Summary
이 문서에서는 단일 또는 벌크 C. elegans 샘플에서 유전자 발현 수준의 빠르고 신뢰할 수 있는 측정을 위한 고처리량 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 RNA 절연을 필요로하지 않으며 샘플에서 직접 cDNA를 생성합니다. 고처리량 멀티플렉션 나노유체 실시간 qPCR 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다.
Abstract
이 논문은 빠르고 견고하며 매우 민감한 Caenorhabditis elegans에 대한 고처리량 역전사 정량PCR(RT-qPCR) 분석서를 제공합니다. 이 프로토콜은 단일 웜 또는 대량 샘플에서 유전자 발현의 정확한 측정을 얻습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 나노유체RT-qPCR 플랫폼에 결합된 보완DNA(cDNA) 제제를 위한 기존 방법의 새로운 적응을 제공한다. '웜 투 CT'라는 이름의 이 프로토콜의 첫 번째 부분은 이전 mRNA 절연없이 선충으로부터 직접 cDNA 생산을 허용합니다. 3.5h에서 96개의 웜에서 cDNA를 제조할 수 있게 함으로써 실험적인 처리량을 증가시킨다. 프로토콜의 두 번째 부분은 기존 나노 유체 기술을 사용하여 cDNA에서 고처리량 RT-qPCR을 실행합니다. 이 논문은 두 개의 서로 다른 나노 유체 칩을 평가합니다: 첫 번째 실행 96 샘플과 96 대상, 벤치 워크의 약 1.5 일 에서 9,216 반응의 결과. 두 번째 칩 유형은 6개의 12 x 12 어레이로 구성되어 있으며, 그 결과 864개의 반응이 발생합니다. 여기서, 웜-CT 방법은 단일 웜및 벌크 샘플로부터 열 충격 단백질을 인코딩하는 유전자의 mRNA 수준을 정량화함으로써 입증된다. 제공된 C. elegans 게놈 내의 코딩 유전자의 대다수에 대한 처리된 RNA를 증폭하도록 설계된 광범위한 프라이머 목록입니다.
Introduction
단세포 RNA 염기서열 분석 및 qPCR의 최적화는 전사 펄스 또는 버스트가 세포1당RNA 분자수에 있는 거대한 변이로 이끌어 낼 수 있다는 것을 밝혔습니다. 또한, 이러한 기술은 이전에 표준 대량 전사 측정에 의해 놓친 상당한 세포 이질성을 발견했다. 문맥에 따라, 몇몇 단세포 전사 가변성은 조직의 혼합세포 조성에 기인합니다. 그러나, 동일한 환경에서 자란 동종 세포 집단에서도 전사이질성2,3이널리 존재한다. 이 '생물학적 변동성'은 박테리아에서 인간에 이르기까지 세포 네트워크의 유비쿼터스 속성으로 점점 더 확인됩니다. 어떤 경우에는, 개발, 암 진행, HIV 대기 시간 및화학요법4,5에대한 반응에 대한 현상적 결과를 가질 수 있다.
선충 가노르하비티스 엘레간은 개인 들 간의 생물학적 가변성의 원인과 결과를 연구하기위한 이상적인 특성을 가진 독특한 모델 유기체입니다. 이러한 선충은 959세포로 구성된 간단한 모델 유기체이며, 투명한 표피는 생체 내 이미징 연구6에서그(것)들을 가능하게 합니다. C. 예르간은 주로 자기 수정을 통해 재현하는 헤르마필로디틱 종입니다. 이 등생 실험실 긴장 결과. 동종성 및 통제된 문화 조건에도 불구하고, 많은 표현형 및 성적증명서는개인에걸쳐 변수이며, 스토세스 또는 미세환경적 차이는 개인7,8에걸쳐 이질성에 기여한다는 것을 시사한다. 유전자 발현의 이러한 가변성은 돌연변이, 생존, 발달 타이밍 및 fecundity7,8,9의침투에 있는 가변성을 포함하여 다중 적당성 결과를 갖는다. 이러한 특징으로 인해 단일 웜 연구는 전체 유기체에서 생물학적 가변성을 연구할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다.
단일 웜 수준에서 성적증명서를 정확하게 탐지하기 위한 기술을 개발하고 최적화하는 분야의 근본적인 필요성이 있습니다. 단일 웜 RNA 시퀀싱10,RNA 시퀀싱(11) 및 단세포 염기서열분석(12)과 같은 새로운 기술은 C. elegans에사용할 수 있다. 그러나, 주요 과제는 남아 있습니다: 간 개인성을 감시할 때, 약하게 표현된 유전자는 수시로 검출 가능한 수준13이하로 떨어집니다. 이는 평균 표현과 기술적 차이 사이에 잘 확립된 역관계가 있기 때문에 소량의 시작 물질로부터 분리된 희귀 한 성적 증명서에 특히 관련이 있으며, 종종 드문 성적 증명서가 통계 적컷오프(13)보다낮아집니다. 고처리량 멀티플렉스 qPCR 기술의 최적화는 특히 희귀 한 성적 증명서의 발현을 연구 할 때 포유류 단일 세포 연구에 유용 입증되었습니다14,15. 이 기술은 다른 단일 웜 기술의 벤치마킹 및 검증 목적으로도 사용할 수 있습니다.
웜-CT는 단일 웜 cDNA 제제를 위해 세포 생물학 연구에 사용되는 키트에서 조정된 빠르고 견고한 방법입니다. 이 방법에 의해 얻은 cDNA는 다중나노유체제 qPCR 기술과 결합하여 더 높은 실험 처리량, 광범위한 동적 검출 범위를 제공하고 단일 세포 목적을 위해 검증되었기 때문에선택되었다(14,15). 설명된 cDNA 제제는 표준 PCR 기술과 함께 사용할 수 있습니다. 처리량은 두 가지 방법으로 증가합니다: 첫째, cDNA 준비는 전통적인 guanidium 티오야네이트-페놀 클로로폼 추출보다 빠르고 더 신뢰할 수 있습니다, 벌레가 용해 완충제에 직접 첨가되기 때문에, 쉽게 분해할 수 있는 RNA의 직접 적인 분리를 건너뜁니다. 둘째, 나노 유체 기술을 활용하면 동시에 실행할 수 있는 샘플 및 표적수가 크게 증가합니다. 이 백서에서는 단일 어레이 칩과 다배열 칩의 두 칩을 비교합니다. 단일 어레이 칩은 96개의 단일 웜과 96개의 프라이머 세트를 실행할 수 있으며, 실험당 9,216개의 반응을 얻을 수 있습니다. 표준 qPCR 기술을 사용하여 유사한 처리량을 달성하려면 96개의 웰 플레이트를 사용하여 96개의 별도의 qPCR 실험이 필요합니다. 더 작고 유연한 멀티 어레이 칩은 6개의 12 x 12 어레이로 구성되어 있으며, 그 결과 864개의 반응이 발생합니다. 이 방법의 우수한 신뢰성과 감도는 나노 유체 기술과 사전 증폭 단계의 도입에 의해 향상됩니다. 이 논문에 제시된 방법은 생물학적 차이를 추출하기 위해 최첨단 통계 알고리즘과 함께 사용되어야 합니다. 이 문서에서는 단일 웜 및 배치 웜 샘플 모두에 대한 빠른 cDNA 준비 및 고처리량 qPCR프로토콜을 제시합니다. 알고리즘은 다른 곳에서 게시됩니다. 이 프로토콜의 경우 각 칩의 구성은 실험 전에 준비되어야 합니다. 표 1과 표 2는 각각 다중 어레이 및 단일 배열 칩에 대한 이러한 계획의 예를 표시합니다. 도 1에 자세히 설명된 웜-CT 프로토콜의 개요와 그림 2에서다중 어레이 및 단일 어레이 칩을 실행합니다.
