Summary
Los astrocitos azulejos de la corteza cerebral uniformemente, haciendo que el análisis de su morfología compleja desafiante a nivel celular. El protocolo proporcionado aquí utiliza etiquetado multicolor basado en electroporación de útero para señalar astrocitos corticales y analizar su volumen y morfología con una canalización de análisis de imágenes fácil de usar.
Abstract
Los astrocitos protoplasmáticos (PrA) ubicados en la corteza cerebral del ratón están estrechamente yuxtapuestos, formando una matriz tridimensional aparentemente continua en etapas adultas. Hasta ahora, ninguna estrategia de inmunodetención puede señalarlos y segmentar su morfología en animales maduros y en el transcurso de la corticogénesis. Cortical PrA se origina a partir de progenitores ubicados en el palio dorsal y se puede dirigir fácilmente utilizando en electroporación de úteros de vectores integrativos. Aquí se presenta un protocolo para etiquetar estas células con la estrategia de marcadores de color que integra el genoma (MAGIC), que se basa en la transposición piggyBac/Tol2 y la recombinacióncre/lox para expresar estocásticamente proteínas fluorescentes distintas (azul, cian, amarillo y rojo) dirigidas a compartimentos subcelulares específicos. Esta estrategia de mapeo del destino multicolor permite marcar in situ progenitores corticales cercanos con combinaciones de marcadores de color antes del inicio de la gliogénesis y rastrear a sus descendientes, incluidos los astrocitos, desde etapas embrionarias hasta adultas a nivel celular individual. El etiquetado semitransparente logrado ajustando la concentración de vectores electroporados y contrastes de color proporcionados por los marcadores de color multiajustables que integran el genoma (MAGIC Markers o MM) permiten individualizar astrocitos y destacar su territorio y su compleja morfología a pesar de su densa disposición anatómica. Aquí se presenta un flujo de trabajo experimental completo que incluye los detalles del procedimiento de electroporación, la adquisición de pilas de imágenes multicanal mediante microscopía confocal y la segmentación tridimensional asistida por computadora que permitirá al experimentador evaluar el volumen y la morfología individuales de PrA. En resumen, la electroporación de magic markers proporciona un método conveniente para etiquetar individualmente numerosos astrocitos y obtener acceso a sus características anatómicas en diferentes etapas de desarrollo. Esta técnica será útil para analizar las propiedades morfológicas de los astrocitos corticales en varios modelos de ratón sin recurrir a cruces complejos con líneas de reportero transgénicos.
Introduction
Los astrocitos desempeñan numerosas funciones vitales en el desarrollo cerebral y la fisiología1. Además de su papel en la barrera hematoencefálica donde regulan la absorción de nutrientes y el flujo sanguíneo, contribuyen activamente a la formación y función de la sinapsis mientras producen neuromoduladores que pueden alterar la actividad neuronal y el comportamiento2. Además, la disfunción de los astrocitos contribuye a una variedad de trastornos neurológicos3. Los astrocitos ubicados en la corteza cerebral muestran una morfología elaborada que permite un contacto extensivo con procesos neuronales. Estos contactos, esenciales para la función de circuito, también controlan la morfosis de astrocitos y la sinaptogénesis a través de proteínas de adhesión celular4. Los neurocientíficos necesitan herramientas convenientes y robustas para investigar el desarrollo de astrocitos y la morfosis en sus modelos neurológicos de interés. Sin embargo, debido a la estrecha aposición de astrocitos a sus vecinos y su baldosa tridimensional uniforme, es difícil señalar astrocitos corticales y evaluar exhaustivamente su morfología usando inmunomarcadores.
