Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Høy gjennomstrømning kvantitativ RT-PCR i enkelt- og bulk C. elegans prøver ved hjelp av nanofluidisk teknologi

Published: May 28, 2020 doi: 10.3791/61132
Automatic Translation
*1, *2,3,5, 1, 1, 1, 2,3,4, 1, 1
1Babraham Institute, 2Gurdon Institute, University of Cambridge, 3Department of Genetics, University of Cambridge, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute, 5Laboratory of Virology and Infectious Disease, The Rockefeller University
* These authors contributed equally

Summary

I denne artikkelen er en høy gjennomstrømningsprotokoll for rask og pålitelig bestemmelse av genuttrykksnivåer i enkelt- eller bulk C. elegans-prøver beskrevet. Denne protokollen krever ikke RNA-isolasjon og produserer cDNA direkte fra prøver. Den kan brukes sammen med høy gjennomstrømning multipleksede nanofluidiske qPCR-plattformer i sanntid.

Abstract

Dette papiret presenterer en høy gjennomstrømning omvendt transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) analyse for Caenorhabditis elegans som er rask, robust og svært følsom. Denne protokollen oppnår nøyaktige målinger av genuttrykk fra enkeltormer eller fra bulkprøver. Protokollen som presenteres her gir en ny tilpasning av eksisterende metoder for komplementær DNA (cDNA) forberedelse kombinert med en nanofluidisk RT-qPCR plattform. Den første delen av denne protokollen, kalt 'Worm-to-CT', tillater cDNA-produksjon direkte fra nematoder uten behov for tidligere mRNA-isolasjon. Det øker eksperimentell gjennomstrømning ved å tillate fremstilling av cDNA fra 96 ormer i 3,5 timer. Den andre delen av protokollen bruker eksisterende nanofluidisk teknologi for å kjøre RT-qPCR med høy gjennomstrømning på cDNA. Dette papiret evaluerer to forskjellige nanofluidiske chips: den første kjører 96 prøver og 96 mål, noe som resulterer i 9216 reaksjoner i ca 1,5 dager med benkarbeid. Den andre sjetongtypen består av seks 12 x 12 arrayer, noe som resulterer i 864 reaksjoner. Her demonstreres Worm-to-CT-metoden ved å kvantifisere mRNA-nivåene av gener som koder varmesjokkproteiner fra enkeltormer og fra bulkprøver. Forutsatt er en omfattende liste over primere designet for å forsterke bearbeidet RNA for de fleste koding gener innenfor C. elegans genom.

Introduction

Optimaliseringen av encellede RNA-sekvensering og qPCR viste at transkripsjonspulser eller utbrudd kan føre til massiv variasjon i antall RNA-molekyler per celle1. Videre avdekket disse teknologiene betydelig cellulær heterogenitet som tidligere var savnet av standard bulktranskripmiske målinger. Avhengig av konteksten er noen encellede transkripsjonsvariasjoner forårsaket av blandet cellulær sammensetning av vev. Men selv i isogenic cellepopulasjoner dyrket under samme miljø er det utbredt transkripsjonell heterogenitet2,3. Denne "biologiske variasjonen" blir i økende grad identifisert som en allestedsnærværende eiendom av mobilnettet, fra bakterier til mann. I noen tilfeller kan det ha fenotypiske konsekvenser i utvikling, kreftprogresjon, HIV-ventetid og respons påkjemoterapi 4,5.

Nematoden Caenorhabditis elegans er en unik modell organisme med ideelle egenskaper for å studere årsakene og konsekvensene av biologisk variasjon mellom individer. Disse nematodene er en enkel modell organisme bestående av 959 celler, og deres gjennomsiktige skjellaget gjør dem mottagelige for in vivo imaging studier6. C. elegans er en hermafroditisk art som hovedsakelig reproduserer gjennom selvbefruktning; dette resulterte i isogene laboratoriestammer. Til tross for isogenitet og kontrollerte kulturforhold, er mange fenotyper og transkripsjoner variable på tvers av individer, noe som tyder på at stokastiske eller mikromiljømessige forskjeller bidrar til heterogenitet på tvers av individer7,8. Slike variasjoner i genuttrykk har flere fitness konsekvenser, inkludert variasjon i penetrering av mutasjoner, overlevelse, utviklingstiming og fecundity7,8,9. På grunn av disse funksjonene gir enkeltormstudier den enestående muligheten til å studere biologisk variasjon i en hel organisme.

Det er et grunnleggende behov i feltet for å utvikle og optimalisere teknologier for nøyaktig påvisning av transkripsjoner på ett ormnivå. Nye teknologier, for eksempel enkeltorm RNA sekvensering10,RNA sekvensering fra isolert vev11,og encellet sekvensering12 er nå tilgjengelig for C. elegans. En hovedutfordring gjenstår imidlertid: Når du overvåker interindividualitet, faller svakt uttrykte gener ofte under påviselige nivåer13. Dette er spesielt relevant for sjeldne transkripsjoner isolert fra små mengder startmateriale, da det er et veletablert, omvendt forhold mellom gjennomsnittlig uttrykk og teknisk varians, noe som ofte fører til at sjeldne transkripsjoner faller under statistiske cutoffs13. Optimaliseringen av høygjennomstrømming multipleksede qPCR-teknologier har vist seg nyttig for pattedyr encellede studier, spesielt når du studerer uttrykket for sjeldnetranskripsjoner 14,15. Denne teknologien kan også brukes til benchmarking og validering formål med andre single-orm teknologier.