Protocol
참고: 이 프로토콜 을 통해 Caenorhabditis elegans는 "웜" 또는 "웜"이라고 합니다. 다양한 C. elegans 균주는 온라인 데이터베이스를 통해 또는 모델 유기체를 사용하는 실험실에 직접 연락하여 주문할 수 있습니다. 이 프로토콜의 파트 I(섹션 1-3)는 웜-CT 프로토콜을 통해 cDNA 제제를 설명합니다. 이 프로토콜의 파트 II (섹션 4-13)는 Fluidigm16에의해 개발 된 프로토콜에서 적응 나노 유체를 사용하여 높은 처리량 RT-qPCR을 실행하는 설명합니다. 이 프로토콜은 이전에 정의된 두 가지 유형의 나노유체 칩, 96개의 표적을 96개의 샘플(9,216 RT-qPCR 반응 합계)으로 모니터링할 수 있는 단일 어레이 칩 또는 12개의 표적 x 12샘플의 서브유닛으로 작동하는 다배열 칩의 사용에 적용됩니다. 모든 다중 어레이 칩에는 함께 또는 별도로 실행할 수 있는 6개의 독립적인 어레이가 포함되어 있습니다. 예를 들어 전체 다중 어레이 칩을 사용하면 72개의 대상 x 12개의 샘플(또는 그 반대의 경우도 마찬가지)을 모니터링할 수 있으며, 36개의 대상 x 24개의 샘플(또는 그 반대의 경우도 마찬가지). 이 프로토콜에 사용된 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를참조하십시오.
1. RT-qPCR 프라이머 유효성 검사
참고: 실시간 프라이머는 원래 MIQUE 가이드라인17에서발행한 권장 속성을 기반으로 설계되었습니다. 가공 된 RNA에 대한 프라이머를 특정하게하기 위해, 제품은 두 프라이머가 적어도 하나의 스플라이스 접합의 양쪽에 바인딩되도록 설계되었습니다. 적합한 프라이머에 대한 요구 사항에는 20%-80% 구아닌 및 사이토신 함량, 58-60°C의 용융 온도, ≤0.5°C의 프라이머 쌍 과 70-120 bp의 제품 길이 간의 용융 온도 의 차이가 포함되었습니다. 생성된 프라이머의 시퀀스는 보충표 1에서찾을 수 있다. 프라이머를 생성하는 데 사용되는 스크립트의 오픈 소스 코드는 https://github.com/s-andrews/wormrtpcr 찾을 수 있습니다. 스플라이스 사이트와 성적 증명서에 대 한 프라이머 쌍 그들은 intron 측면 두 개의 엑손에 거짓말을 하지만 NCBI 프라이머 블라스트 소프트웨어를 사용 하 여 특정 splice-변형으로 설계 되지않았습니다.18. 이 연구를 위해, 프라이머 세트는 어떤 오프 표적 상호 보완성을 위해 시험하기 위하여 C. elegans 게놈에 대하여 폭파되었습니다.
2. 웜 투 CT를 통한 웜 용해
- 세균성 잔디밭에서 부터 씨앗이 없는 NGM 플레이트에 벌레를 고르고 벌레가 5분 동안 접시 주위를 움직여 움직임을 통해 벌레에서 대부분의 박테리아를 제거할 수 있도록 합니다.
참고 : 세균 성 잔디와 성장 조건실험 설계에 따라 다를 것 이다. 여기에 제시된 실험은 20°C 인큐베이터에서 L4.9 단계로 성장한 관심의 벌레가 있는 OP50 에셰리치아 대장균으로 시드된 6cm NGM 플레이트가 필요합니다. - RNase 가 없는 후드에서는 2배 RT 버퍼12.5 μL, 20배 RT 효소 완충제의 1.25 μL, 시료당 0.25 μL로 구성된 마스터 믹스를 준비한다. 2.8단계에서 각 샘플의 11 μL에 마스터 믹스 14 μL을 추가합니다.
- PCR 스트립의 뚜껑을 해부 범위의 플랫폼에 거꾸로 놓고 용해 믹스의 10 μL을 복합 현미경으로 돔형 PCR 튜브 캡에 추가합니다.
참고: 하나 또는 두 개의 샘플만 으로는 후속 동결 해동 단계에서 캡이 폭발할 위험이 줄어들기 때문에 적어도 4개의 튜브를 포함하는 PCR 스트립을 사용하는 것이 좋습니다. 또는 고무 밴드를 사용하여 캡을 제자리에 고정할 수 있습니다. 이 경우 튜브를 옮길 때마다 캡이 제대로 닫힙니다. - 세균 오염을 피하기 위해 접시에서 침수 믹스를 포함하는 뚜껑의 각 슬롯에 웜을 선택하십시오 (즉, 선택으로 아래 벌레를 잡는 것). 튜브를 닫고 탁상 마이크로 센심 분리기(재료 표)를사용하여 5 초 동안 아래로 회전한 후 액체 질소로 채워진 드와르 플라스크에 넣습니다.
참고: 15~30개의 웜은 대량 실험과 단일 웜 측정을 위한 웜 1개를 사용해야 합니다.
주의: 액체 질소 마모 Cryo-Gloves뿐만 아니라 보호 안경과 표준 의류 규정을 준수 할 때 피부 또는 눈과접촉하면 심각한 동상 부상을 일으킬 수 있습니다. - 액체 질소와 ~40°C 수조 사이를 전송하여 PCR 튜브를 10배 동결해냅니다. 샘플을 완전히 동결하기 위해 최소 5 s의 액체 질소에 튜브를 둡니다. 샘플이 해동 될 때까지 수조에 튜브를 둡니다. 이것은 RNA 분해로 이끌어 내는 때문에, 더 긴 기간 동안 남겨두지 마십시오.