Actualmente, dos estrategias principales de ingeniería genética permiten el etiquetado e individualización de astrocitos corticales in situ: activación escasa del reportero en líneas transgénicas de ratón o transgénesis somática utilizando electroporación de plásmidos reporteros. La primera estrategia se basa en la cría de una línea de ratón reportero azotado con ratones que expresan una forma inducible de Cre recombinase activada específicamente en astrocitos en la administración de tamoxifeno (por ejemplo, Aldh1l1-CreERT25). Varias desventajas están asociadas con esta estrategia. En primer lugar, la cría de ratones transgénicos requiere un gran número de animales y normalmente se necesitan múltiples ensayos para determinar la dosis adecuada de tamoxifeno para proporcionar un etiquetado adecuadamente escaso de los astrocitos corticales. Analizar fenotipos de astrocitos corticales en un modelo genético de ratón de interés requerirá aún más reproducción y consumo de ratón. Además, en el útero se sabe que la inyección de tamoxifeno interfiere con la parturición, haciendo que esta estrategia sea difícil de aplicar al estudio de las primeras etapas del desarrollo de astrocitos. La electroporación in vivo del ADN es una estrategia alternativa libre de tamoxifeno que se basa en un número mínimo de animales6. Realizado ya sea en etapas embrionarias o postnatales, este enfoque consiste en inyectar plásmidos reporteros en los ventrículos laterales de roedores seguidos de pulsos eléctricos que crean poros en la membrana celular, permitiendo así que el ADN entre en células progenitoras que recubren el ventrículo. Posteriormente, los transgenes reporteros transportados por los plásmidos electroporados son procesados por la maquinaria celular dirigida y expresados7. Dos métodos de electroporación han sido descritos previamente para etiquetar astrocitos corticales del ratón: 1) Etiquetado postnatal de astrocitos por electroporación (PALE), que se basa en la electroporación de 1-2 plásmidos de reportero episomal monocolor en las primeras etapas postnatales4; 2) La estrategia StarTrack basada en la electroporación utero (IUE) de múltiples plásmidos de reportero integrador de un solo color8,9,10. Aunque estas dos técnicas etiquetan eficientemente a PrA en la corteza cerebral, también presentan algunas limitaciones. En su versión inicial, ambos métodos se basan en un promotor de proteína ácida fibrilarica glial (GFAP) para impulsar la expresión en astrocitos, lo que puede sesgar el etiquetado hacia la glia radial, así como astrocitos piales y reactivos que expresan GFAP con más fuerza de lo normal descansando PrA11,12. En cuanto al PALE, otras desventajas son la etapa tardía de la electroporación, que impide el etiquetado de pra de origen temprano (o los procedentes de progenitores de delaminación temprana) y el análisis de las primeras etapas del desarrollo de la astroglia, y el uso de vectores episomales que se diluyen a través de sucesivas divisiones durante la proliferación masiva que sufre pra durante la primera semana postnatal13,14. A diferencia del PALE, StarTrack se basa en la electroporación embrionaria de plásmidos de reporteros integrativos que permiten rastrear la contribución de progenitores embrionarios y posnatales a PrA. Un esquema StarTrack actualizado basado en el promotor de ubiquitina C (UbC-StarTrack)logra una expresión más amplia de los reporteros fluorescentes tanto en el descenso neuronal como en el glial (astrocitos incluidos) de los progenitores neuronales15,16,17. Sin embargo, en su versión actual, la implementación de este enfoque es compleja, ya que se basa en una mezcla emolar de 12 plásmidos distintos que expresan seis proteínas fluorescentes (FP) con excitación parcial y espectros de emisión superpuestos.
Aquí se presenta un sencillo método de etiquetado multicolor basado en electroporación de útero utilizando construcciones de reportero integrador impulsadas por un promotor fuerte y ampliamente activo para señalar astrocitos corticales14. Además, se proporciona una canalización de análisis de imágenes fácil utilizando tanto el software de análisis de imágenes con licencia (por ejemplo, Imaris) como el de acceso abierto (Vaa3D18,19,20)para segmentar el volumen territorial de astrocitos y la arborización, respectivamente. En comparación con los métodos descritos anteriormente, esta estrategia se basa únicamente en 1-2 transductores integradores multicolores Marcadores de Color Multiadermables Integradores del Genoma (MAGIC Markers o MM21)dirigidos al compartimento de células nucleares citoplasmáticas y (opcionalmente) cuya expresión es impulsada por un promotor sintético de CAG compuesto por un potenciador de citomegalovirus, promotor de pollo β-actin, y conejo β-globin splice acceptor site22. Esto permite el etiquetado y seguimiento de astrocitos corticales, desde etapas embrionarias hasta postnatales tardías, independientemente de la expresión GFAP14,23. Cada uno de estos transgenes lleva los siguientes cuatro FP distintos: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP y tdTomato/mCherry, que muestran una superposición espectral mínima que se puede eludir fácilmente con 1) adquisición secuencial de canales; 2) Potencia de excitación optimizada y ganancia de recolección; y 3) Filtros dichroic específicos para recoger ventanas de emisión fp estrechas. La estrategia MM utiliza la recombinación Cre/lox con una cre recombinase (seCre) autoexcitable para impulsar la expresión estocástica de la FP en una población celular. Una sola copia de MM transgene expresa fp de una manera mutuamente excluyente, mientras que múltiples transgenes dan lugar a combinaciones de FP, creando docenas de tonos distintos. La integración genómica de los transgéneos es impulsada por el sistema de transposición piggyBac (PB) o Tol224,25,26. Por lo tanto, a través de la electroporación del útero, el kit de herramientas MM y el 'mosaico' multicolor que genera permiten el marcado simultáneo de múltiples progenitores corticales adyacentes y el seguimiento de su descenso glial, incluyendo astrocitos corticales, durante largos períodos. Los contrastes de color resultantes de la expresión de fp diferente permiten la delineación del contorno de PrA y posteriormente extraen información clave sobre su volumen territorial (usando IMARIS) y morfología compleja (usando Vaa3D). La estrategia multicolor presentada en detalle aquí es un método conveniente y robusto que da un acceso rápido y fácil a la superficie de astrocito cortical y morfología en ratones de tipo salvaje en varias etapas de desarrollo, y es fácilmente adaptable para investigar las características anatómicas de astrocitos en modelos de ratón de enfermedades neurológicas sin usar líneas de reportero transgénicas.