Orm-til-CT er en rask, robust metode tilpasset fra et sett som brukes i cellebiologistudier, for enkeltorm cDNA-preparat. cDNA oppnådd ved denne metoden kombinert med multipleksed nanofluidisk qPCR-teknologi ble valgt fordi den gir høyere eksperimentell gjennomstrømning, et bredere dynamisk deteksjonsområde og har blitt validert for encelledeformål 14,15. CDNA-preparatet som er beskrevet, gjelder også for bruk med standard PCR-teknologier. Gjennomstrømningen økes på to måter: For det første er cDNA-preparatet raskere og mer pålitelig enn tradisjonell guanidiumthiocyanat-fenol-kloroformekstraksjon, fordi ormer legges direkte til lysisbufferen, hopper over direkte isolering av lett nedbrytbar RNA. For det andre øker bruk av nanofluidiske teknologier betydelig antall prøver og mål som kan kjøres samtidig. I dette papiret sammenlignes to sjetonger: en enkeltmatbrikke og en multi-array chip. En enkeltmatchip kan kjøre 96 enkeltormer og 96 primersett, noe som resulterer i 9216 reaksjoner per eksperiment. For å oppnå en lignende gjennomstrømming ved hjelp av standard qPCR-teknologier ville kreve 96 separate qPCR eksperimenter, ved hjelp av 96 brønnplater. Den mindre og mer fleksible multi-array chip består av seks 12 x 12 arrays som resulterer i 864 reaksjoner. Metodens overlegne pålitelighet og følsomhet forsterkes av nanofluidisk teknologi og ved innføring av et forenklingstrinn. Metoden som presenteres i dette papiret er ment å brukes sammen med en toppmoderne statistisk algoritme for å trekke ut biologisk varians. Denne artikkelen presenterer protokollen for rask cDNA forberedelse og høy gjennomstrømming qPCR for både single-orm og batch orm prøver; algoritmen vil bli publisert andre steder. For denne protokollen bør organiseringen av hver brikke være forberedt før eksperimentet. Tabell 1 og Tabell 2 viser eksempler på disse planene for henholdsvis en multi-array- og enkeltmatong. Det finnes også oversikter over Worm-to-CT-protokollen som er beskrevet i figur 1 og kjører multi-array- og enkeltmatbrikker i figur 2.

Protocol

MERK: Gjennom denne protokollen er Caenorhabditis elegans referert til som "orm" eller "ormer". En rekke C. elegans stammer kan bestilles gjennom online databaser eller ved å kontakte laboratorier som bruker modellen organismen direkte. Del I i denne protokollen (avsnitt 1−3) beskriver cDNA-preparat gjennom Worm-to-CT-protokollen. Del II i denne protokollen (avsnitt 4-13) beskriver kjøring av RT-qPCR med høy gjennomstrømning ved hjelp av nanofluidics, tilpasset fra en protokoll utviklet av Fluidigm16. Denne protokollen gjelder for bruk av de to typene nanofluidiske chips definert tidligere, single-array chip, som kan overvåke 96 mål i 96 prøver (9216 RT-qPCR reaksjoner totalt), eller multi-array chip, som fungerer som underenheter av 12 mål x 12 prøver. Hver multi-array chip inneholder seks uavhengige arrays som kan kjøres sammen eller separat. For eksempel kan bruk av en hel multi-array chip overvåke 72 mål x 12 prøver (eller omvendt), eller 36 mål x 24 eksempler (eller omvendt). Hvis du vil ha mer informasjon om noe av materialet som brukes i denne protokollen, kan du se Materials tabell.

1. RT-qPCR primer validering

MERK: Primere i sanntid ble designet basert på de anbefalte egenskapene som opprinnelig ble utstedt av MIQUE-retningslinjene17. For å gjøre primere spesifikke for bearbeidet RNA, ble produktene designet slik at de to primerne bundet til hver side av minst ett skjøtekryss. Krav til egnede primere inkluderte 20 %−80 % guanin- og cytosininnhold, en smeltetemperatur på 58–60 °C, en forskjell i smeltetemperatur mellom primerpar på ≤0,5 °C og en produktlengde på 70–120 bp. Sekvensen av primere generert finner du i supplerende tabell 1. Åpen kildekode for skriptene som brukes til å generere primere, finner du på https://github.com/s-andrews/wormrtpcr. Primer par for transkripsjoner med skjøte nettsteder ble designet slik at de ligger i to exons flankerer en intron, men ble ikke designet for å være skjøte-variant spesifikk, ved hjelp av NCBI Primer Blast programvare18. For denne studien ble primersettene sprengt mot C. elegans genom for å teste for enhver off-target komplementaritet.

  1. Hent primere fra databasen med RT-qPCR primere (Tilleggstabell 1). Alternativt kan du designe qPCR primerpar ved hjelp av nettbaserte verktøy som NCBI Primer Blast18.
  2. Utfør en qPCR-standardkurve for å overvåke spesifisitet og PCR-effektivitet for hvert par primere ved hjelp av standard qPCR-teknikker19 og følger MIQUE-retningslinjene17,20.
    MERK: Bare primerpar med R2 > 0,98 og PCR-effektivitet mellom 85 % og 115 % bør brukes. Sekvensen, PCR-effektiviteten og R2 for primerne som brukes i denne studien er beskrevet i tabell 3.

2. Orm lysis gjennom Worm-to-CT

  1. Velg ormene fra deres bakterielle plen på en frisk, usettet NGM-plate og la ormene bevege seg rundt platen i 5 minutter for å fjerne de fleste bakteriene fra ormen gjennom bevegelsen.
    MERK: Den bakterielle plenen og vekstforholdene vil variere avhengig av eksperimentell design. Eksperimentene som presenteres her krever 6 cm NGM plater seeded med OP50 Escherichia coli med ormer av interesse vokst til stadium L4.9 i en 20 ° C inkubator.
  2. I en RNase-fri hette forbereder du en hovedblanding bestående av 12,5 μL 2x RT-buffer, 1,25 μL 20x RT-enzymbuffer og 0,25 μL kjernefritt vann per prøve. Tilsett 14 μL master mix til 11 μL av hver prøve fra trinn 2.8.
  3. Plasser lokket på en PCR-stripe opp ned på plattformen til disseksjonsområdet og tilsett 10 μL av lysisblandingen til kuppelformede PCR-rørhetter under et sammensatt mikroskop.
    MERK: Med bare ett eller to prøver er det bedre å bruke en PCR-stripe som inneholder minst fire rør, da dette reduserer risikoen for at caps sprengningen åpnes i de påfølgende fryse-tine trinnene. Alternativt kan gummibånd brukes til å holde hettene på plass. I så fall må du sørge for at caps er ordentlig lukket hver gang rørene overføres.
  4. Plukk ormene fra platen inn i hvert spor av lokket som inneholder lysisblandingen ved å "øse" dem (det vil si å fange ormene under med hakke) for å unngå bakteriell forurensning. Lukk rørene og spinn dem ned i 5 s ved hjelp av en bordplate mikrocentrifuge (Table of Materials) før du plasserer dem i en Dewar kolbe fylt med flytende nitrogen.
    MERK: Mellom 15 og 30 ormer bør brukes til bulkeksperimenter og 1 orm for enkeltormmålinger.
    FORSIKTIG: Ved håndtering av flytende nitrogen bruk Cryo-Hansker samt vernebriller og følge standard klær forskrifter, fordi kontakt med hud eller øyne kan forårsake alvorlig frostskader.
  5. Frys-tine PCR rør 10x ved å overføre dem mellom flytende nitrogen og en ~ 40 ° C vannbad. La rørene stå i det flytende nitrogenet i minst 5 s for å sikre at prøvene er helt frosset. La rørene stå i vannbadet til prøvene tiner. Ikke la det stå i en lengre periode, da dette fører til RNA-nedbrytning.
    MERK: Rør kan stå i flytende nitrogen i lengre tid, da prøvene fryses til ca. -200 °C, noe som reduserer RNA-nedbrytningen. Dette bør imidlertid ikke være et protokollstoppepunkt, fordi flytende nitrogen fordamper raskt.
  6. Bland prøvene på en termisk mikser (Table of Materials) satt til 4 °C i 20–30 min roterende ved ~1800 o/min.
  7. Mens prøvene blandes, tin stoppløsningen på is.
  8. Spinn prøvene ned med en mikrocentrifuge (Table of Materials) og tilsett 1 μL stoppløsning til hvert rør.
    MERK: Prøvene kan stå ved -80 °C i opptil 1 uke før de transkriberer RNA (avsnitt 3).