참고: 샘플이 약 -200°C로 동결되어 RNA 분해를 감소시키기 때문에 튜브는 장기간 액체 질소에 남을 수 있습니다. 그러나 액체 질소가 빠르게 증발하기 때문에 프로토콜 정지 지점이 되어서는 안됩니다. - 4°C로 설정된열믹서(재료표)에샘플을 섞어 ~1,800rpm에서 회전하는 20-30분 동안 설정합니다.
- 샘플이 혼합되는 동안 얼음의 정지 용액을 해동합니다.
- 탁상 미세원심분리기(재료표)를 사용하여샘플을 아래로 회전시키고 각 튜브에 정지 용액 1μL을 추가합니다.
참고: 샘플은 RNA(섹션 3)를 전사하기 전에 최대 1주일 동안 -80°C에 남을 수 있다.
3. 역전사
참고: 단일 웜의 역전사의 경우, 여기에 표시된 결과는 나노유체 칩(도 1에서옵션 2)과 함께 제공된 시약을 사용하여 생성되었다. 도 1의 옵션 2에서 강조 표시된 시약은 풀이 된 샘플의 역전사에도 사용되었습니다. 두 방법 중 하나는 서로 다른 샘플 유형에 대해 서로 교환적으로 작동합니다.
- 단일 웜의 역전사
- RNase 가 없는 후드에 1.25 μL의 역전사믹스(재료 표)를신선한 PCR 튜브에 넣습니다.
참고: 샘플이 많은 경우 96개의 잘 PCR 플레이트와 자동 파이펫을 사용할 수 있습니다. 제조업체의 프로토콜에 따르면 샘플당 1μL을 사용할 수 있습니다. - 용액의 5 μL을 취하고 2.8 단계에서 용액 믹스를 중지하고 역전사 믹스를 포함하는 신선한 PCR 튜브에 추가하십시오.
참고: 제조업체의 프로토콜에 따르면 RNA 1μL(2.5pg/μL-250 ng/μL)은 반응당 사용할 수 있습니다. 플레이트당 음의 RT 컨트롤은 역전사 믹스를 5 μL의 용해 시료 5μL및 1.25 μL의 RNA가 없는 물로 대체하여 첨가할 수 있습니다. - 열순환기에서 다음 역전사 프로그램을 사용하여 샘플을 실행하십시오: 5분 동안 25°C, 30분 동안 42°C, ∞ 경우 5분 동안 85°C, 4°C.
참고: 생성된 cDNA는 고처리량 qPCR을 사용하여 증폭 및 데이터 수집을 진행하기 전에 -20°C로 저장될 수 있다.
- RNase 가 없는 후드에 1.25 μL의 역전사믹스(재료 표)를신선한 PCR 튜브에 넣습니다.
- 대량 샘플에 대한 역 전사 (15-30 웜)
- RNase 가 없는 후드에서는 2배 RT 버퍼12.5 μL, 20배 RT 효소 완충제의 1.25 μL, 시료당 0.25 μL로 구성된 마스터 믹스를 준비한다. 14 μL의 마스터 믹스를 11 μL의 용액에 넣고 2.8단계에서 용액 믹스를 중지합니다.
참고: 많은 수의 샘플을 처리할 때 이 작업을 96개의 웰 플레이트에서 수행할 수 있습니다. - 다음 역전사 프로그램을 사용하여 써모사이클러를 통해 샘플을 실행하십시오: 60분 동안 37°C, 5분 동안 95°C, ∞ 4°C.
- 생성 된 cDNA를 희석 1:4 뉴클레아제없는 물에서.
참고: 일반적으로 제품은 25 μL의 최종 부피로 제공되며, 이 경우 75 μL을 추가해야 합니다. 그러나 응축으로 인해 최종 볼륨이 다를 수 있습니다. 따라서 최종 솔루션에서 1:4 비율을 만들기 위해 그에 따라 조정합니다. 단일 웜에서 qPCR을 수행하는 경우 이 희석 단계는 적용되지 않습니다. 생성된 cDNA는 고처리량 qPCR을 사용하여 증폭 및 데이터 수집을 진행하기 전에 -20°C에서 저장될 수 있다.
- RNase 가 없는 후드에서는 2배 RT 버퍼12.5 μL, 20배 RT 효소 완충제의 1.25 μL, 시료당 0.25 μL로 구성된 마스터 믹스를 준비한다. 14 μL의 마스터 믹스를 11 μL의 용액에 넣고 2.8단계에서 용액 믹스를 중지합니다.
4. 멀티플렉스 프라이머 믹스 준비
- 50 μM 최종 농도에서 프라이머 의 각 쌍에 대한 전진 / 역 (F / R) 프라이머 스톡을 준비합니다. 동일한 양의 전방 및 역 프라이머를 각각 100 μM에서 혼합합니다.
- 테스트할 각 프라이머 쌍에 대해 50 μM F/R 프라이머 스톡 1μL을 결합합니다. DNA 서스펜션 버퍼를 총 부피 100 μL까지 추가합니다.
참고: 여기서 주식 입문서 농도는 제조업체의프로토콜(16)에 설명된 것과 다르지만 동일한 최종 농도인 500 nM을 유지합니다.
5. 특정 사전 증폭을 대상으로
- 전암절 마스터믹스(재료표), 풀링 프라이머믹스의0.5 μL(단계 4.2), 반응당 2.25 μL을 함유한 마스터 믹스를 10% 전체 잉여 부피로 준비한다.
- 96 웰 플레이트에서 마스터의 알리쿼트 3.75 μL은 시료 수를 실행하는 데 필요한 만큼의 우물로 혼합합니다.
- 각 우물에 3.1.3 또는 3.2.3 단계에서 생성된 관심의 cDNA 솔루션의 1.25 μL을 추가합니다.
- 96 개의 잘 밀봉 테이프, 잠시 소용돌이 및 원심 분리기를 탁상 판 스피너로 덮습니다. 열순환기로 이전하고 다음 프로그램을 실행: 95°C 2분, 15초 동안 95°C에서 15사이클, 60°C에서 4분, ∞ 4°C.
참고 : 제조 업체는 사전 증폭 반응(16)에대한 10-20 사이클에서 권장합니다. 이 프로토콜은 표적 유전자의 발현 수준에 따라 10 또는 15 주기를 권장합니다.
6. 엑소뉴클레아제 I 치료
참고: 이는 사전 증폭에서 비법인 프라이머를 제거하는 것입니다.