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Protocol
Todos los procedimientos de animales descritos aquí se llevaron a cabo de conformidad con las directrices institucionales. Los protocolos de animales han sido aprobados por la junta ética de experimentación animal Charles Darwin (CEEACD/N°5).
1. Preparación de plásmidos libres de endotoxinas para marcadores MAGIC en electroporación de útero
- Transformación bacteriana
- Sobre hielo, descongele las células alfa competentes DH5 almacenadas a -70 °C.
- Calentar las placas de agar que contengan el antibiótico adecuado (ampicilina de 100 μg/ml o 50 μg/mL kanamycina) a 37 °C.
- Añadir 1 μL de 5-50 ng de ADN plásmido MAGIC Markers en 10 μL de células alfa competentes DH5 descongeladas e incubar en hielo durante 10 minutos sin mezclar.
- Para la transformación del choque térmico, coloque la alícuota en un baño de agua de 42 °C durante 45 s, luego colóquela inmediatamente sobre hielo y espere de 3 a 5 minutos.
- En condiciones estériles, añadir 230 μL de SOC medio e incubar durante 1 h a 37 °C.
- Extienda el contenido de la alícuota sobre la placa de agar e incuba durante la noche a 37 °C.
- Cultivo plásmido
- A la mañana siguiente, en condiciones estériles, recoge una colonia de la placa del agar y ponla en un tubo de 14 ml que contiene 2 ml de medio LB con el antibiótico adecuado. Deje que se incuba durante el día a 37 °C en una incubadora de agitación a 300 rpm.
- Al final del día, la semilla 300 mL de LB con antibióticos utilizando el cultivo de arranque de 2 ml desde el paso 1.2.1 e incubar durante la noche a 37 °C en una incubadora de agitación a 300 rpm.
- Preparación del ADN plásmido
- A la mañana siguiente proceder con la purificación del ADN plásmido MAGIC Markers (es decir, PB-CAG-Cytbow y Tol2-CAG-Nucbow, así como plásmidos impulsados por CAG que expresan transposasas PB y Tol2 y Crecombinase) utilizando un kit maxiprep sin endotoxinas siguiendo el protocolo del fabricante.
- Elute el ADN en 200 μL de agua estéril y estimar su concentración utilizando un espectrofotómetro antes de su almacenamiento a -20 °C.
2. Preparación para marcadores MAGIC en electroporación de útero (MM IUE)
- Preparación de soluciones
- Caliente 30 ml de solución salina al 0,9% a 37 °C en un baño de agua y manténgalo caliente durante toda la duración de la cirugía.
- Preparar una mezcla de plásmidos que contenga PB-CAG-Cytbow y Tol2-CAG-Nucbow (concentración final, 0,8 μg/μL cada una), transposasas PB y Tol2 (concentración final, 0,4 μg/μL cada una), CAG-seCre (concentración final, 0,16 μg/μL) y 0,01% tinte verde rápido en PBS sin Ca2+ y Mg2+.
NOTA: Para fines de reconstrucción anatómica de astrocitos, se puede omitir la construcción de Tol2-CAG-Nucbow. Sin embargo, este plásmido es útil para distinguir dobletes de astrocitos estrechamente yuxtapuestos y cuando se utilizan marcadores MAGIC para sondear las relaciones clonales entre los astrocitos14. - Preparar solución anestésica que contenga 100 μL de ketamina (100 mg/ml) y 100 μL de xilazina (20 mg/ml) diluida en 2 ml de solución salina.
- Preparar solución analgésica diluyendo 0,3 mg/mL buprenorfina solución de stock 1:10 en solución salina.
- Preparación del material quirúrgico
- Esterilizar las herramientas quirúrgicas (ver Tabla de Materiales)a alta temperatura en un esterilizador de cuentas de vidrio o equivalente.
- Coloque una gota de gel de electrodo en un plato de 35 mm.
- Inserte el micropipette en el soporte del microinyector, rompa la punta del micropipette y aspire la solución de ADN.
- Coloque una caída de 1 μL de solución fast green (0,01 %) en la tapa de un plato de 3 cm y, utilizándolo como referencia, ajuste el diámetro de la punta del micropipette rompiendo su punta con fórceps finos. Ajuste el parámetro de presión para que el microinyector produzca caídas de tamaño equivalentes, lo que permite la entrega de aproximadamente 1 μL de solución de ADN por inyección.
- Preparación de la ratón hembra embarazada
- Pesar el ratón embarazada RjOrl:SWISS.
- Realice una inyección intraperitoneal con 12,5 μL por gramo de peso corporal (BW) de solución anestésica. Espere 5 minutos y verifique que el ratón esté dormido pellizcándose el dedo del pie.
- Una vez que el animal no responda a pellizcar, inyéctelo subcutáneamente con 1,6 μL/g BW de solución analgésico.
- Agregue una gota de gel ocular en cada ojo para evitar el secado durante la cirugía y coloque el vientre animal en la almohadilla de calentamiento.
- Afeita suavemente su abdomen, límpielo con una almohadilla empapada de yodo y desinfecta la zona afeitada con una almohadilla de alcohol.
- Organice un campo de operación colocando compresas estériles alrededor del área afeitada, limpiada y desinfectada.
