 阿伯追踪
- 在 Vaa3D 中打开 RGB 图像。转到图像|数据|几何然后图像重新采样，并调整X/Y和Z沃克塞尔大小值。
注：在重建星形细胞树骨时，应注意不要比图像提供的分辨率更精细地跟踪细节。 - 通过单击 整个图像的可视化| 3D 查看器来打开 3D窗口。右键单击 3D 图像并选择 右键单击以定义标记。用光标指向星体细胞的中心，然后右键单击以设置标记。
注：单击 "逃生" 可再次访问 3D 视图。 - 转到 高级|3D跟踪|Vaa3D-神经元2自动追踪。
- 在新打开的窗口上，选择应用插件的通道。
- 选择背景阈值（通常在 30 到 90 之间）。如果需要，为每个天体细胞调整此值。
- 从2D中取消检查半径，并保持自动向下样品和自动重质检查。
- 将cnn_type设置为 3，length_thresh设置为 1，SR_ratio设置为 0.1。
- 单击 "确定"后，请确保插件根据原始名称自动生成两个文件。将添加后缀-ini.swc和-坐标X-坐标-坐标Z-app2.swc。手动向这些名称文件添加一个独特的标签，以便在继续运行插件时不覆盖它们。
- 打开 对象管理器，转到 神经元|线结构，选择跟踪的星体细胞，点击 显示模式，并选择 始终线模式。
- 回到3D窗口，在那里出现星体细胞的骨架。
注：如果分割和信号不匹配，重复步骤 7.2.3-7.2.10 并调整阈值直到它们匹配。重新启动插件时，请务必重新输入其他参数，因为它们会重置。 - 右键单击 骨架 并选择首选 神经元|行#1.。。APP2_Tracing 访问将出现在新窗口表面上的定量测量 |对象注释。
注：由于光显微镜的分辨率有限，在列出的项目下显示 的测量分支数 和 分叉数 仅提供星形细胞树干复杂性的粗略估计。
- 在 Vaa3D 中打开 RGB 图像。转到图像|数据|几何然后图像重新采样，并调整X/Y和Z沃克塞尔大小值。
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Representative Results
胚胎皮质祖细胞中魔法标记的电化允许从大脑皮层发育的早期到后期标记星形细胞（图1）。这些星形细胞在产后各阶段（P4、P7、P21）的所有皮质层中被发现，因为它们广泛分散到整个大脑皮层中。他们用以 20x 0.8 NA（或更高 NA）目标获得的瓷砖组合图像进行评估，并组装为 Z 堆栈重建（图 2）。MAGIC 标记组合标记启用皮质星形细胞的个性化，并提取有关其体积和形态的信息。使用商业图像分析软件，在各星体图像堆栈的每个光学部分上划定了单个星形细胞的轮廓，以分割和重建每个星形细胞所占据的领土域（图3）。从相同的 Z 图像堆栈中，使用允许提取主星形细胞过程骨架的开放访问软件（图 4）分割了单向皮质星形细胞的分支形态。这些分割和追踪工具提供了对产后14早期至晚期个别皮质星形细胞的领土体积增加（图3）和形态复杂性（图4）的半定量评估。这些方法还揭示了不同皮质星形细胞在同一发展阶段所显示的体积和形态的异质性，如图2、图3和图4所示。
图1：在子宫电涌（IUE）中，MAGIC标记（MM）的示意图表示，以标记皮质祖先及其在大脑发育过程中的后裔。（A） MM工具包包括几个编码PB-Cytbow、托尔2-努布、PB和托尔2转置酶的质粒，以及可自我切除的Cre重组酶（seCre）。在MM构造中，三对不兼容的 lox站点（loxN、lox2272 和loxP）侧翼四个不同的 FP 编码序列（EBFP2、m 绿松石2/mCerulean、EYFP、tdTomato/mCherry），并在Cre重组后创造相互排斥的切除可能性。 在Cre行动之前，只表达第一个基因（EBFP2）。在 SeCre 诱导的克里介导切除术后，表示 tdTomato/mCherry（红色 FP）、EYFP（绿色 FP）或 m 绿松石2/mCerulean（青色 FP）。