- 외핵제 I 의 0.2 μL을 함유한 외핵체 I 믹스를 준비하여 외핵체 반응버퍼(재료표),엑소뉴클레아제 I의 0.4μL(재료표),샘플당 뉴클레아제 자유물의 1.4 μL을 준비한다. 얼음, 특히 엑소뉴클레아제 I에 모든 시약을 보관하십시오.
- 온도 사이클러에서 96 웰 플레이트 (단계 5.4)를 제거하고 탁상 판 스피너가있는 원심분리기를 제거하고 씰을 조심스럽게 제거합니다. 각 사전 증폭 반응에 혼합된 엑소뉴클레아제의 2 μL을 추가합니다. 재밀봉, 원심분리기, 및 다음 프로그램을 사용하여 96웰 플레이트를 다시 열순환기에 배치합니다: 30분 동안 37°C, 15분 동안 80°C, ∞ 4°C.
- 시료를 써서 1x Tris EDTA버퍼(재료 표)의18 μL을 추가하여 1:5를 희석시 희석시.
참고: 나중에 사용하기 위해 cDNA 샘플을 -20°C로 유지할 수 있습니다. 제조업체의 프로토콜은 관심 대상의 발현 수준에 따라 이 단계16에서5배, 10배 또는 20배의 잠재적 희석을 제안합니다.
7. 분석 믹스 준비
참고: 분석 믹스는 384개의 웰 플레이트로 제조할 수 있으며, 우물은 나노유체 칩과 동일한 간격을 가지므로 로딩이 더 쉬워집니다.
- 다중 어레이 칩에 대한 분석 믹스 준비
- 준비된 계획에 따라 각각 2x 분석 적재 시약(재료표)과DNA 서스펜션 버퍼(재료표)의1.6 μL로 구성된 마스터 믹스를 준비한다. 384 웰 플레이트에 잘 당이 마스터 믹스의 알리 쿼트 3.6 μL.
- 준비된 계획에 따라 적절한 우물에 4.1 단계에서 준비된 50 μM F/R 프라이머 스톡의 0.4 μL을 추가합니다.
참고: 이것은 1 μL의 잉여와 함께, 잘 당 분석 믹스의 총 4 μL을 제공합니다.
- 단일 어레이 칩에 대한 분석 믹스 준비
- 준비된 계획에 따라 각각 잘 에 대해 2x 분석 적재 시약의 3 μL 및 DNA 서스펜션 버퍼 2.4 μL로 구성된 마스터 믹스를 준비한다. 알리쿼트 5.4 μL이 마스터 믹스당 잘 표시 된 384 웰 플레이트에.
- 준비된 계획에 따라 50 μM F/R 프라이머 스톡의 0.6 μL을 적절한 우물에 넣습니다.
참고: 이것은 1 μL의 잉여와 함께, 우물 당 분석 믹스의 총 6 μL을 제공합니다.
8. 샘플 믹스 준비
참고: 샘플 믹스는 최대 1일 전에 미리 준비하고 4°C에 보관할 수 있습니다.
- 다중 어레이 칩에 대한 샘플 준비
- 낮은 ROX(재료의 표)및 샘플 시약의 0.2 μL (재료의 표)와 2 x 형광 프로브 슈퍼 믹스의 2 μL로 구성된 샘플 마스터 믹스를 준비시 샘플 당 시약(재료의 표). 이 믹스의 2.2 μL을 현저한 384 웰 플레이트에 분배합니다.
참고: 제조업체는 샘플시약(16)을소용돌이시키지 않는 것이 좋습니다. - 각 프리앰프의 파이펫 1.8 μL, 엑소뉴클레아제 나는 준비된 계획에 따라 적절한 우물로 3.2.3 단계로부터 샘플을 처리하였다.
참고: 총 4μL을 제공하며, 잉여는 1μL입니다.
- 낮은 ROX(재료의 표)및 샘플 시약의 0.2 μL (재료의 표)와 2 x 형광 프로브 슈퍼 믹스의 2 μL로 구성된 샘플 마스터 믹스를 준비시 샘플 당 시약(재료의 표). 이 믹스의 2.2 μL을 현저한 384 웰 플레이트에 분배합니다.
- 단일 어레이 칩에 대한 샘플 준비
- 낮은 ROX(재료의 표)와0.3 μL의 2x 형광 프로브 슈퍼 믹스의 3 μL및 샘플 당 20 배 DNA 결합 염료 시료 하중(재료의 표)의0.3 μL로 구성된 샘플 마스터 믹스를 준비합니다. 이 믹스의 3.3 μL을 현저한 384 웰 플레이트에 분배합니다.
- 각 사전 증폭 및 외핵제의 파이펫 2.7 μL은 준비된 계획에 따라 적절한 우물로 6.3 단계에서 샘플을 처리하였다.
참고: 총 6μL을 제공하며, 잉여는 1μL입니다. 샘플없이 실행할 우물이있는 경우 이들은 샘플 마스터 믹스와 cDNA 대신 물의 2.7 μL로로드해야합니다. 이 두 칩 유형에 대 한 권장 합니다. 이 기계는 칩의 그리드를 감지하기 위해 모든 입구에 낮은 ROX가 필요합니다.
9. 나노 유체 칩 프라이밍
참고: 다중 어레이 칩은 첫 번째 실행에서만 프라이밍해야 합니다. 동일한 칩의 후속 실행이 있는 경우이 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 이러한 단계는 두 칩 유형에 대해 동일합니다.
- 칩의 축적기에 포함된 주사기에서 제어 라인 유체의 전체 150 μL을 천천히 조심스럽게 주입합니다. 칩을 45° 각도로 잡고 주사기 끝을 멀리 잡아 서 누출을 방지 하 여 제어 액체 칩에 닿지 않도록 합니다.
- 칩 바닥에서 파란색 보호 필름을 제거합니다.
- 바코드가 바깥쪽으로 향하여 나노유체ICS PCR 프라이밍기계(재료 테이블)에칩을 넣습니다. '프라임(153x)'스크립트를 실행하면 ~15~20분이 소요됩니다.
참고: 카메라가 0°C 이하로 식히는 데 약 10분이 걸리기 때문에 이 단계에서 나노유체제 열순환기(재료표)를켭니다.
10. 나노 유체 칩을 적재
- 로딩이 수행될 때 장벽 플러그를 순차적으로 제거합니다. 이렇게 하면 우물을 잘못 로드할 가능성이 줄어듭니다.
- 준비된 계획에 따라 각 프라이머 분석 분석의 단일 어레이 칩에 대해 3 μL 또는 5 μL을 나노유체 칩의 해당 입구로 혼합하고 샘플 믹스를 전송한다. 총 볼륨이 원하는 것보다 작게 될 수 있는 거품을 도입하지 않도록 하십시오.