3. En electroporación de útero (IUE)
- Inyección intraventricular
- Corte una incisión vertical de 2 cm a lo largo de la línea media comenzando en la parte inferior del abdomen, a través de la piel y luego a través del músculo subyacente. Exponga los cuernos uterinos manipulando suavemente las bolsas embrionarias y evalúe la ubicación del cuello uterino y el número de bolsas embrionarias a cada lado del cuello uterino.
- Oriente el cerebro del embrión E15.5 para ser electroporado con el fin de ver el bregma, fácilmente reconocido ya que su ubicación coincide con la unión de los tres vasos sanguíneos principales que corren a lo largo de las fisuras cerebrales.
- Imagine una línea virtual entre el bregma (visible a través del cráneo) y el ojo; introducir el micropipette entre la línea virtual y la fisura longitudinal, luego presione el pedal del inyector para entregar 1 μL de solución de ADN en el ventrículo lateral del hemisferio objetivo.
NOTA: Cuando se inyecta en el lugar adecuado, el ventrículo lateral relleno aparece azul, lo que indica que se ha llenado con la solución de ADN.
- Electroporación
- Aplicar los electrodos (ver Tabla de Materiales),previamente sumergidos en gel de electrodos, a ambos lados del embrión inyectado con el ánodo que cubre el hemisferio inyectado. Presione el pedal del electroporador para entregar una serie de cuatro pulsos de 50 ms de 35 V, cada uno separado por un intervalo de 950 ms.
- Humedezca el embrión con solución salina calentada.
NOTA: Los embriones deben mantenerse húmedos utilizando solución salina calentada durante toda la operación quirúrgica y el útero no debe secarse. - Repita los pasos 3.1.2–3.2.2 para cada embrión.
- Una vez que todos los embriones dirigidos hayan sido electroporados, reemplace los cuernos uterinos en el abdomen empujándolos suavemente con fórceps de vuelta a su posición original. Llene la cavidad abdominal con solución salina calentada para evitar que el útero se seque mientras se hacen suturas.
- Primero cierre el músculo abdominal con una sutura absorbible continua, y luego la piel con múltiples puntadas individuales (~10) usando sutura 4-0.
- Ponga al animal en una jaula limpia, acostado de lado sobre una toalla de papel limpia y gire al animal hacia el otro lado cada 5-10 minutos hasta que despierte y comience a moverse por su cuenta.
- Evaluar el estado del animal al día siguiente, especialmente si se ha hecho un nido.
NOTA: No se requiere tratamiento postcirugía. En ausencia de un nido, cualquier signo de dolor (por ejemplo, postración, pelaje peludo) y/o sangrado abundante, el animal debe ser eutanasiado sin demora.
4. Recolección y seccionamiento de tejidos
- Recolección de tejidos
- Inyecte fenobarbital (100 mg/kg de BW) por vía intraperitoneally para anestesia terminal en el momento de la cosecha deseado. En este caso, los tiempos de cosecha fueron en los días postnatal (P) P4, P7 y P21.
- Realice perfusión intracardiaca utilizando solución a base de paraformaldehído prefabricado en frío.
- Disecciona el cerebro y colóquelo durante la noche a 4 °C en la solución basada en paraformaldehído para la postfiguración.
- Histología
- A la mañana siguiente enjuague el cerebro 3x durante 10 minutos con 1x PBS.
- Incrustar el cerebro en 3% agarose disuelto en 1x PBS.
- Corte secciones de 80 μm utilizando un microtome de hoja vibratoria.
- Recoger secciones en una placa de 24 pozos precargada con 1x PBS.
- Monte secciones en el medio de montaje (consulte Tabla de materiales)entre la diapositiva y el deslizamiento de cubiertas. Mantenga las diapositivas montadas a -20 °C para una óptima preservación de proteínas fluorescentes y almacenamiento a largo plazo.
5. Imágenes confocales multicanal
- Ajustes del microscopio
- Configure la configuración del microscopio confocal para excitar por separado las líneas láser mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry utilizando líneas láser de 440, 515 y 559 nm, respectivamente.
- Utilice un objetivo de 20x 0.8 NA (o NA superior) y ajuste el muestreo XY y el tamaño del paso Z de acuerdo con los criterios de Nyquist.
NOTA: Las imágenes adquiridas con mayor resolución (por ejemplo, objetivo de aceite 60x 1.4 NA) y algoritmos de desconvolución permitirán la reconstrucción de los detalles más finos de los astrocitos. Sin embargo, el experimentador debe tener en cuenta que los mejores procesos de astrocitos pueden no resolverse mediante imágenes ópticas convencionales.
- Adquisición de imágenes
- Encuentra los astrocitos más brillantes en el área electroporada.
- Dado que las celdas etiquetadas situadas cerca de la superficie pueden parecer más brillantes que las más profundas del sector, ajuste la configuración de adquisición en las celdas de superficie para evitar saturar las imágenes.