3. Omvendt transkripsjon

MERK: For omvendt transkripsjon av enkeltormer ble resultatene vist her generert ved hjelp av reagensene som følger med nanofluidiske chips (alternativ 2 i figur 1). Reagensene som er uthevet i alternativ 2 i figur 1 ble også brukt til omvendt transkripsjon av samlede prøver. Begge metodene fungerer om hverandre for de ulike eksempeltypene.

  1. Omvendt transkripsjon av enkeltormer
    1. I en RNase-fri hette legger du til 1,25 μL omvendt transkripsjonsblanding (Materials table) til et nytt PCR-rør.
      MERK: En 96-brønns PCR-plate og en automatisk pipette kan brukes hvis det er mange prøver. Produsentens protokoll sier at 1 μL kan brukes per prøve.
    2. Ta 5 μL av lysisoppløsningen og stopp løsningsblandingen fra trinn 2.8 og legg den til det friske PCR-røret som inneholder den omvendte transkripsjonsblandingen.
      MERK: Produsentens protokoll sier at 1 μL RNA (2,5 pg/μL–250 ng/μL) kan brukes per reaksjon. En negativ RT-kontroll per plate kan tilsettes ved å erstatte omvendt transkripsjonsblanding med 5 μL lysed prøve og 1,25 μL RNAsefritt vann.
    3. Kjør prøvene ved hjelp av følgende omvendt transkripsjonsprogram på en termocycler: 25 °C i 5 min, 42 °C i 30 min, 85 °C i 5 min og 4 °C i ∞.
      MERK: Den produserte cDNA kan oppbevares ved -20 °C før den går videre til forsterkning og datainnsamling ved hjelp av qPCR med høy gjennomstrømming.
  2. Omvendt transkripsjon for bulkprøver (15-30 ormer)
    1. I en RNase-fri hette forbereder du en hovedblanding bestående av 12,5 μL 2x RT-buffer, 1,25 μL 20x RT-enzymbuffer og 0,25 μL kjernefritt vann per prøve. Tilsett 14 μL master mix til 11 μL lysis løsning og stopp løsning blanding fra trinn 2.8.
      MERK: Ved håndtering av et stort antall prøver kan dette utføres i 96 brønnplater.
    2. Kjør prøvene gjennom en termocycler ved hjelp av følgende omvendt transkripsjonsprogram: 37 °C i 60 min, 95 °C i 5 min og 4 °C i ∞.
    3. Fortynn den produserte cDNA 1:4 i kjernefritt vann.
      MERK: Vanligvis kommer produktene til et endelig volum på 25 μL, og i så fall bør 75 μL tilsettes. Men på grunn av kondens kan det endelige volumet variere. Juster derfor tilsvarende for å gjøre et 1:4-forhold i den endelige løsningen. Dette fortynningstrinnet gjelder ikke hvis du utfører qPCR på enkeltormer. CDNA produsert kan lagres ved -20 °C før du går videre til forsterkning og datainnsamling ved hjelp av høy gjennomstrømming qPCR.

4. Klargjøre multipleks primer mix

  1. Forbered en forover/bakover (F/R) primer lager for hvert par primere ved 50 μM endelig konsentrasjon. Bland det samme volumet av forover og revers primere på 100 μM hver.
  2. Kombiner 1 μL av 50 μM F/R primer lager for hvert primerpar som skal testes. Tilsett DNA-suspensjonsbufferen opp til et totalt volum på 100 μL.
    MERK: Lager primerkonsentrasjonene her er forskjellige fra de som er beskrevet i produsentensprotokoll 16, men beholder samme endelige konsentrasjon på 500 nM.

5. Mål spesifikk forenkling

  1. Forbered en masterblanding som inneholder 1 μL preamplifisering mastermix (Table of Materials), 0,5 μL av den samlede primerblandingen (trinn 4,2) og 2,25 μL kjernefritt vann per reaksjon med et 10% samlet overskuddsvolum.
  2. I en 96 brønnplate, aliquot 3,75 μL av master mix i så mange brønner som kreves for antall prøver som skal kjøres.
  3. Tilsett 1,25 μL av cDNA-løsningene av interesse generert i trinn 3.1.3 eller 3.2.3 til hver brønn.
  4. Dekk platen med 96 godt tetting tape, kort virvel, og sentrifuge med en bordplate plate spinner. Overfør til en termocycler og kjør følgende program: 95 °C i 2 min, 15 sykluser med denning ved 95 °C i 15 s, glødende/forlengelse ved 60 °C i 4 min og 4 °C i ∞.
    MERK: Produsenten anbefaler fra 10-20 sykluser for forenklingsreaksjonen16. Denne protokollen anbefaler 10 eller 15 sykluser avhengig av uttrykksnivåene til målgenene.

6. Exonuclease I behandling

MERK: Dette er for å fjerne innlemmede primere fra forenkling.