참고: 프라이머 없이 실행되는 우물이 있으면 마스터 믹스로 로드하여 프라이머 볼륨을 물로 대체하는 것이 중요합니다. 이는 두 칩 유형에 모두 적용됩니다. 이 단계에서는 칩을 어두운 표면에 배치하는 것이 더 쉬울 수 있으므로 우물을 더 쉽게 볼 수 있습니다.
11. 나노 유체 칩 을 실행
참고: 다중 어레이 칩을 처음 실행하면 도구를 선택하여 추적 파일을 설정| 플렉스 여섯 사용 추적, 새를 클릭, 파일 이름을 입력하고 완료를클릭하기 전에 위치를 선택합니다.
- 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다. 새 실행 시작을클릭합니다. 바코드가 바깥쪽으로 향하는 나노유체유체체 열순환기에 로드된 칩을 넣습니다.
- 해당하는 경우 프로젝트 설정을 선택한 다음 | 로드합니다. 다중 어레이 칩을 로드하는 경우 실행할 파티션(배열)을 선택합니다.
- 응용 프로그램 참조 프로브를선택한 다음 응용 프로그램 유형을 유전자 발현으로변경하고 수동 참조를 ROX로 변경합니다. 단일 프로브 분석기를선택하고 프로브 유형을 Eva Green으로변경하고 다음을 클릭합니다.
- 열 순환 프로토콜 GE FLEX 6 빠른 PCR+멜트 v1을 선택하여 다중 어레이 칩을 실행하거나 프로토콜 GE 96.96 Fast PCR+Melt v2를 선택하여 단일 어레이 칩을 실행합니다.
- 자동 노출이 선택되어 있는지 확인하고 시작 실행을 클릭합니다.
12. 포스트 칩 런
참고: 이 섹션은 전체 칩을 사용하지 않을 때다배열 칩에만 필요합니다.
- 나노 유체 체온 사이클러에서 칩을 꺼내 나노 유체 PCR 프라이밍 기계에 로드하고 5 분 동안 지속되는 포스트 런 (153x) 스크립트를 실행합니다.
- 개인 참조에 사용되는 플러그에 레이블을 지정합니다.
참고: 칩은 이제 실온에서 저장할 수 있으며 칩의 나머지 배열은 2개월 이내에 실행할 수 있습니다.
13. 데이터 정리 및 분석
- '실시간PCR 분석'소프트웨어(재료표)에서 데이터를엽니다. 테스트된 모든 프라이머 쌍에 대해 용융 피크 온도를 확인합니다. 주어진 프라이머 쌍의 경우 둘 이상의 용융 온도 피크를 나타내는 결과를 제거합니다.
참고: 여러 피크는 프라이머 쌍이 희미한 것을 형성하거나 풀이 들어있는 프라이머 믹스의 다른 프라이머와의 대상 프라이머의 상호 작용에서 가끔만 나타납니다. - 데이터를 '히트맵' 스프레드시트 파일로 내보내고 실패한 샘플이나 프라이머를 제거합니다.
- 표준 델타 Ct메서드(21)를사용하여 데이터를 분석합니다. 통계 평가의 경우 상대식 수준에서 단방향 ANOVA를 수행합니다.
Representative Results
cDNA 준비 방법으로 웜 CT의 유효성 검사
웜-CT 프로토콜이 유효한 cDNA 추출 방법인지 를 테스트하기 위해, 표준 구안디움 티오냐네이트-페놀-클로로폼 추출 방법에 비교하였다. 결과는 도 3에도시되어 있는데, 여기서 cDNA는 표준 구안티냐네이트-페놀-클로로폼 추출기술(22)을 사용하여 평균 ~1,000개의 웜으로부터 제조되었으며, 웜-CT 방법을 이용한 30개의 웜으로부터. 샘플은 열이 동시에 충격을 받았다(34°C에서 30분). 전 세계적으로, 총 RNA의 100 ng 당 hsp-70 mRNA 발현 수준은 두 가지 방법을 모두 사용하여 비교되었다. 그러나, 가장 높은 hsp-70 발현(즉, 열쇼크 다음 N2)의 경우 발현 수준은 웜-CT 방법을 통해 더 높았으며, 이는 향상된 감도를 나타낸다.
hsf-1(sy441)23에서 hsp 발현이 예상되는 감소를 결정하기 위해, 분자 샤페론(23)및24의주요 전사 조절기에서의 돌연변이가 재현될 수 있는지, 짧은 열충격 에 따른 전사 샤페론 유도를 비교하였다. 두 가지 방법으로 hsp-70 유도의 감소는 hsf-1(sy441) 동물에서 검출되었다. 이는 돌연변이 hsf-1(sy441) 동물이 HSF-1의 환원 영역에서 잘림착하여 샤페론을 유도하는 능력이 저하되기 때문에 예상되었다. 구안디움 티오산테-페놀-클로로폼 추출 hsp70의 경우 대조군 대비 82.7%, 웜 대 CT의 경우 92.3% 감소하여 야생동물(그림3)에비해 감소하였다. 결과는 두 방법 모두 와 비교했다 이전 보고서23에필적. 이러한 결과는 웜-CT 방법이 표준 cDNA 합성 기술에 대한 유효한 대안임을 나타낸다.
mRNA 표적을 증폭시키는 데 사용되는 나노유체ICPCR 플랫폼의 검증
전사적 증폭을 위해 나노유체qPCR을 사용하여 결과의 일관성을 테스트하기 위해, 웜-CT 벌크 방법에서 얻은 PCR 결과는 표준 qPCR시스템(재료 표)과다배열 칩을 이용한 나노유체 qPCR 시스템 모두에서 비교하였다. 3개의 상이한 유전자, sma-3(도 4A), sma-10(도 4B),및 dnj-26의발현의 접이식 변화는 dbl-1(dbl-1(nk3)에서 널 을 운반하는 동물에서 모니터링되었다(도4C))25 야생형에비해. Dbl-1은 뼈 모포유전학 단백질(BMP) 신호 경로의 유일한 리간드를 인코딩합니다. sma-3 및 sma-10은 BMP 신호 캐스케이드의 주요 구성 요소인 SMAD 정형소그를 인코딩하는 유전자입니다. Dnj-26은 BMP 시그널링의 표적인 분자 샤페론을 인코딩합니다. 이러한 결과는 두 가지 방법의 결과를 비교하는 접이식 변화에 거의 차이가 없는 것으로 보이며, 그 결과 sma-3, sma-10및 dnj-26에대해 각각 0.3113, 0.2635 및 0.3481의 중요한 P 값이 나타나지 않습니다. 이러한 결과는 대량 샘플에 적용된 웜-CT 방법이 몇 가지 웜에서 RNA를 추출하는 효율적이고 신속한 방법이며 표준 PCR 시스템 또는 고처리량 나노유체제 기반 qPCR 플랫폼과 결합될 때 신뢰할 수 있는 데이터를 제공한다는 것을 보여줍니다.