- Ajuste la configuración de adquisición por separado para cada uno de los tres canales mientras se asegura de evitar la saturación de píxeles mediante HiLo LUT, que muestra cero valores como valores de píxel azul y máximo como rojo.
NOTA: Una imagen adecuadamente equilibrada debe mostrar solo unos pocos píxeles azules y casi sin rojo. - Adquiera pilas Z de azulejos de 1.024 x 1.024 píxeles utilizando la etapa motorizada del microscopio, con una superposición del 10% entre pilas adyacentes para habilitar posteriormente reconstrucciones de mosaico del área electroporada o la zona de interés.
6. Segmentación del volumen territorial de Astrocitos
NOTA: Esto se realiza utilizando un programa de software comercial (por ejemplo, IMARIS).
-
Preparación del conjunto de datos
- Recorte los astrocitos etiquetados dentro de la reconstrucción 3D (250 x 250 píxeles) seleccionando celdas completamente encerradas en la sección de tejido con imágenes.
NOTA: También es posible trabajar directamente en volúmenes más grandes si el equipo utilizado puede manejarlos. - Haga clic en el botón Superficie azul de la barra de herramientas Objeto de la vista Superar para crear una nueva superficie para cada astrólogo.
- Para obtener un mejor contraste de visualización, primero ajuste los valores de contraste de color mínimos y máximos haciendo clic en Editar | Muestre la opción Ajuste de visualización y arrastre ambos controladores. Si es necesario, cambie el color del canal haciendo clic directamente en el nombre del canal en la ventana Ajuste de visualización para seleccionar un nuevo color.
NOTA: Preferentemente siempre trabajar con la misma pantalla a color para evitar sesgo visual. - Haga clic en Editar | Propiedades de imagen para indicar manualmente el tamaño del voxel en los micrómetros. Si el tamaño del voxel no es preciso, los cálculos de volumen serán incorrectos.
- Guarde la nueva configuración.
- Recorte los astrocitos etiquetados dentro de la reconstrucción 3D (250 x 250 píxeles) seleccionando celdas completamente encerradas en la sección de tejido con imágenes.
-
Segmentación de superficies
- Utilice el icono azul para introducir una superficie. Aparecerá un icono y un cuadro de Surface en la lista Escena. Un cuadro Volumen permite ver u ocultar el conjunto de datos.
- Seleccione la línea de superficie y haga clic en Omitir creación automática | Editar manualmente.
- Haga clic en Contorno | Visibilidad y haga clic en Ninguno. A continuación, vaya a la vista Seleccionar y haga clic en el botón Dibujar.
- Haga clic en Modo para seleccionar el modo de dibujo.
- Utilice la herramienta de dibujo semiautomatizado Isoline rápida y eficiente. Defina el contorno de celda moviendo el puntero del ratón sobre él. Si la vista previa de isolina no coincide con el contorno de astrocito, ajuste la posición del puntero del ratón. Para validar la vista previa, haga clic izquierdo en la selección. Para corregir posibles errores, utilice la ventana Tablero para eliminar el contorno actual del plano Z o pulse Ctrl + Z.
- Uso de | slice Posición para navegar a través de los planos Z, muévase al siguiente plano cambiando el número de plano Z e inicie un nuevo contorno. Comience preferentemente desde el centro de la célula y luego muévase a las extremidades.
- Cuando se hayan dibujado contornos en todos los planos Z que contienen el astrocito, haga clic en Crear superficie. Antes de crear una superficie, compruebe que todos los componentes están conectados. Si no es así, seleccione los más grandes o conecte los relevantes antes de exportar datos de volumen.
- Compruebe los datos cuantitativos que se muestran en el Panel de datos y exporte estadísticas en formato de hoja de cálculo, ahorrando valor de volumen y unidad.
- Guarde la superficie con un nuevo nombre para acceder a ella más adelante.
7. Localización de arborización de astrocitos
NOTA: Esto se hace utilizando el programa de software de acceso abierto Vaa3D.
- Preparación del conjunto de datos
- Cargue la pila de imágenes y busque astrocitos aislados o astrocitos cercanos que muestren colores distintos.
NOTA: La resolución de la reconstrucción puede mejorarse aumentando el objetivo NA y el muestreo. En última instancia, sin embargo, debido al límite de resolución de la microscopía confocal, los mejores procesos de astrocitos no se pueden rastrear con precisión. Se debe tener cuidado de evitar el exceso deegmentación más allá de la resolución de las imágenes adquiridas. - Con Fiji, recorta pilas de imágenes de 250 x 250 píxeles alrededor de cada astrocito.
- A medida que el trazado vaa3D se realiza en un solo color, seleccione un canal y desactive los demás canales.
- Convierte la imagen en RGB y guárdala en formato .tiff.
- Cargue la pila de imágenes y busque astrocitos aislados o astrocitos cercanos que muestren colores distintos.
- Rastreo de arbores
- Abra la imagen RGB en Vaa3D. Ir a Image | | de datos Geometría a continuación, remuestreo de imageny ajuste los valores de tamaño voxel X/Y y Z.