  1. Forbered en exonuclease I blanding som inneholder 0,2 μL exonuclease I reaksjonsbuffer (Table of Materials),0,4 μL exonuclease I ved 20 U / μL (Table of Materials), og 1,4 μL kjernerfri vann per prøve. Hold alle reagenser på is, spesielt exonuclease I.
  2. Fjern 96-brønnplaten (trinn 5.4) fra termocycleren, sentrifuge med bordplatespinneren, og fjern forsiktig forseglingen. Tilsett 2 μL av eksonukleæren jeg blander til hver forenklingsreaksjon. Sett den 96 brønnplaten tilbake i termocycleren ved hjelp av følgende program: 37 °C i 30 min, 80 °C i 15 min og 4 °C for ∞.
  3. Ta prøvene ut av termocycleren og fortynne dem 1:5 ved å tilsette 18 μL 1x Tris EDTA buffer (Materialseksa ).
    MERK: Det er mulig å oppbevare cDNA-prøvene ved -20 °C til senere bruk. Produsentens protokoll antyder potensielle fortynninger av 5x, 10x eller 20x på dettestadiet 16, avhengig av uttrykksnivået for målene av interesse.

7. Klargjøre analysen blander

MERK: Analyseblandinger kan tilberedes i 384 brønnplater, da brønnene har samme avstand som nanofluidiske chips, noe som gjør lasting enklere.

  1. Klargjøre analyseblandinger for en multi-array chip
    1. Forbered en hovedblanding bestående av 2 μL 2x analyselastereagens (Materialsekk) og 1,6 μL DNA-suspensjonsbuffer (Materialtabell) for hver brønn i henhold til den tilberedte planen. Aliquot 3,6 μL av denne masterblandingen per godt inn i en 384 brønnplate.
    2. Tilsett 0,4 μL av 50 μM F/R primer lager utarbeidet i trinn 4.1 til de aktuelle brønnene i henhold til den tilberedte planen.
      MERK: Dette gir totalt 4 μL analyseblanding per brønn, med et overskudd på 1 μL.
  2. Klargjøre analyseblandinger for en enkeltmatbrikke
    1. Forbered en masterblanding bestående av 3 μL 2x analyselastereagens og 2,4 μL DNA-suspensjonsbuffer for hver brønn i henhold til den tilberedte planen. Aliquot 5,4 μL av denne masterblandingen per godt inn i en merket 384 brønnplate.
    2. Tilsett 0,6 μL av 50 μM F/R primer lager til de aktuelle brønnene i henhold til den tilberedte planen.
      MERK: Dette gir totalt 6 μL analyseblanding per brønn, med et overskudd på 1 μL.

8. Klargjøre prøveblandingene

MERK: Prøveblandinger kan tilberedes opptil 1 dag i forveien og lagres ved 4 °C.

  1. Klargjøre prøver for en multi-array chip
    1. Forbered en prøvemasterblanding bestående av 2 μL 2x fluorescerende sondesupermix med lav ROX (Materials)og 0,2 μL prøvereagens (Materialstable ) per prøve. Dispenser 2,2 μL av denne blandingen i den merkede 384 brønnplaten.
      MERK: Produsenten anbefaler at du ikke virvler prøvereagensen16.
    2. Pipette 1,8 μL av hver forhåndsforsterket, exonuclease jeg behandlet prøve fra trinn 3.2.3 inn i de aktuelle brønnene i henhold til den tilberedte planen.
      MERK: Dette gir totalt 4 μL, med et overskudd på 1 μL.
  2. Klargjøre prøver for en enkeltmatbrikke
    1. Forbered en prøve master blanding bestående av 3 μL av 2x fluorescerende sonde supermix med lav ROX (Table of Materials) og 0,3 μL av 20x DNA-bindende fargestoff prøvelasting reagens ( Table ofMaterials) per prøve. Dispenser 3,3 μL av denne blandingen i den merkede 384 brønnplaten.
    2. Pipette 2,7 μL av hver forhåndsforenklet og utslettede jeg behandlet prøve fra trinn 6,3 inn i de aktuelle brønnene i henhold til den tilberedte planen.
      MERK: Dette gir totalt 6 μL, med et overskudd på 1 μL. Hvis det er noen brønner som skal kjøres uten en prøve, må disse lastes med prøvemasterblanding og 2,7 μL vann i stedet for cDNA. Dette anbefales for begge sjetongtyper. Maskinen trenger lav ROX i hvert innløp for å oppdage brikkens rutenett.

9. Priming nanofluidic chip

MERK: En multi-array chip trenger bare å bli primet på første løp. Hvis det er påfølgende løp av samme chip dette stadiet kan hoppes over. Disse trinnene er de samme for begge sjetongtypene.

  1. Sakte og forsiktig injiserer du hele 150 μL av kontrolllinjevæsken fra sprøytene som følger med i akkumulatorene på brikken. Pass på at ingen kontrollvæske berører brikken ved å holde brikken i en 45° vinkel og holde spissen av sprøyten unna for å unngå søl.
  2. Fjern den blå beskyttelsesfilmen fra bunnen av brikken.
  3. Plasser brikken i nanofluidics PCR-grunningsmaskinen (Materials table), med strekkoden vendt utover. Kjør'Prime (153x)'skriptet, som tar ~ 15-20 min.
    MERK: Slå på nanofluidics termocycler (Table of Materials) på dette stadiet, fordi kameraet tar ca 10 min å kjøle seg ned til under 0 ° C.

10. Lasting av nanofluidisk chip

  1. Fjern barrierepluggene sekvensielt etter hvert som lasting foregår. Dette reduserer sjansen for feillasting av brønner.
  2. Overfør enten 3 μL for en multi-array chip eller 5 μL for en enkelt-array chip av hver primer analyse blander og prøveblandinger til tilsvarende viker av nanofluidic chip i henhold til den tilberedte planen. Pass på at du ikke introduserer bobler, noe som kan føre til at det totale volumet som overføres, er mindre enn ønsket.
    MERK: Hvis det er noen brønner som skal kjøres uten primer, er det viktig at disse lastes med hovedblanding, og erstatter primervolumet med vann. Dette gjelder begge sjetongtypene. På dette stadiet kan det være lettere å plassere brikken på en mørk overflate, noe som vil tillate brønnene å bli sett lettere.