단일 웜에서 얻은 평균을 가진 대량 샘플에서 얻은 발현 수준 간의 비교
상대발현 수준은 벌크 샘플(25개의 벌레)에서 얻은 cDNA 또는 평균 36개의 단일 웜샘플(그림 5)을사용하여 계산하였다. 두 cDNA는 웜 CT 방법을 사용하여 수득되었고 나노 유체 PCR 기술을 사용하여 증폭되었다. 도 5A-C에서관찰된 바와 같이, 모든 보호자에 대해 테스트된 모든 보호자(즉, hsp16.1,F44E5.4, hsp-70),유사한 발현 수준을 검출한 방법. 이러한 결과는 단일 웜에서 얻은 매개 변수가 신뢰할 수 있음을 나타냅니다.
단일 웜 유전자 발현 파라미터를 추정하기 위해 나노 유체 및 기술과 결합된 웜-CT의 적용
단일 어레이 칩은 96개의 개별 샘플에서 최대 96개의 표적 전사체를 모니터링할 수 있으므로 단일 웜 간의 성적증명서 발현에서 개별 가변성을 모니터링하는 데 적합합니다. 도 6A는 짧은 열 충격 다음 단일 웜에서 여러 hsp 전사체의 평균 발현을 보여주는 대표적인 결과를 제시한다. 그림에서 관찰된 바와 같이, 성적증명서의 발현의 변동성은 상이한유전자(도 6A)에걸쳐 극적으로 달랐다. 추가 통찰력을 얻기 위해, 변형계수(CV)는 표준 편차를표현수준(26)의 평균으로 나누어 계산하였다(도6B). 이력서 값이 이전에 대체 방법에 의해 추정된 3개의 유전자 (공개되지 않은 데이터). 두 개의 안정적인성적증명서(ife-1 및 Y45F10D.4)와1개의 변수(nlp-2927)가예상 변동성을 보였다. 그래프는 또한 가변성 값과 표현 수준26(그림 6B)사이의 잘 알려진 역관계를 명확하게 묘사합니다.
기술 복제는 대량 샘플을 사용할 때 재현성을 보장하는 데 가장 중요합니다. 그러나, 이것은 반드시 단세포 실험에 대한경우(14,15,28). 단일 웜 샘플을 사용할 때 파라미터 추정에 기술적 복제의 사용이 필요한지 확인하기 위해, 짧은 열 충격에 따라 28개의 개별 웜을 수확하고 기술적 삼중생물을 사용하여 처리하였다. 삼중벌레(도 7,기술 이력서의 파란색 점)에서 얻은 단일 웜 데이터에서 계산된 CV 값과 개별 웜(도 7의적점, 생물학적 변동성)에서 얻은 모든 성적증명서에 대해 비교하였다. 테스트된 모든 성적증명서에 대해 기술 이력서는 생물학적 이력서보다 낮았으며, 이는 파라미터 추정에 기술적 삼중이 필요하지 않음을 나타냅니다. 기술 복제가 필요하지 않다는 사실은 품질을 손상시키지 않으면서 실험의 처리량을 증가시킵니다.
그림 1: 웜-CT 프로토콜 개요입니다.
이 그림은 웜-CT 프로토콜을 통해 웜을 실행하는 데 필요한 다양한 단계에 대한 간략한 개요를 보여 주습니다. 역전사 단계에 대해 두 가지 선택적 방법이 표시됩니다. 이러한 방법은 두 칩 유형에 대해 상호 교환 가능한 방법입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 나노유체 qPCR의 준비 및 실행 개요입니다.
이 그림은 다중 어레이 칩과 단일 어레이 칩을 사용하여 나노 유체 qPCR 시스템을 실행하기위한 준비를 묘사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대량 샘플에 대한 웜-CT 프로토콜은 신뢰할 수 있는 결과를 제공했습니다.
대량 샘플에서 일반 구안티움 티오시네이트 페놀 클로로폼 추출22에 비해 웜-CT 프로토콜의 비교. hsf-1(sy441)돌연변이체(23)에서,열 충격에 대응하여 hsp 성적증명서의 수준이 감소하였다. 상기 히스토그램은 34°C에서 30분의 짧은 열 충격(-) 또는 다음(+)의 부재 시 hsp-70의 유도를 묘사한다. 상기 cDNA는 1,000개의 벌레(왼쪽)에 적용된 구안티늄 티오냐네이트-페놀 클로로폼 추출을 사용하거나 30개의 풀이 있는 벌레(오른쪽)에 적용된 웜-CT 방법을 사용하여 수득되었다. 각 방법에 의해 얻어진 총 RNA의 100 ng당 hsp-70의 발현 수준을 비교하였다. 예상대로, hsf-1(sy441)에서 열 충격에 대응하여 hsp-70의 전사 유도가 구이니듐 티오야네이트 페놀 클로로폼을 사용하여 82.7% 크게 감소하고 웜-CT 방법을 사용하여 92.3% 감소하였다. 표적 유전자로부터의 mRNA 수준은 CDC-42, pmp-3및 ire-1의3개의 가사 유전자의 평균에 대하여 정규화되었다. 각 점은 생물학적 복제를 나타냅니다. 데이터 로그 변환 된 통계 분석을 위해, 그들은 파라메트릭 분석에 필요한 규칙을 충족 하지 않았다. 통계 분석은 Sidak의 다중 비교 테스트를 사용하여 RM-단방향 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. 야생 유형 = N2, hsf-1 = hsf-1 (sy441). 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 발현 패턴은 표준 qPCR과 나노유체 qPCR 시스템 간에 일관되게 수행되었습니다.
(A)sma-3(A), sma-10(B) 또는 dnj-26(C) mRNA의 발현 수준은 야생형 균주(N2)와 dbl-1(nk3) 녹아웃25균제로부터웜-CT를 통해 생성된 3개의 생물학적 복제로부터 일반 qPCR 및 나노유체cPCR(멀티어레이 칩)을 통해 결정되었다. 상대mRNA 발현 수준은 델타 Ct방법(21)을사용하여 각 변형에 대해 결정되었다. 접이식 변화는 Dbl-1(nk3) 웜에서 얻은 발현 수준을 N2 균주에서 상응하는 mRNA 수준으로 나누어 결정하였다. 패널 A에도시된 바와 같이, 패턴은 각 개별 생물학적 복제의 두 방법에 대해 일관되게 되었다. (B)및(C)는 각각 스마-10 및 dnj-26 mRNA 수준에 대해(A)와동일하다. 표적 mRNA 수준은 가사 유전자 CDC-42 및 pmp-3에대하여 정규화되었다. 통계 분석은 표준 qPCR및 나노유체 qPCR을 통해 생성된 3개의 생물학적 복제의 결과를 비교하는 쌍형 t-테스트를 사용하여 각 유전자에 대해 계산되었다. 이러한 비교의 P값은 각각 0.3113, 0.2635, 0.3481s-3,3481, sma-10, dnj-26이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 벌크 샘플이나 단일 웜에서 웜-CT 방법을 사용하면 웜당 정규화될 때 유사한 수준의 식식이 제공되었습니다.