NOTA: Durante la reconstrucción de los astrócitos, se debe tener cuidado de no rastrear detalles más finos que la resolución proporcionada por las imágenes. - Abra una ventana 3D haciendo clic en Visualizar | visor 3D para toda la imagen. Haga clic con el botón derecho en una imagen 3D y elija 1-right-click para definir el marcador. Apunte con el cursor el centro del astrólogo y, a continuación, haga clic con el botón derecho para establecer un marcador.
NOTA: Haga clic en Escape para tener acceso a la vista 3D de nuevo. - Vaya a | de seguimiento 3D de | avanzado Vaa3D-Neuron2-auto-tracing.
- En la ventana recién abierta, seleccione el canal en el que desea aplicar el complemento.
- Elija un umbral de fondo (a menudo entre 30 y 90). Adapte este valor para cada astrólogo si es necesario.
- Desmarque el radio del 2D y mantenga la muestra de auto-down y el resampleo automático marcados.
- Establece cnn_type en 3, length_thresh a 1 y SR_ratio a las 0.1.
- Después de hacer clic en Aceptar, asegúrese de que el complemento genera automáticamente dos archivos basados en el nombre original. Se agregará el sufijo –ini.swc y -coordinateX–coordinateY-coordinateZ-app2.swc. Agregue manualmente una etiqueta distintiva a estos archivos de nombre para no sobrescribirlos mientras continúa ejecutándose el plug-in.
- Abra el Administrador de objetos,vaya a Neuron | Estructura de línea, seleccione el astrocito trazado, haga clic en Modo de visualizacióny seleccione Modo de línea siempre.
- Vuelve a la ventana 3D, donde aparece un esqueleto del astrocito.
NOTA: Si la segmentación y la señal no coinciden, repita los pasos 7.2.3–7.2.10 y ajuste el umbral hasta que lo hagan. Asegúrese de volver a introducir los demás parámetros a medida que se restablecen cuando se reinicia el complemento. - Haga clic con el botón derecho en el esqueleto y seleccione la primera opción de la neurona | línea #1... APP2_Tracing acceder a mediciones cuantitativas que aparecerán en una nueva ventana Surface| Anotación de objeto.
NOTA: Debido a la resolución limitada de la microscopía ligera, las mediciones mostradas bajo los elementos enumerados Número de ramas y Número de bifurcaciones proporcionan sólo una estimación aproximada de la complejidad del astrocito arbóreo.
- Abra la imagen RGB en Vaa3D. Ir a Image | | de datos Geometría a continuación, remuestreo de imageny ajuste los valores de tamaño voxel X/Y y Z.
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Representative Results
La electroporación de marcadores MAGIC en progenitores corticales embrionarios permite el etiquetado de astrocitos desde etapas tempranas hasta tardías de desarrollo de corteza cerebral (Figura 1). Estos astrocitos se encontraron en todas las capas corticales en varias etapas postnatales (P4, P7, P21) mientras se dispersaban ampliamente en toda la corteza cerebral. Fueron evaluados con imágenes confocales en mosaico adquiridas con un objetivo de 20x 0.8 NA (o NA superior) y ensamblados como reconstrucciones de pila Z(Figura 2). Magic Markers etiquetado combinatorio permitió la individualización de astrocitos corticales y la extracción de información sobre su volumen y morfología. Utilizando el software de análisis de imágenes comerciales, el contorno de los astrocitos individuales se delineó en cada sección óptica individual de pilas de imágenes confocales para segmentar y reconstruir el dominio territorial ocupado por cada astrocito (Figura 3). A partir de las mismas pilas de imágenes Z, la morfología ramificada de los astrocitos corticales singled-out se segmentó utilizando el software de acceso abierto que permite la extracción del esqueleto de los principales procesos de astrocitos (Figura 4). Estas herramientas de segmentación y rastreo proporcionaron una evaluación semicuantitativa del aumento del volumen territorial(Figura 3)y la complejidad morfológica(Figura 4)que se produjo para los astrocitos corticales individuales desde las etapas postnatal tempranas hasta tardías14. Estos enfoques también revelaron la heterogeneidad del volumen y la morfología mostradas por distintos astrocitos corticales en la misma etapa de desarrollo, como se ilustra en la Figura 2, Figura 3y Figura 4.