来自多个 MAGIC 标记副本的 FP 共同表达在标记细胞的细胞质（PB-CAG-细胞弓） 或细胞核（Tol2-CAG-Nucbow）中产生颜色组合。PB 和 Tol2 转换端脚框架 MM 盒式磁带允许它们集成到皮质祖先的基因组中，当 MM 构造与 PB 和 Tol2 转位酶编码质粒一起进行共电时。（B-G）IUE连续步骤的图形图示，包括麻醉怀孕小鼠的腹腔切除术（B），在胚胎（D）的横向心室注射MM质粒混合（C），通过精心定位的钳子（E）输送电脉冲，以瞄准两个脑半球之一的皮质祖细胞（F），以及怀孕小鼠腹部（G）的缝合。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：继魔法标记工具包的子宫电镀后，在产后阶段发现五颜六色的星形细胞散落在整个大脑皮层中。E15.5 小鼠皮质祖子中驱动 MM、seCre、PB 和 Tol2 转置酶表达的质粒 IUE 导致在 P4、P7 和 P21 上标记了 2-3 层神经元和星形细胞。表达水平和调色板取决于整合在皮质祖先基因组中的MM转基因的数量。从在 80μm 下垂大脑部分获得的瓷砖共存图像堆栈的最大强度投影的蒙太奇。缩放栏：200μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。
图3：在不同的发展阶段，皮质星形细胞属域的分割。在三个不同的发展阶段，分别对裁剪的共星体 Z 堆栈构图单个星形细胞（A-F）及其关联的领土域进行最大强度投影：P4（A-B、A'-B）、P7（C-D、C-D）和P21（E-F、E'F'）。缩放栏：20μm。请单击此处查看此数字的较大版本。
图4：追踪皮质星形细胞植树。两个不同的星形细胞从共晶Z堆（A-D）中裁剪，其树干重建与Vaa3D（A'-D'）在两个不同的发展阶段收集，分别：P7（A-B，A'-B'）和P21（C-D，C'-D'）。缩放栏：20μm。请单击此处查看此数字的较大版本。
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Discussion
在皮质祖细胞的魔法标记的子宫电冲（IUE）中（图1）使星形细胞在产后大脑皮层的标记在不同的产后阶段（P4-P7-P21，图2）。有趣的是，IUE 的阶段并不关键，因为从 E13.5 到 E15.5 执行的电冲产生与皮质星形细胞14类似的标记模式。然而，标记的金字塔神经元在皮质帕伦奇马的位置随电扑阶段而变化。事实上，IUE执行在E15标记层2-3神经元，而IUE执行在E13标签金字塔神经元在所有皮质层，从第5层到第2-3层6，27。MM IUE 之后皮质金字塔神经元的这种联合标记是此方法的主要局限性，因为它可防止在密集的神经元标记干扰星形细胞过程识别的层中对星形细胞形态进行半自动分割。如果这是一个问题，MM可能会在产后阶段电镀，如在PALE。在P4，在该阶段仍然存在的径向胶质纤维标签也可能干扰Vaa3D树干分割。虽然繁琐，一个解决方案，如果一个人希望在这个阶段进行天体细胞树干重建是手动删除径向胶质纤维，逐步取代径向光纤信号与黑色像素周围的感兴趣的天体使用Adobe Photoshop。
尽管有这种限制，MM IUE 是一种强大的技术，当充分执行。需要小心处理几个关键步骤：1） 胚胎在整个手术过程中必须保持湿润，并仔细操作以增加其存活率：2）使用直径大的玻璃毛细血管或挤压胚胎袋太紧可能导致袋破裂，从而导致胚胎死亡：3）在DNA注射过程中，必须避免血管出血：4） 整个过程不应持续超过40分钟，从麻醉到缝合，以最大限度地提高胚胎的存活率：5） 应激在 IUE 成功中起着至关重要的作用，因此必须避免额外的压力来源，如笼子的改变、交通、噪音和振动，从手术前 5 天到出生后 7 天，以防止流产和吃人。