(A) hsp-16.1/11,(B)F44E5.4, 및(C)hsp-70(C12C8.1)의 발현 수준은 25마리의 동물 또는 36명의 단일 개인에 대한 웜 CT를 수행함으로써 열 충격이 없는 상태에서 젊은 성인 동물에서 분석하였다. 웜당 데이터가 정규화되었을 때 두 방법을 모두 사용하여 각 성적증명서에 대해 웜당 얻은 수준 사이에는 큰 차이가 없었습니다. 표적 유전자로부터의 mRNA 수준은 CDC-42, pmp-3 및 ire-1의3개의 가사 유전자의 평균에 대하여 정규화되었다. 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. 통계 = 쌍 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 웜-CT 방법을 사용하는 단일 웜의 고처리량 RT-qPCR은 유전자 발현에서 개인의 간 가변성을 모니터링할 수 있다.
(A)짧은 열 충격(34°C에서 30분)에 노출시 얻어진 53개의 전사체에 대한 평균 발현 수준이다. Boxplots는 개별 웜에서 평균 mRNA 발현의 분포를 나타냅니다(개별 웜당 평균 3개의 기술 복제가 사용되었습니다). 점은 28개의 개별 웜에서 발현 수준을 나타냅니다. 표적 유전자로부터의 mRNA 수준은 CDC-42, pmp-3 및 ire-1의3개의 가사 유전자의 평균에 대하여 정규화되었다. (b)짧은 열 충격에 노출된 후 53개의 전사체에 대한 평균 mRNA 발현의 함수로서변형(26)의 계수는 28마리의 개별 동물(패널 B에도시된 원시 데이터)으로부터 계산되었다. 성적증명서 세트에는 가변 nlp-29 성적증명서(27)와 2개의 안정적인성적증명서(ife-1 및 Y45F10D.4;미공개 데이터)가 포함됩니다. CV는 표준 편차의 평균 편차 비율입니다. 이 이력서는 개별 웜 간의 성적증명서 표현에서 개인 간 가변성을 추정하는 데 활용되었습니다. 예상대로, 개별 간 가변성은 평균 식 수준이 감소하여 확장되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 나노유체 칩을 사용하여 유전자 발현의 개별 간 가변성을 분석할 때 기술적 복제가 필요하지 않았습니다.
이 그래프에 제시된 데이터는 짧은 열 충격(34°C에서 30분)에 따라 28개의 개별 웜에서 수득되었다. 각 적색점은 28개의 개별 벌레(bio CV) 사이에서 분석된 1개의 성적증명서에 대한 평균 성적증명서 발현 수준의 변형(CV)의 계수를 나타낸다. 각 파란색 점은 분석된 성적증명서당 단일 웜에서 얻은 세 가지 기술 복제 사이의 발현 수준의 CV를 나타냅니다(기술 이력서). 이 그래프는 기술적 가변성(기술적 복제 간)이 생물학적 가변성(개별 웜 사이)보다 훨씬 낮았으며, 단일 웜에서 유전자 발현을 분석할 때 나노유체 유전자 발현 어레이에서 기술적 복제를 수행할 필요가 없음을 시사하며, 이는 단일 세포 연구14,15,28과유사하게. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 다중 어레이 칩에 대한 레이아웃을 계획합니다. 위의 표는 다중 어레이 칩 실행을 계획할 때 활용할 수 있는 간단한 레이아웃을 보여 주어 있습니다. 왼쪽에는 관심있는 프라이머 대상으로 채워야하는 공간과 오른쪽에관심샘플로 채워야하는 공간이 있습니다. 각 분석기와 샘플 어레이는 칩을 통해 숫자로 결합됩니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 단일 배열 칩에 대한 레이아웃을 계획합니다. 위의 표는 단일 어레이 칩 실행을 계획할 때 활용할 수 있는 간단한 레이아웃을 보여 주어 있습니다. 왼쪽에는 관심있는 프라이머 대상으로 채워야하는 공간과 오른쪽에관심샘플로 채워야하는 공간이 있습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 이 연구에서 사용되는 RT-qPCR 프라이머 목록입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: RT-qPCR 프라이머의 데이터베이스에서 프라이머. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 논문에서 웜-CT 프로토콜은 단일 웜 또는 작은 웜 풀에서 RNA를 추출하는 신속하고 효율적인 방법으로 나타났다. 나노유체 시스템에서 제공하는 높은 처리량은 개별 간 가변성 측정을 정량화하는 데 이상적입니다. 더욱이, 이 방법의 고감도는 단일 웜 RNA-seq 기술을 사용할 때 검출 이하로 떨어지는 낮은 수준에서 발현된 유전자의 검출을허용한다 9.
단일 웜에서 cDNA를 준비하는 방법의 선택을 고려할 때. Ly외. 29는 큐티클 소화를 위해 단백질제 K에 의존하는 프로토콜을 최적화했습니다. 큐티클은 벌레와 단백질Ae K로부터 분자의 분리를 위한 중요한 장애물이다 그것을 깰 효과적인 방법을 제공합니다. 그러나, 단백질 효소 K는 역전사효소를 사용할 수 있으려면 열불활성화되어야 한다. Ly 외는 96°C에 10분 노출을 사용했지만 RNA가 쉽게 분해될 수 있기 때문에 이 프로토콜에서는 이 단계를 피했습니다. 단백질제 K를 사용하는 대신, 반복된 동결 해동 주기가 큐티클을 깨는 데 사용되었습니다. 동결 해동은 웜 당 더 많은 RNA를 분리 할 수 있기 때문에 큐티클을 깨는 효과적인 방법입니다. Ly 외. 이 프로토콜은 벌레 당 총 RNA의 51.75 ng ± 6.74 SEM을 얻는 반면, 벌레 당 추출된 총 RNA는 35 ng인 반면, 이 프로토콜은 35 ng이다. 열 노출을 사전 증폭 단계와 결합한 제거는 표준 프로토콜에 비해 웜 CT의 동적 검출 범위를 넓혀주임이 분명합니다. Ly 외. 보고 절대 Ct 값 21.1 ± 0.15 hsp-16.2 및 22.8 ± 0.17 에 대한 hsp-70 열 충격 후. 동일한 열 충격 조건(30°C에서 1h)을 사용하여 이 프로토콜은 hsp-16.2 및 hsp-70의경우 0.57± 0 ±.57의 절대 Ct 값을 얻습니다. 이는 동결 해동 용해 방법이 RNA의 높은 수율을 제공하고 낮은 발현 된 성적 증명서에 더 적합하다는 것을 나타냅니다.