11. Kjører nanofluidic chip

MERK: Første gang du kjører en flermatbrikke, konfigurerer du sporingsfilen ved å velge Verktøy | Fleksi seks brukssporing, klikkNy , skriv inn et filnavn og velg en plassering før du klikker Ferdig.

  1. Åpne datainnsamlingsprogramvaren. Klikk Start ny kjøring. Plasser den lastede brikken i nanofluidics termocycler med strekkoden vendt utover.
  2. Velg prosjektinnstillingen hvis det er aktuelt, og klikk deretter neste | Last inn. Hvis du laster inn en multi-array chip, velger du partisjonene (matrisene) som skal kjøres.
  3. Velg programmet Referansesonder, endre deretter programtypen til Genuttrykk, og endre den passive referansen til ROX. Velg enkeltsondeanalysen, endre probetypen til Eva Green, og klikk Neste.
  4. Velg den termiske sykkelprotokollen GE FLEX seks Fast PCR+Melt v1 for å kjøre en multi-array chip, eller protokollen GE 96.96 Fast PCR + Melt v2 for å kjøre en enkeltmatbrikke.
  5. Bekreft at Automatisk eksponering er valgt, og klikk Start kjør.

12. Post chip kjøre

MERK: Denne delen er bare nødvendig for multi-array chips når du ikke bruker hele brikken.

  1. Ta brikken ut av nanofluidics termocycler og last inn i nanofluidics PCR priming maskin og kjøre Post Run (153x) script, som varer 5 min.
  2. Merk pluggene som brukes til personlig referanse.
    MERK: Brikken kan nå lagres ved romtemperatur, og de resterende arrayene på brikken kan kjøres innen 2 måneder.

13. Opprydding og analyse av data

  1. Åpne dataene i programvaren 'Real-Time PCR Analysis' (Materials tabell). Kontroller den smeltende topptemperaturen for hvert primerpar som er testet. Eliminer resultatene som viser mer enn én smeltetemperaturtopp, for et gitt primerpar.
    MERK: Flere topper vises bare av og til, antagelig når primerpar danner dimers, eller fra interaksjoner mellom mål primere med andre primere i den samlede primerblandingen.
  2. Eksporter dataene som en "heatmap" regnearkfil og eliminere mislykkede eksempler eller primere.
  3. Analysere data ved hjelp av standard Delta-Ct-metode21. For statistisk evaluering utføre enveis ANOVA på relative uttrykksnivåer.

Representative Results

Validering av Worm-to-CT som en cDNA-tilberedningsmetode

For å teste om Worm-to-CT-protokollen er en gyldig cDNA-ekstraksjonsmetode, ble den sammenlignet med standard guanidium tiocyanat-fenol-kloroformekstraksjonsmetoder. Resultatene er vist i figur 3, hvor cDNA ble utarbeidet fra et gjennomsnitt på ~ 1000 ormer ved hjelp av standard guanidium thiocyanate-fenol-kloroform ekstraksjonteknikker 22 og fra 30 ormer ved hjelp av Worm-to-CT-metoden. Prøvene ble varmesjokkert samtidig (30 min ved 34 °C). Globalt var hsp-70 mRNA-uttrykksnivåer per 100 ng av totalt RNA sammenlignbare ved hjelp av begge metodene. Men i tilfelle av høyeste hsp-70 uttrykk (det vil si, i N2 etter varmesjokk) uttrykknivåer var høyere med Worm-to-CT-metoden, noe som indikerer forbedret følsomhet.

For å finne ut om en forventet reduksjon i hsp-uttrykk i hsf-1(sy441)23, kunne en mutasjon i hovedtranskripsjonsregulatoren av molekylære chaperones23,24, reproduseres, transkripsjons chaperone induksjon etter et kort varmesjokk ble sammenlignet. Med begge metodene ble det påvist en reduksjon i hsp-70 induksjon hos hsf-1(sy441) dyr. Dette var forventet, fordi muterte hsf-1(sy441) dyr viser en redusert evne til å indusere chaperones på grunn av en avkorting i transaktivering domenet til HSF-1. For guanidium tiocyanat-fenol-kloroform ekstraksjon hsp70 redusert med 82,7% sammenlignet med kontroller og 92,3% for Worm-to-CT sammenlignet med vill type dyr (figur 3). Resultatene var sammenlignbare mellom begge metodene og sammenlignbare med tidligere rapporter23. Disse resultatene indikerer at Worm-to-CT-metoden er et gyldig alternativ til standard cDNA synteseteknikker.

Validering av nanofluidics PCR-plattformen som brukes til å forsterke mRNA-mål

For å teste konsistensen av resultatene ved hjelp av nanofluidisk qPCR for transkripsjonsforsterkning, ble PCR-resultatene fra Worm-to-CT-bulkmetoden sammenlignet på både et standard qPCR-system (Materials)og et nanofluidisk qPCR-system ved hjelp av en multi-array chip. Folden endring i uttrykket av tre forskjellige gener, sma-3 (Figur 4A), sma-10 (Figur 4B), og dnj-26, ble overvåket (Figur 4C) i dyr som bærer en null allele i dbl-1 (dbl-1 (nk3))25 sammenlignet med vill type kolleger. Dbl-1 koder den eneste ligande av Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalveien. sma-3 og sma-10 er gener som koder SMAD orthologues, viktige komponenter i BMP signalkaskade. Dnj-26 koder en molekylær chaperone, et mål for BMP-signalering. Disse resultatene viser liten eller ingen forskjell i foldeendringen som sammenligner resultatene av de to metodene, noe som resulterer i ikke signifikante P-verdier på henholdsvis 0,3113, 0,2635 og 0,3481 for sma-3, sma-10og dnj-26. Til sammen viser disse resultatene at Worm-to-CT-metoden som brukes på bulkprøver, er en effektiv og rask måte å trekke ut RNA fra få ormer og gir pålitelige data når den er kombinert med enten standard PCR-systemer eller nanofluidikkbaserte qPCR-plattformer med høy gjennomstrømning.