值得注意的是，希望专门瞄准在给定阶段出生的细胞的实验者可以使用MM工具包，而无需添加小猪包和托尔2转置酶，因此只有电化时出生的细胞才能表达组合标签。该方法的另一个优点是它在标记细胞的密度及其在不同大脑区域的位置方面具有灵活性。事实上，通过增加MM转基因的总浓度，同时保持质粒比不变（Cre重组酶/MM结构的1：10比和转置酶/MM结构的1：2比），可以实现更密集的皮质星形标记。与单色方法相反，例如Ai9小鼠的单色转子电渗透或Cre电冲洗，其中单挑单个星形细胞的能力需要稀疏的标记，MAGIC标记策略提供的颜色对比使星形细胞在广泛的标签密度上个性化。此外，将电极探头定位在不同的方向允许瞄准不同的大脑区域，如前瞻性纹状体（心室位置的节点，与实现大脑皮层电渗透所需的多骨位置相反），或海马（介质位置的节点）28。最后，IUE可以在不同的小鼠菌株中执行，如外生（OF1，瑞士）和近亲繁殖（C57BL/6J或N）小鼠，这为在转基因动物疾病模型中使用MM工具包开辟了道路。然而，要成功地在近亲繁殖小鼠中实现IUE，应调整脉冲数量（C57BL/6小鼠的三个脉冲，瑞士的五个脉冲）、电压（30 V而不是35 V）和镇痛剂量（0.15毫克/mL丁丙诺啡股票溶液和0.8 8 Μlμg BW的注射量）。
与转基因动物育种或PALE和星轨方法相比，这种方法提供了几个优点。首先，与繁殖策略相比，它很少使用动物。它还允许标记皮质星形细胞，因为他们的发展的最初阶段，包括胚胎阶段，不像PALE4，它依赖于产后电冲。此外，与星轨方法8中使用的12个记者结构相比，该策略仅依赖于两种多色转基因，从而简化了DNA组合的制备和成像。此外，MM所表达的不同颜色之间的平衡本质上是由转基因结构决定的，并不取决于实验者对不同成分的混合。此外，这种策略可以超越简单的解剖考虑，可以成功地应用于星形细胞发育的多克隆分析，如先前发表的工作14所示。这项工作利用细胞质和核标记的罕见颜色组合来定义皮质星形细胞克隆，表明它们在生成细胞的空间分布、结构组织、数量和亚型方面表现出广泛的变异性。
由MM标记的皮质祖先产生的皮质星形细胞表现出显著的颜色对比度，并广泛分布在整个大脑皮层（图2）。使用共晶显微镜采集的简单多通道 Z 堆栈用于在几个产后阶段访问关键星形细胞特征，如其地域体积（图 3）及其形态复杂性（图 4）。除了星形细胞之外，这种方法可能被改编为研究其他胶质细胞的形态学，如寡头细胞。然而，应该记住，胸腔显微镜提供的有限分辨率只能提供部分渲染的天体细胞形态复杂性。虽然以更高的分辨率（例如 63x 1.4 NA 油目标）和去燃烧算法获得的图像可用于重建星形细胞 arbors14的更精细细节，但最好的过程无法通过传统的光学成像来解决。然而，这里提出的策略将有兴趣有效地筛选影响皮质星形细胞体积或形态的潜在表型，在神经系统疾病的小鼠模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 S. Fouquet 以及蒙彼利埃视觉和神经科学协会 （MRI 和 RAM） 的成像和动物核心设施提供的技术援助。这项工作得到了法国雷吉翁·伊勒-德-法兰西基金会和.C癌症康复基金会以及巴黎-萨克莱大学（跨学科博士倡议）到洛杉矶的奖学金的支持，欧洲研究理事会（ERC-SG 336331， PI J. 瓦莱特） 到 E. h.， 由国家重建局根据合同 ANR-10-LABX-65 （实验室生命感官）， ANR-11-EQPX-0029 （Equipex 莫福镜 2）， ANR-10-INBS-04 （法国生物成像），由欧洲研究理事会（ERC-CoG 649117，PI J. Livet）和ATIP-Avenir项目（PI K.Loulier）的雷切·梅迪卡莱基金会（DBI20141231328）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
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