나노유체 시스템은 주어진 표적 전사체 집합과 더 작은(다배열 칩) 또는 더 큰(단일 어레이 칩) 샘플 수를 조사하여 실험의 스케일에 적응할 수 있도록 하는 데 이상적입니다. 단일 웜에서 발현된 모든 녹취록의 편견없는 그림을 얻으려면 RNA 시퀀싱을 사용하는 것이 명백한 선택입니다. 그러나, 실험의 초점이 더 작지만 여전히 상대적으로 큰 표적 유전자 집합인 경우, 연구원이 나노 유체 PCR 기계에 접근할 수 있다면 이 프로토콜을 활용하는 것이 더 비용 효율적입니다. 나노 유체 시스템 시약 및 단일 어레이 칩의 비용은 웜 당 약 £ 13로 추정되지만 단일 웜 시퀀싱시 시약 비용은 시퀀싱 비용을 포함하지 않는 웜 당 약 £ 60입니다.
어떤 PCR 플랫폼을 사용할지 고려할 때 나노유체 qPCR에 결합된 웜-CT 방법은 시간 및 처리량에 관한 이점을 제공합니다. 9,216RT-qPCR 결과를 약 2일 동안 얻을 수 있는 반면, 표준 qPCR 플랫폼을 사용하여 동일한 수의 표적을 증폭하면 하루에 4개의 플레이트를 가동하는 96개의 웰 플레이트 를 사용하여 약 5주가 소요된다. 그러나 테스트대상 수가 더 작으면 표준 qPCR 기계와 함께 웜-CT를 사용하는 것이 더 비용 효율적입니다. 단일 어레이 칩은 다시 실행할 수 없으므로 빈 우물을 실행하면 비용 효율성이 저하됩니다.
방법의 한 가지 제한은 멀티플렉싱 단계 동안 프라이머 프라이머 디머의 잠재적 인 형성이지만, 이것은 케이스의 1 % 미만에서 발생합니다. 웜-CT 프로토콜은 효율적이며 단일 웜에 적용할 때 신뢰할 수 있는 결과를 제공하지만, 수확 단계에서 벌레가 캡이나 튜브 의 상단에 갇혀 있는 경우와 일치하는 약 5%의 실패율이 있습니다.
이 다재다능하고 신뢰할 수 있는 방법은 보다 표준 기술에 비해 처리량과 감도를 증가시면 됩니다. 이 방법은 고처리량 스크린의 검증에 매우 유용할 수 있으며 단일 웜 유전자 발현 수준을 모니터링하거나 검증하는 데 탁월한 선택입니다. 이 방법은 격리된 조직에서 유전자 발현의 양과 같은 그밖 도전적인 기술에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 창자, 생식공 또는 FAC에 의해 분리된 세포와 같은 전체 조직의 격리는 RNA 시퀀싱 실험을 수행하기에 충분한 물질을 제공합니다. 그러나 제한된 양의 재료는 종종 중복 된 읽기로 이어지며 희귀 한 성적 증명서의 양을 배제합니다. 이 시나리오에서는 나노유체제 기반 기술을 사용하여 실험에 대한 민감도를 높이고 연구원이 해당 조직 이나 세포에 있는 모든 성적증명서의 하위 집합만 모니터링해야 하는 경우 비용 효율성을 높여야 합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
샬린 머독과 브라이브 연구소 시설에 감사드립니다. JLP는 웰컴 트러스트(093970/Z/10/Z)에 의해 지원되었으며 OC는 ERC 638426 및 BBSRC [BBS/E/B000C0426]에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100µM stock primers for genes of interest. | |||
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | for 96.96 chip (Single-Array Chip) |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | 100-7611 | |
| 384 well plates | |||
| 8-strip PCR tubes | |||
| 96 well ice block | |||
| 96 well plates | |||
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M-96.96 | Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip" |
| 96-well sealing tape | |||
| BioMark & EP1 Software | Fluidigm | 101-6793 | Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software |
| BioMark or BioMark HD system | Fluidigm | 100-2451 K1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler" |
| Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs | Fluidigm | 89000021 | Referenced throughout manuscript as "control line fluid" |
| DNA Suspension buffer | TEKnova | T0021 | |
| domed PCR caps | |||
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293L | |
| Exonuclease I reaction buffer | New England BioLabs | B0293S | |
| FLEXsix DELTAgene Sample Reagent | Fluidigm | 100-7673 | referenced throughout manuscript as "sample reagent" |
| FLEXsix Gene Expression IFC | Fluidigm | 100-6308 | referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip" |
| Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide | Fluidigm | 68000088 | This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript. |
| IFC Controller MX | Fluidigm | 68000112 I1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine" |
| IFC Controllers SOFTWEAR | Fluidigm | 100-2297 | Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX |
| liquid nitrogen in dewar | |||
| Microcentrifuge | StarLab | C1301B-230V | Used to spin down PCR tube strips in the protocol. |
| Nuclease Free Water | |||
| plate spinner | Labnet | K4050725 | mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner" |
| Power SYBR Green Cells-to-Ct kit | invitrogen | 4402955 | This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions. |
| PreAmp Master Mix | Fluidigm | 100-5580, 100-5581 | |
| Reverse Transcription Master Mix—480 reactions | Fluidigm | 100-6299 | One tube also available for 96 reactions (PN100-6298) |
| Rnase Free water | |||
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad Laboratories | 172-5211 | referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix" |
| Standard 96 and 384-well Thermal Cycler | |||
| TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA | TEKnova | T0224 | Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000031 | Referenced throughout the text as "thermal mixer" |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform" |
| Warm water bath |
References
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).
- Semrau, S., van Oudenaarden, A. Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools. Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).
- Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science. 358 (6359), 69-75 (2017).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).
- Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , Edited by The C. elegans Research Community (2015).
- Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
- Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).
- Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
- Serra, L., et al. Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq. Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).
- Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).
- Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).
- Ståhlberg, A., Kubista, M. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).
- Livak, K. J., et al. Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells. Methods. 59 (1), 71-79 (2013).
- Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide. , https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/fluidigm%3Afile (2018).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- U. S. National Library of Reference. Primer Blast. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (2020).
- Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).
- Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).
- Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Jr Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).
- Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).
- Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
- Zhang, X., Zhang, Y. Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).
- Sørensen, J. B. The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research. Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).
- Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).