Sammenligning mellom uttrykksnivåene oppnådd ved bulkprøver med gjennomsnitt hentet fra enkeltormer

De relative uttrykksnivåene ble beregnet ved hjelp av enten cDNA hentet fra bulkprøver (25 ormer) eller fra et gjennomsnitt på 36 enkeltormprøver (figur 5). Begge cDNAs ble oppnådd ved hjelp av Worm-to-CT-metoden og forsterket ved hjelp av nanofluidics PCR-teknologi. Som observert i figur 5A–C, for alle chaperones testet (det vil at hsp16.1, F44E5.4, hsp-70), metodene oppdaget sammenlignbare uttrykksnivåer. Disse resultatene indikerer at parametere hentet fra enkelt ormer er pålitelige.

Anvendelse av Worm-to-CT kombinert med nanofluidics teknologi for å estimere single-orm genuttrykk parametere

Fordi single-array chip tillater overvåking av opptil 96 mål transkripsjoner på 96 individuelle prøver, er det derfor godt egnet til å overvåke individuell variasjon i transkripsjon uttrykk mellom enkelt ormer. Figur 6A presenterer et representativt resultat som viser det gjennomsnittlige uttrykket for flere hsp-transkripsjoner fra enkeltormer etter et kort varmesjokk. Som observert i figuren, variabiliteten i uttrykket av transkripsjoner varierte dramatisk på tvers av forskjellige gener (figur 6A). For å få ytterligere innsikt ble variasjonskoeffisienten (CV) beregnet ved å dele standardavviket med gjennomsnittet avuttrykksnivåene 26 (figur 6B). Tre gener hvis CV-verdier tidligere er estimert ved alternative metoder ble overvåket (upubliserte data). To stabile transkripsjoner (ife-1 og Y45F10D.4) og én variabel (nlp-2927) viste forventet variabilitet. Grafen viser også tydelig den velkjente inverse relasjonen mellom variasjonsverdier og uttrykksnivåer26 (figur 6B).

Tekniske repliker er av avgjørende betydning for å sikre reproduserbarhet ved bruk av bulkprøver. Dette er imidlertid ikke nødvendigvis tilfelle for encellede eksperimenter14,15,28. For å finne ut om bruk av tekniske repliker er nødvendig for parameterestimering ved bruk av enkeltormprøver, ble 28 individuelle ormer høstet, etter et kort varmesjokk og behandlet ved hjelp av tekniske triplicates. CV-verdiene beregnet ut fra enkeltormdata innhentet i triplikate (blå prikker i figur 7, teknisk CV) sammenlignet med de for hver transkripsjon hentet fra individuelle ormer (røde prikker i figur 7, biologisk variasjon) ble sammenlignet. For hver transkripsjon som ble testet, var de tekniske CVene lavere enn de biologiske CV-ene, noe som indikerer at tekniske triplikater ikke var nødvendige for parameterestimering. Det faktum at tekniske replikeringer ikke er nødvendig øker gjennomstrømningen av eksperimentet uten å gå på akkord med kvaliteten.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over Worm-to-CT-protokollen.
Denne figuren viser en kort oversikt over de forskjellige trinnene som kreves for å kjøre ormer gjennom Worm-to-CT-protokollen. To valgfrie metoder vises for trinnet for omvendt transkripsjon. dette er utskiftbare metoder for begge typer chip. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over tilberedning og drift av nanofluidisk qPCR.
Denne figuren viser forberedelser for å kjøre nanofluidisk qPCR-system ved hjelp av en multi-array chip og en single-array chip. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Worm-to-CT-protokollen på bulkprøver ga pålitelige resultater.
Sammenligning av Worm-to-CT-protokoll versus vanlig guanidiumthiocyanat-fenol-kloroformekstraksjon22 på bulkprøver. I samsvar med tidligere funn, i hsf-1(sy441) mutanter23, nivåene av hsp transkripsjoner som svar på varmesjokk redusert. De ovennevnte histogrammene viser induksjon av hsp-70 i fravær av (-), eller følgende (+) et kort varmesjokk på 30 min ved 34 °C. CDNA ble oppnådd ved hjelp av guanidium tiocyanat-fenol-kloroform ekstraksjon brukt på 1000 ormer (venstre) eller ved hjelp av Worm-to-CT-metoden brukes på 30 samlede ormer (høyre). Uttrykksnivåene for hsp-70 per 100 ng av totalt RNA oppnådd ved hver metode ble sammenlignet. Som forventet, i hsf-1 (sy441) transkripsjonsinduksjon av hsp-70 som svar på varmesjokk betydelig redusert med 82,7% ved hjelp av guanidium tiocyanat-fenol-kloroform og med 92,3% ved hjelp av Worm-to-CT-metoden. MRNA-nivåene fra målgener ble normalisert mot gjennomsnittet av de tre rengjøringsgenene cdc-42, PMP-3og ire-1. Hver prikk representerer en biologisk repliker. Data ble logg forvandlet for statistisk analyse, da de ikke oppfylte konvensjonene som kreves for parametrisk analyse. Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av en RM-En-veis ANOVA ved hjelp av Sidaks flere sammenligningstest. Vill type = N2, hsf-1 = hsf-1 (sy441). Stolper angir standardfeilen for gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Uttrykksmønstre var konsistente mellom standard qPCR- og nanofluidiske qPCR-systemer.
(A)Uttrykksnivået av sma-3 (A), sma-10 (B) eller dnj-26 (C) mRNA ble bestemt gjennom vanlig qPCR og nanofluidisk qPCR (multi-array chip) fra tre biologiske repliker av cDNA generert gjennom Worm-to CT fra vill type belastning (N2) og dbl-1 (nk3) knockout stamme25. Relative mRNA-uttrykksnivåer ble bestemt for hver belastning ved hjelp av Delta-Ct-metoden21. Fold endring ble deretter bestemt ved å dele uttrykksnivåene oppnådd i dbl-1 (nk3) ormer med tilsvarende mRNA nivåer i N2 belastning. Som vist i panel Avar mønstrene konsistente for begge metodene i hver enkelt biologisk replikering. (B) og (C) er de samme som (A) for henholdsvis SMA-10 og dnj-26 mRNA. Mål mRNA nivåer ble normalisert mot rengjøring gener cdc-42 og pmp-3. Statistisk analyse ble beregnet for hvert gen ved hjelp av en paret t-test som sammenlignet resultatene av de tre biologiske replikeringene produsert gjennom standard qPCR og de som genereres gjennom nanofluidisk qPCR. P-verdiene for disse sammenligningene var henholdsvis 0,3113, 0,2635 og 0,3481 for sma-3, sma-10og dnj-26. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bruk av Worm-to-CT-metoden på bulkprøver eller på enkeltormer ga lignende uttrykksnivåer når de normaliseres per orm.
Uttrykksnivåene (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4 og (C) hsp-70 (C12C8.1) ble analysert hos unge voksne dyr i fravær av varmesjokk enten ved å utføre Worm-to-CT på en bulk på 25 dyr, eller på 36 enkeltpersoner. Når dataene ble normalisert per orm, var det ingen signifikant forskjell mellom nivåer oppnådd per orm for hver transkripsjon ved hjelp av begge metodene. MRNA-nivåene fra målgener ble normalisert mot gjennomsnittet av de tre rengjøringsgenene cdc-42, PMP-3og ire-1. Stolper representerer standardfeilen for gjennomsnittet. Statistikk = paret t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Rt-qPCR med høy gjennomstrømning på enkeltormer ved hjelp av Worm-to-CT-metoden kan overvåke inter-individuell variasjon i genuttrykk.
(A)Gjennomsnittlig uttrykksnivåer for 53 transkripsjoner oppnådd ved eksponering for et kort varmesjokk (30 min ved 34 °C). Boxplots representerer fordelingen av gjennomsnittlig mRNA-uttrykk fra individuelle ormer (et gjennomsnitt på tre tekniske repliker ble brukt per individuell orm). Prikkene representerer uttrykksnivåer i 28 individuelle ormer. MRNA-nivåene fra målgener ble normalisert mot gjennomsnittet av de tre rengjøringsgenene cdc-42, PMP-3og ire-1. (B)Variasjonskoeffisienten26 (CV) som en funksjon av gjennomsnittlig mRNA-uttrykk for 53 transkripsjoner etter eksponering for et kort varmesjokk ble beregnet fra 28 individuelle dyr (rådata vist i panel B). Settet med transkripsjoner inkluderer variabelen nlp-29 transkripsjon27 og to stabiletranskripsjoner (ife-1 og Y45F10D.4; upubliserte data). CVen er forholdet mellom standardavviket og gjennomsnittet. Denne CVen ble brukt til å estimere inter-individuell variasjon i transkripsjonsuttrykk mellom individuelle ormer. Som forventet skaleres inter-individuell variasjon med reduserte gjennomsnittlige uttrykksnivåer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Tekniske replikeringer var ikke nødvendig når man analyserte inter-individuell variasjon i genuttrykk ved hjelp av en nanofluidisk chip.
Dataene som presenteres i denne grafen ble innhentet i 28 individuelle ormer etter et kort varmesjokk (30 min ved 34 °C). Hver røde prikk representerer variasjonskoeffisienten (CV) av gjennomsnittlige transkripsjonsuttrykksnivåer for én transkripsjonsanalysert mellom 28 individuelle ormer (bio CV). Hver blå prikk representerer CV-en av uttrykksnivåer mellom tre tekniske replikeringer hentet fra en enkelt orm, per transkripsjonsanalyse (teknisk CV). Denne grafen viser at teknisk variasjon (mellom tekniske repliker) var mye lavere enn biologisk variasjon (mellom individuelle ormer), noe som tyder på at det er unødvendig å utføre tekniske repliker på en nanofluidisk genuttrykksarray når analyse av genuttrykk i enkeltormer, på samme måte som encelledestudier 14,15,28. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Planlegg oppsett for en multi-array chip. Tabellen ovenfor viser et enkelt oppsett som kan brukes når du planlegger en multi-array chip kjøre. Til venstre er de områdene som skal fylles med primer målene av interesse og til høyre er områder som skal fylles med prøvene av interesse. Hver analyse og prøvematrise er paret nummervis gjennom brikken. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Planlegg oppsett for en enkeltmatbrikke. Tabellen ovenfor viser et enkelt oppsett som kan brukes når du planlegger en enkeltmatongkjøring. Til venstre er områder som skal fylles med primer mål av interesse og til høyre er områder som skal fylles med prøvene av interesse. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Liste over RT-qPCR primere som brukes i denne studien. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggstabell 1: Primere fra databasen med RT-qPCR-primere. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