Figura 1: Representación esquemática de magic markers (MM) en electroporación utero (IUE) para etiquetar progenitores corticales y su descenso durante el desarrollo cerebral. (A) El kit de herramientas MM comprende varios plásmidos que codifican PB-Cytbow, Tol2-Nucbow,PB y Tol2 transposases, y cre recombinasa autoexcitable (seCre). En las construcciones MM, tres pares de sitios lox incompatibles(loxN, lox2272y loxP)flanquean cuatro secuencias de codificación FP distintas (EBFP2, mTurquoise2/mCerulean, EYFP, tdTomato/mCherry) y crean posibilidades mutuamente excluyentes de escisión tras la recombinación de Cre. Antes de la acción de Cre, sólo se expresa el primer gen (EBFP2). Después de la escisión mediada por Cre inducida por seCre, se expresa tdTomato/mCherry (FP roja), EYFP (FP verde) o mTurquoise2/mCerulean (FP cian). La coexpresión de FP a partir de múltiples copias magic markers produce combinaciones de color en el citoplasma (PB-CAG-Cytbow) o núcleo (Tol2-CAG-Nucbow) de las células etiquetadas. El endfeet de transposición PB y Tol2 que enmarca los casetes MM permite su integración en el genoma de los progenitores corticales cuando las construcciones MM son coelectroporadas junto con plásmidos de codificación de transposases PB y Tol2. (B–G) Ilustración gráfica de pasos sucesivos de la IUE incluyendo la laparotomía de ratones embarazadas anestesiados (B), inyección de la mezcla de plásmidos MM (C) en los ventrículos laterales de los embriones (D), la entrega de pulsos eléctricos a través de pinzas cuidadosamente posicionadas (E) para apuntar progenitores corticales en uno de los dos hemisferios cerebrales (F), y el suturado del abdomen del ratón embarazada (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Siguiendo en la electroporación de uteros del kit de herramientas MAGIC Markers, se encontraron astrocitos multicolores dispersos en toda la corteza cerebral en etapas posnatales. IUE de plásmidos que conducen mm, seCre, PB, y Tol2 transposases expresión en E15.5 ratón cortical progenitores dio lugar a etiquetado de la capa 2–3 neuronas y astrocitos en P4, P7, y P21. El nivel de expresión y la paleta de colores dependían del número de transgéneros MM integrados en el genoma de los progenitores corticales. Montaje de proyecciones de intensidad máxima a partir de pilas de imágenes confocales de azulejos adquiridas en secciones cerebrales sagitales de 80 μm. Barra de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Segmentación del dominio territorial de astrocitos corticales en distintas etapas del desarrollo. Proyecciones de intensidad máxima de astrocitos individuales confocales de pila Z recortados(A-F)y su dominio territorial asociado segmentado con el software comercial (A'-F') en tres etapas de desarrollo distintas: P4 (A-B, A'-B'),P7 (C-D, C'-D') y P21 (E-F, E'-F'),respectivamente. Barra de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Seguimiento de la arborización cortical de astrocitos. Ejemplos de dos astrocitos distintos recortados de pilas Z confocales(A-D)y reconstrucción de su arborización segmentada gruesamente con Vaa3D (A'-D')recogidos en dos etapas de desarrollo distintas: P7 (A-B, A'-B') y P21 (C-D, C'-D'),respectivamente. Barra de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En la electroporación utero (IUE) de MAGIC Markers en progenitores corticales(Figura 1)permitió el etiquetado de astrocitos a lo largo de la corteza cerebral posnatal en diferentes etapas posnatales (P4-P7-P21, Figura 2). Curiosamente, la etapa de la IUE no es crítica, ya que la electroporación realizada de E13.5 a E15.5 produce patrones de etiquetado similares relativos a los astrocitos corticales14. Sin embargo, la ubicación de las neuronas piramidales etiquetadas en el parénquima cortical varía con la etapa de electroporación. De hecho, la IUE realizada en E15 marca la capa 2–3 de las neuronas, mientras que la IUE actuó en las etiquetas E13 de las neuronas piramidales en todas las capas corticales, desde la capa 5 hasta la capa 2–36,27. Este etiquetado articular de las neuronas piramidales corticales después de MM IUE es la principal limitación de este método, ya que evita la segmentación semiautomatada de morfología de astrocitos en capas donde el etiquetado neuronal denso interfiere con el reconocimiento de procesos de astrocitos. Si eso fuera un problema, MM podría electroporarse en etapas postnatales como en PALE. En P4, el etiquetado de las fibras radiales de glia que todavía están presentes en esa etapa también puede interferir con la segmentación del árbol Vaa3D. Si bien es engorroso, una solución si se desea proceder con la reconstrucción del astrocito arbóreo en esta etapa es eliminar manualmente las fibras gliales radiales reemplazando progresivamente la señal de fibra radial por píxeles negros alrededor del astrocito de interés utilizando Adobe Photoshop.
A pesar de esta limitación, MM IUE es una técnica potente cuando se realiza adecuadamente. Algunos pasos críticos deben ser manejados con cuidado: 1) los embriones deben mantenerse húmedos durante todo el procedimiento quirúrgico y cuidadosamente manipulados para aumentar su supervivencia; 2) el uso de capilares de vidrio con un gran diámetro o exprimiendo bolsas embrionarias demasiado firmemente puede conducir a la ruptura de la bolsa y por lo tanto la muerte de los embriones; 3) durante la inyección de ADN, se deben evitar los vasos sanguíneos para prevenir el sangrado; 4) todo el procedimiento no debe durar más de 40 minutos desde la anestesia hasta la sutura con el fin de maximizar la supervivencia embrionaria; 5) el estrés juega un papel crítico en el éxito de la IUE y, por lo tanto, se deben evitar fuentes adicionales de estrés como el cambio de jaula, transporte, ruidos y vibraciones desde 5 días antes de la cirugía hasta 7 días después del nacimiento para prevenir el aborto y el canibalismo.
Cabe destacar que los experimentadores que deseen dirigirse específicamente a las células nacidas en una etapa determinada pueden utilizar el kit de herramientas MM sin añadir las transposas de piggyBac y Tol2 de forma que sólo las células nacidas en el momento de la electroporación expresen las etiquetas combinatorias. Otra ventaja del método es la flexibilidad que confiere en términos de la densidad de las células etiquetadas y su ubicación en varias regiones cerebrales. De hecho, el etiquetado más denso de los astrocitos corticales se puede lograr aumentando la concentración total de transgénitos MM manteniendo la relación de plásmidos constante (relación 1:10 para las construcciones Cre recombinase/MM y relación 1:2 para construcciones transposasas/MM). Contrariamente a los enfoques monocromáticos, como la electroporación de transposones de un solo color o la electroporación Cre en ratones Ai9, donde la capacidad de señalar astrocitos individuales requiere un etiquetado escaso, los contrastes de color ofrecidos por la estrategia MAGIC Markers permiten la individualización de astrocitos en una amplia gama de sensibilidades de etiquetado. Además, la colocación de las sondas de electrodos en orientaciones distintas permite dirigirse a distintas regiones cerebrales como el estriado prospectivo (ánodo en la posición ventral, opuesto a la posición dorsal necesaria para lograr la electroporación en la corteza cerebral), o hipocampo (ánodo en posición medial)28. Por último, la IUE se puede realizar en diferentes cepas de ratones como ratones de raza (OF1, suiza) y endogámicos (C57BL/6J o N), lo que abre el camino para el uso del kit de herramientas MM en modelos de enfermedades animales transgénicas. Sin embargo, para lograr con éxito la IUE en ratones endogámicos, se debe adaptar el número de pulsos (tres pulsos para ratones C57BL/6 frente a cinco pulsos en suizo), voltaje (30 V en lugar de 35 V) y dosis analgésica (solución de stock de buprenorfina de 0,15 mg/ml y un volumen inyectado de 0,8 μL/g BW).
En comparación con la cría de animales transgénicos o los enfoques PALE y StarTrack, este método ofrece varias ventajas. Para empezar, a diferencia de la estrategia de cría, utiliza pocos animales. También permite el etiquetado de astrocitos corticales desde las primeras etapas de su desarrollo, incluyendo etapas embrionarias, a diferencia del PALE4,que se basa en la electroporación posnatal. Además, en comparación con las doce construcciones de reporteros utilizadas en el enfoque StarTrack8,esta estrategia se basa sólo en dos transgenes multicolores, lo que hace que la preparación de la mezcla de ADN y las imágenes sean más simples. Además, el equilibrio entre los diferentes colores expresados estoicamente por MM está intrínsecamente determinado por la estructura de los transgéneros y no depende de la mezcla de diferentes componentes por el experimentador. Además, esta estrategia puede extenderse más allá de una simple consideración anatómica y puede aplicarse con éxito para el análisis multiclonal del desarrollo de astrocitos, como se demostró en la obra14publicada anteriormente. Este trabajo, utilizando combinaciones de colores raros de marcadores citoplasmáticos y nucleares para definir clones corticales de astrocitos, demostró que muestran una amplia variabilidad en términos de distribución espacial, organización estructural, número y subtipo de células generadas.
Los astrocitos corticales nacidos de progenitores corticales etiquetados con MM mostraron un contraste de color significativo y se dispersaron ampliamente a través de toda la corteza cerebral(Figura 2). Las adquisiciones simples de pila Z multicanal utilizando microscopía confocal se utilizaron para acceder a características clave de astrocitos como su volumen territorial(Figura 3)y su complejidad morfológica(Figura 4)en varias etapas postnatales. Más allá de los astrocitos, esta metodología puede adaptarse para estudiar la morfología de otras células gliales como oligodendrocitos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la resolución limitada ofrecida por la microscopía confocal sólo puede proporcionar una representación parcial de la complejidad morfológica de los astrocitos. Mientras que las imágenes obtenidas con mayor resolución (por ejemplo, objetivo de aceite 63x 1.4 NA) y algoritmos de desconvolución se pueden utilizar para reconstruir detalles más finos de los astrocitos14,los mejores procesos no se pueden resolver con imágenes ópticas convencionales. No obstante, la estrategia presentada aquí será de interés para detectar eficientemente un fenotipo potencial que afecte al volumen de astrocitos corticales o morfología en modelos de ratón de enfermedades neurológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a S. Fouquet y a las instalaciones de imágenes y núcleos animales del Institut de la Vision y el Institut des Neurosciences de Montpellier (RMN y RAM) por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por becas de Région Ile-de-France y La Fundación ARC pour la Recherche sur le Cancer a S.C, y de la Université Paris-Saclay (Iniciativas Doctorales Interdisciplinaires) a Los Ángeles, financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC-SG 336331, PI J. Valette) a E.H., por Agence Nationale de la Recherche bajo los contratos ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging) , por Fundación pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), por el Consejo Europeo de Investigación (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) y por el programa ATIP-Avenir (PI K. Loulier).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
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