I dette papiret er Worm-to-CT-protokollen vist seg å være en rask og effektiv metode for å trekke ut RNA fra enkeltormer eller et lite utvalg av ormer. Den høye gjennomstrømningen som tilbys av nanofluidisk system gjør den ideell for kvantifisering av inter-individuelle variasjonsmålinger. Videre gjør den høye følsomheten til denne metoden påvisning av gener uttrykt ved lave nivåer som faller under deteksjon når du bruker enkeltorm RNA-seq teknologier9.

Når du vurderer valg av metode for å forberede cDNA fra enkelt ormer. Ly et al.29 optimalisert en protokoll som er avhengig av proteinase K for cuticle fordøyelse. Skjellaget er et stort hinder for isolering av molekyler fra ormer og proteinase K gir en effektiv metode for å bryte den. Proteinase K må imidlertid varmeaktiveres for å kunne bruke enzymer for omvendt transkripsjon. Mens Ly et al. brukte en 10 min eksponering til 96 °C, ble dette trinnet unngått i denne protokollen fordi RNA er lett nedbrytbar. I stedet for å bruke proteinase K, gjentatte fryse-tine sykluser ble brukt til å bryte cuticle. Frysetiningen er en effektiv metode for å bryte skjellaget fordi mer RNA kan isoleres per orm. Ly et al. rapporterer at den totale RNA ekstrahert per orm er 35 ng ved hjelp av proteinase K, mens denne protokollen får 51,75 ng ± 6,74 SEM av total RNA per orm. Unngåelse av varmeeksponering kombinert med forenklingstrinn utvider tilsynelatende Worm-to-CT dynamisk deteksjonsområde sammenlignet med standardprotokoller. Ly et al. rapportere absolutte Ct verdier på 21,1 ± 0,15 for hsp-16,2 og 22,8 ± 0,17 for hsp-70 etter varmesjokk. Ved hjelp av de samme varmesjokkforholdene (1 t ved 30 °C) får denne protokollen absolutte Ct-verdier på 17,93 ± 0,57 for hsp-16,2 og 21,13 ±0,33 for hsp-70. Dette indikerer at fryse-tining lysis metoden gir høyere utbytter av RNA og er mer hensiktsmessig for lavt uttrykte transkripsjoner.

Nanofluidiske systemer er ideelle når du undersøker et gitt sett med målutskrifter og bruk av enten mindre (multi-array chip) eller større (single-array chip) antall prøver som tillater tilpasning til omfanget av eksperimentet. For å få et objektivt bilde av alle transkripsjoner uttrykt i en enkelt orm, er det opplagte valget å bruke RNA-sekvensering. Hvis imidlertid fokuset på eksperimentet er et mindre, men fortsatt relativt stort sett med målgener, er det mer kostnadseffektivt å bruke denne protokollen, forutsatt at forskeren har tilgang til en nanofluidics PCR-maskin. Kostnaden for nanofluidiske systemreagenser og en enkeltmatong er estimert til ca £ 13 per orm, mens kostnadene ved reagensene for enkeltormsekvensering ville være ca £ 60 per orm, ikke inkludert sekvenseringskostnadene.

Når man vurderer hvilken PCR-plattform du skal bruke, gir Worm-to-CT-metoden kombinert med nanofluidisk qPCR fordeler med hensyn til tid og gjennomstrømning. Det er mulig å oppnå 9216 RT-qPCR-resultater i ca. 2 dagers arbeid, mens forsterkning av samme antall mål ved hjelp av en standard qPCR-plattform vil ta omtrent 5 arbeidsuker ved hjelp av 96 brønnplateanalyser, som kjører fire plater om dagen. Men hvis antall mål som skal testes er mindre, er det mer kostnadseffektivt å bruke Worm-to-CT kombinert med en standard qPCR-maskin. Enkeltmatongene kan ikke kjøres på nytt, så kjøring av tomme brønner reduserer kostnadseffektiviteten.

En begrensning av metoden er den potensielle dannelsen av primer-primer dimers under multipleksing trinn, men dette skjer i mindre enn 1% av tilfellene. Selv om Worm-to-CT-protokollen er effektiv og gir pålitelige resultater når den brukes på enkeltormer, er det en feilfrekvens på ca 5%, noe som sannsynligvis tilsvarer tilfeller der ormen forblir fanget i hetten eller toppen av røret under høstingstrinnet.

Sammen tilbyr denne allsidige og pålitelige metoden økt gjennomstrømning og følsomhet sammenlignet med mer standardteknikker. Denne metoden kan være svært nyttig for validering av skjermer med høy gjennomstrømming og er et utmerket valg for å enten overvåke eller validere genuttrykksnivåer med én orm. Denne metoden kan brukes på andre utfordrende teknikker, for eksempel mengde genuttrykk fra isolert vev. For eksempel gir isolering av fullt vev, som tarmen, gonader eller celler isolert av FACer, nok materiale til å utføre RNA-sekvenseringseksperimenter. Imidlertid fører begrensede mengder materiale ofte til dupliserte leser, noe som utelukker kvantisering av sjeldne transkripsjoner. I dette scenariet bør bruk av nanofluidics-basert teknologi gi ekstra følsomhet for eksperimentene og øke kostnadseffektiviteten hvis forskerne bare trenger å overvåke et delsett av alle transkripsjoner i disse vevene eller cellene.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Sharlene Murdoch og Babraham Institute Facilities for deres støtte. JLP ble støttet av Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) og OC støttes av ERC 638426 og BBSRC [BBS/E/B000C0426].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100µM stock primers for genes of interest.
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 for 96.96 chip (Single-Array Chip)
2X Assay Loading Reagent Fluidigm 100-7611
384 well plates
8-strip PCR tubes
96 well ice block
96 well plates
96.96 Dynamic Array IFC Fluidigm BMK-M-96.96 Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip"
96-well sealing tape
BioMark & EP1 Software Fluidigm 101-6793 Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software
BioMark or BioMark HD system Fluidigm 100-2451 K1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler"
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs Fluidigm 89000021 Referenced throughout manuscript as "control line fluid"
DNA Suspension buffer TEKnova T0021
domed PCR caps
Exonuclease I New England BioLabs M0293L
Exonuclease I reaction buffer New England BioLabs B0293S
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent Fluidigm 100-7673 referenced throughout manuscript as "sample reagent"
FLEXsix Gene Expression IFC Fluidigm 100-6308 referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide Fluidigm 68000088 This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.
IFC Controller MX Fluidigm 68000112 I1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine"
IFC Controllers SOFTWEAR Fluidigm 100-2297 Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX
liquid nitrogen in dewar
Microcentrifuge StarLab C1301B-230V Used to spin down PCR tube strips in the protocol.
Nuclease Free Water
plate spinner Labnet K4050725 mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit invitrogen 4402955 This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.
PreAmp Master Mix Fluidigm 100-5580, 100-5581
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions Fluidigm 100-6299 One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad Laboratories 172-5211 referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix"
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA TEKnova T0224 Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer
ThermoMixer C Eppendorf 5382000031 Referenced throughout the text as "thermal mixer"
Trizol Thermo-Fisher 15596026 Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform"
Warm water bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).
  2. Semrau, S., van Oudenaarden, A. Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools. Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).
  3. Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science. 358 (6359), 69-75 (2017).
  4. Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).
  5. Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , Edited by The C. elegans Research Community (2015).
  7. Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
  8. Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).
  9. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  10. Serra, L., et al. Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq. Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).
  11. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).
  12. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  13. Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).
  14. Ståhlberg, A., Kubista, M. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).
  15. Livak, K. J., et al. Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells. Methods. 59 (1), 71-79 (2013).
  16. Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide. , https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/fluidigm%3Afile (2018).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. U. S. National Library of Reference. Primer Blast. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (2020).
  19. Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).
  20. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).
  21. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Jr Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).
  22. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).
  23. Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).
  24. Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  25. Zhang, X., Zhang, Y. Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).
  26. Sørensen, J. B. The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research. Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).
  27. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).
  28. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
  29. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).

Tags

Genetikk Utgave 159 RT-qPCR single-orm C. elegans bulkprøver orm-til-CT nematoder høy gjennomstrømning nanofluidic multipleks
Høy gjennomstrømning kvantitativ RT-PCR i enkelt- og bulk <em>C. elegans prøver</em> ved hjelp av nanofluidisk teknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F.,… More

Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F., Todtenhaupt, P., Biggins, L., Miska, E. A., Andrews, S., Casanueva, O. High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology. J. Vis. Exp. (159), e61132, doi:10.3791/61132 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter