Summary
In questo protocollo, le nanoparticelle d'oro modificate AS1411-g-PEI-g-PEG caricate con doxorubicina vengono sintetizzati tramite reazioni di ammide in tre step. Quindi, la doxorubicina viene caricata e consegnata alle cellule tumorali bersaglio per la terapia del cancro.
Abstract
A causa della resistenza ai farmaci e della tossicità nelle cellule sane, l'uso di doxorubicina (DOX) è stato limitato nella terapia clinica del cancro. Questo protocollo descrive la progettazione di poli(etilenimina) innestate con polietilene glicole (PEI-g-PEG) copolimero funzionalizzato nanoparticelle d'oro (AuNPs) con aptamero caricato (AS1411) e DOX attraverso reazioni ammide. AS1411 è specificamente legato con recettori mirati della nucleolina sulle cellule tumorali in modo che il DOX si ritrae contro le cellule tumorali anziché le cellule sane. In primo luogo, PEG viene carbossilato, quindi innestato in PEI ramificata per ottenere un copolimero PEI-g-PEG, che è confermato dall'analisi NMR 1H. Successivamente, vengono sintetizzati nanoparticelle d'oro rivestite di copolimero PEI-g-PEG@AuNPs) e DOX e AS1411 sono covalentemente legati agli AuNP gradualmente attraverso reazioni ammide. Il diametro dell'AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs preparato è di ~39,9 nm, con un potenziale zeta di -29,3 mV, indicando che le nanoparticelle sono stabili in acqua e mezzo cellulare. I test di citotossicità cellulare mostrano che gli AuNP caricati da DOX di nuova progettatezza sono in grado di uccidere le cellule tumorali (A549). Questa sintesi dimostra la delicata disposizione di copolimeri, aptameri e DOX PEI-g-PEG sugli AuRP che si ottengono con reazioni sequenziali di ammide. Tali ADUL funzionalizzati aptamer-PEI-g-PEG forniscono una piattaforma promettente per la somministrazione mirata di farmaci in terapia oncologica.
Introduction
Essendo il principale problema di salute pubblica in tutto il mondo, il cancro è ampiamente caratterizzato come avente un basso tasso di cura, un alto tasso di recidiva e un alto tassodi mortalità 1,2. Gli attuali metodi anti-cancro convenzionali includono chirurgia, chemioterapia e radioterapia3, tra cui la chemioterapia è il trattamento primario per i pazienti oncologici nella clinica4. I farmaci antitumorali usati clinicamente includono principalmente paclitaxel (PTX)5 e doxorubicina (DOX)6,7. Dox, un farmaco antineoplastico, è stato ampiamente applicato nella chemioterapia clinica, a causa dei vantaggi della citotossicità del cancro e dell'inibizione della proliferazione delle celluletumorali 8,9. Tuttavia, DOX causa cardiotossicità 10,11e la breve emiprotezione di DOX ne limita l'applicazione nella clinica12. Pertanto, i portatori di farmaci degradabili sono necessari per caricare DOX e rilasciare in modo sottoequente in modo controllato in un'area mirata.
Le nanoparticelle sono state ampiamente utilizzate in sistemi mirati di somministrazione di farmaci e hanno diversi vantaggi nel trattamento del cancro (ad esempio, rapporto superficie/volume bilmente ridotto, piccole dimensioni, capacità di incapsulare vari farmaci e chimica delle superfici tonnibili, ecc.) 13,14,15. In particolare, le nanoparticelle d'oro (AuNPs) sono state ampiamente utilizzate in applicazioni biologiche e biomediche, come la terapia del cancro fototermico16,17. Le proprietà uniche degli AuNP, come la facile sintesi e la funzionalizzazione generale della superficie, hanno ottime prospettive nel campo clinico della terapia del cancro18. Inoltre, gli AuNP sono stati utilizzati per identificare le strategie di somministrazione dei farmaci, diagnosticare i tumori e superare la resistenza inmolti studi 19,20.
Nonostante ciò, gli AuRP devono essere ulteriormente personalizzati per superare la resistenza ai farmaci attraverso un elevato rilascio locale di lesioni tumorali attraverso una maggiore permeazione e ritenzione (EPR), come le proprietà di targeting e accessibilità. Gli AuRP funzionalizzati polimerici hanno mostrato vantaggi unici, come una migliore solubilità in acqua dei farmaci anticancro idrofobici e un tempo di circolazioneprolungato 21,22. Vari polimeri biocompatibili sono stati utilizzati per rivestimenti AuNP, come polietilene glicole (PEG), polietileneimina (PEI), acido ialuronico, eparina e gomma di xantano. Quindi la stabilità, così come il carico utile, degli AuNP è migliorata ben23. In particolare, pei è un polimero altamente ramificato composto da molte unità ripetute di ammine primarie, secondarie e terziarie24. PEI ha un'eccellente solubilità, bassa viscosità e un alto grado di funzionalità, adatto per il rivestimento su AuNPs.
D'altra parte, i farmaci anti-cancro devono essere consegnati alle cellule tumorali direttamente con una migliore efficienza di carico e con una minore tossicità per il trattamento dei tumori metastatici primari eavanzati 25. I ligandi mirati hanno un grande potenziale per i sistemi di somministrazione mirati ai farmaci anti-cancro26. La sua selettività per il legame con molecole bersaglio conferisce un farmaco anti-cancro mirato alla specificità e aumenta l'arricchimento dei farmaci nei tessutimalati 27. Altri ligandi includono anticorpi, polipeptidi e piccole molecole. Rispetto ad altri ligandi, gli aptameri di acido nucleico possono essere sintetizzati in vitro e sono facili da modificare. AS1411 è un oligonucleotide fosfodiestere da 26 bp non modificato che forma una struttura G-tetramero dimerica stabile per legarsi specificamente a un recettore delle proteine nucleari bersaglio sovraespressosulle cellule tumorali 28,29,30. AS1411 inibisce la proliferazione di molte cellule tumorali ma non influisce sulla crescita delle cellulesane 31,32. Di conseguenza, AS1411 è stato utilizzato per fabbricare un sistema di somministrazione di farmaci mirato ideale.
In questo studio, un copolimero PEI-g-PEG viene sintetizzato attraverso una reazione ammide, quindi vengono fabbricate nanoparticelle d'oro rivestite di copolimero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs). Inoltre, DOX e AS1411 sono collegati in sequenza al pei-g-PEG@AuNPs preparato, come illustrato nella figura 1. Questo protocollo dettagliato ha lo scopo di aiutare i ricercatori a evitare molte delle insidie comuni associate alla fabbricazione di nuovi PEI-g-PEG@AuNPs caricati con DOX e AS1411.
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Protocol
ATTENZIONE: Assicurarsi di consultare tutte le schede di dati di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima di utilizzare tutte le sostanze chimiche. Molte delle sostanze chimiche utilizzate per preparare copolimeri e nanoparticelle sono acutamente tossiche. Anche le nanoparticelle hanno potenziali pericoli. Assicurati di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate e i dispositivi di protezione individuale, tra cui guanti, camice da laboratorio, cappucci, pantaloni a figura intera e scarpe a punta stretta.
1. Sintesi del polietilene glicole polietilenilene doppio-carbossile (CT-PEG)33
- Aggiungere 1,46 g (14,6 mmol) di anidride succinica (SA) e 209 mg (1,71 mmol) di 4-dimetilaminopiridina (DMAP) in un pallone inferiore rotondo da 100 ml.
- Aggiungere 15 ml di tetraidrofurano anidrofurano (THF) al pallone utilizzato nel passaggio 1.1 e montare un tappo di vetro. Mantenere il pallone a 0 °C per 30 minuti.
- Aggiungere 4,28 g (4,28 mmol) di polietilene glicole (PEG) e 1,8 ml (12,8 mmol) di trietilammina (TEA) in un nuovo pallone.
- Aggiungere 15 ml di THF anidro al pallone utilizzato nel passaggio 1.3 e montare un tappo di vetro. Trasferire lentamente la soluzione nel pallone utilizzato nel passaggio 1.2, utilizzando una siringa in atmosfera di azoto.
- Mescolare la soluzione a 0 °C per 2 ore, quindi continuare la reazione a temperatura ambiente (RT) durante la notte.
- Utilizzando un evaporatore rotante (40 °C, 0,1 MPa), concentrare la soluzione di reazione e rimuovere il solvente THF.
- A RT sciogliere la soluzione di reazione dal passaggio 1.6 in 15 mL di 1.325 g/mL diclorometano (DCM), quindi aggiungere 15 mL di etere dietile freddo (Et2O) per ottenere il prodotto di precipitazione (polietilene glicole diacid). Rimuovere il solvente tramite carta da filtro.
NOTA: La fase di precipitazione può essere ripetuta 3x. - Asciugare i precipitati sotto vuoto a RT per 48 ore.
2. Sintesi del copolimero PEI-g-PEG
- Aggiungere 305,47 mg di CT-PEG dai gradini 1.8 e 5 mL di solfossido di dimetile (DMSO) a un pallone e mescolare a RT per assicurarsi che CT-PEG sia completamente sciolto in DMSO.
- Sciogliere 49,46 mg di cloridrato di 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimide (EDC) in 5 ml di DMSO, quindi aggiungere la soluzione al pallone utilizzato nel passaggio 2.1 e mescolare per 30 minuti a RT.
- Sciogliere 29,69 mg di N-idrossisuccinimide (NHS) in 5 ml di DMSO e aggiungere la soluzione al pallone utilizzato nel passaggio 2.1. Continuare a mescolare a RT per 3 h.
- Sciogliere 28,6 μL di polietileneimina (PEI) in 10 ml di DMSO e aggiungere la soluzione per goccia al pallone utilizzato nel passaggio 2.1. Mescolare per almeno 3 giorni.
- Trasferire la soluzione reagì dal passaggio 2.4 a un sacchetto di dialisi (1.000 tagli di peso molecolare [MWCO]). Posizionare il sacchetto di dialisi in un becher da 1 L con 500 mL di acqua ultrapura come dialisi. Cambiare l'acqua ultrapura ogni 12 ore per 3 giorni.
- Trasferire la soluzione nel passaggio 2.5 in un altro sacchetto di dialisi (10.000 MWCO). Posizionare il sacchetto di dialisi in un becher da 1 L con 500 mL di acqua ultrapura come dialisi. Cambiare l'acqua ultrapura ogni 12 ore per 3 giorni.
- Concentrare la soluzione dal passaggio 2.6 utilizzando un evaporatore rotante (40 °C, 0,1 MPa) e congelare il campione per ottenere la polvere PEI-g-PEG.
3. Sintesi di PEI-g-PEG@AuNPs
- Sciogliere 5 mg di PEI-g-PEG preparato (fase 2.7) in 5 ml di acqua ultrapura in un nuovo pallone e montare con un tappo di vetro.
- Aggiungere 100 mL di soluzione HAuCl4 da 0,3 mM al pallone e mescolare la soluzione per 3 ore a RT.
NOTA: Il colore della soluzione deve cambiare immediatamente dal giallo all'arancione. - Aggiungere 1 ml di soluzione NaBH4 mg/mL al pallone e mescolare la soluzione per 3 ore a RT.
NOTA: La soluzione di reazione dovrebbe girare istantaneamente bordeaux. - Dializzare il prodotto di reazione utilizzando un sacchetto di dialisi (1.000 MWCO) per 3 giorni come descritto al passaggio 2.5 per ottenere la soluzione PEI-g-PEG@AuNPs.
4. Sintesi di DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
- Aggiungere 1 ml di soluzione DOX da 2,2 mg/mL e 20 ml di soluzione PEI-g-PEG@AuNPs in un nuovo pallone e montare con un tappo di vetro.
- Sciogliere 0,727 mg di EDC in 1 ml di acqua ultrapura e aggiungere la soluzione EDC al pallone utilizzato nel passaggio 4.1.
- Sciogliere 0,437 mg di NHS in 1 mL di acqua ultrapura. Aggiungere la soluzione NHS al pallone e mescolare a RT per 1 h.
- Dializzare il prodotto di reazione utilizzando un sacchetto di dialisi (1.000 MWCO) per 3 giorni come descritto al passaggio 2.5 per ottenere la soluzione DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
5. Sintesi di AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
- Aggiungere 20 mL di soluzione DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e 4OD di AS1411 (OD = densità ottica; 1OD ≈ 33 μg) a un nuovo pallone.
- Sciogliere 28,76 mg di EDC in 1 ml di acqua ultrapura e aggiungere la soluzione EDC al pallone utilizzato nel passaggio 5.1.
- Sciogliere 17,27 mg di NHS in 1 mL di acqua ultrapura. Aggiungere la soluzione NHS al pallone utilizzato nel passaggio 5.1 e mescolare la reazione per 1 h a RT.
- Dializzare il prodotto di reazione utilizzando un sacchetto di dialisi (1.000 MWCO) per 3 giorni come descritto al passaggio 2.5 per ottenere AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
6. Caratterizzazione del campione
- Sciogliere il polimero CT-PEG (fase 1.8) e il copolimero PEI-g-PEG (fase 2.7) rispettivamente in cloroformio-d nei tubi di risonanza magnetica nucleare (NMR). Analizzare i campioni utilizzando uno spettrometro NMR a 600 MHz dotato di un magnete superconduttore da 14,09 T e di una sonda ad alta risoluzione a banda larga a banda larga 5,0 mm 600 MHz per confermare la strutturachimica 34.
- Disperdere AuNPs, DOX e AS1411 e preparare PEI-g-PEG@AuNPs (passaggio 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (passaggio 4.4) e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (passaggio 5.4), rispettivamente in acqua ultrapura. Quindi, trasferire alle cuvette e registrare gli spettri visibili agli ultravioletti (UV-vis) utilizzando uno spettrofotometro UV-vis.
- Attaccare un adesivo a doppia faccia (~2 mm x 2 mm) alla lamina di alluminio e immergere la soluzione del campione (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) sull'intero nastro in modo uniforme. Analizzare i campioni utilizzando un analizzatore di spettroscopia fotoelettronica a raggi X.
- Disperdere le soluzioni PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, rispettivamente in acqua ultrapura. Quindi, trasferire alle cuvette e valutare la distribuzione delle dimensioni utilizzando lo scattering dinamico della luce.
- Disperdere le soluzioni PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in acqua ultrapura (una goccia di campione per 5 mL di acqua ultrapura per ogni campione). Sonicare per 2 h. Immergere la griglia di rame in soluzioni campione e asciugare sotto una lampada a infrarossi. Caratterizzare la morfologia usando un microscopio elettronico a trasmissione.
- Iniettare 1 mg di AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in una cassetta di dialisi MWCO da 20 kDa, quindi mettere in 80 mL di saline tamponate di fosfato (PBS) con albumina di siero bovino al 5% (BSA). Mescolare a 37 °C.
- Nei punti di tempo predeterminati, raccogliere aliquote 100 μL e sostituire con PBS fresco. Utilizzare uno spettrofotometro UV-vis per misurare l'intensità di fluorescenza DOX delle aliquote.
7. Test CCK-8 delle nanoparticelle di AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
- Coltivare cellule A549 nel mezzo dell'Aquila modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina in un'atmosfera umidificata del 95% di aria e del 5% di CO2 a 37 °C. Sostituire il mezzo di coltura ogni 2 giorni. Utilizzare cellule al passaggio 5 per la proliferazione cellulare e test di citotossicità per valutare quantitativamente la citotossicità delle nanoparticelle AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs preparate.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di nanoparticelle in ogni pozzo contenente 1 mL di mezzo cellulare. Dopo aver coltivato per 24 ore e 48 ore, rimuovere i mezzi di coltura dalle piastre di coltura cellulare, quindi aggiungere immediatamente 300 μL di mezzi di coltura freschi e 30 μL di soluzioni di kit di conteggio cellulare-8 (CCK-8) immediatamente ad ogni pozzo. Incubare per 4 ore in un incubatore di CO2 a 37 °C.
- Trasferire 200 μL di soluzioni di reazione dal passo 7.2 in una piastra di pozzo 96. Leggere la densità ottica (OD) di ogni pozzo a 570 nm con un lettore di micropiatte.
- Osservare la morfologia delle cellule a 24 ore e 48 ore al microscopio.
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Representative Results
1 ) La commissione per la La spettroscopia H NMR è stata utilizzata per confermare la sintesi riuscita del polimero CT-PEG e dei copolimeri PEI-g-PEG (Figura 2). La figura 2a mostra che il segnale protonico di metilene a δ = 3,61 ppm e il segnale protonico carbossile a δ = 2,57 ppm confermano la sintesi riuscita dei polimeri CT-PEG. La figura 2b mostra che il segnale protonico di metilene di PEG a δ = 2,6 ppm e il segnale protonico di PEI a δ = 1,66 ppm confermano la sintesi dei copolimeri PEI-g-PEG.
La spettroscopia UV-vis è stata condotta per determinare la corretta funzionalizzazione del copolimero preparato sugli AuNP (Figura 3). Negli spettri UV-vis, la presenza delle bande a ~523 nm, 507 nm e 260 nm corrisponde ai picchi di risonanza plasmonica superficiale (SPR) rispettivamente di AuNPs, DOX e AS1411 (Figura 3a). Le bande a ~360 nm nello spettro UV-vis di PEI-g-PEG@AuNPs, ~532 nm nello spettro UV-vis di DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e ~546 nm nello spettro UV-vis di AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs confermano la sintesi di successo dei copolimeri PEI-g-PEG attaccati agli AuNP. Essi confermano inoltre che DOX e AS1411 sono stati caricati gradualmente su AuNP funzionalizzati (Figura 3b).
La spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) è stata utilizzata per studiare il legame chimico del copolimero sugli AuNP (Figura 4). Lo spettro XPS dei picchi PEI-g-PEG@AuNPs mostrava picchi C1, O1, N1 e Au4f indicava la connessione tra AuNP e copolimero PEI-g-PEG (Figura 4a). C'è stato un leggero cambiamento nello spettro XPS di DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, poiché DOX è stato ulteriormente innestato su PEI-g-PEG@AuNPs (Figura 4b). Inoltre, l'aspetto del picco P2p per AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs è dovuto principalmente al successo dell'innesto di AS1411 su DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(Figura 4c). La distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle preparate è stata analizzata utilizzando DLS (Figura 5). Rispetto al PEI-g-PEG@AuNPs, il diametro medio di idratazione è leggermente aumentato in DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e ulteriormente aumentato una volta che l'AS1411 è stato innestato.
Il TEM è stato utilizzato per determinare la morfologia delle nanoparticelle, e le immagini hanno mostrato che tutte le nanoparticelle erano uniformi senza aggregazione (Figura 6). A causa delle interazioni tra copolimeri sulla superficie degli AuNP, la distanza degli AuNP aumentò gradualmente. È stato utilizzato un test di vitalità cellulare per determinare la proprietà di destinazione del sistema di erogazione DOX preparato (Figura 7 e Figura 8). I risultati del CCK-8 (Figura 7) hanno mostrato che 1) il numero di cellule A549 è diminuito dopo la coltivazione con AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs nel tempo e 2) il numero di cellule è diminuito con l'aumento della concentrazione di nanoparticelle. Rispetto al gruppo DOX libero, il numero di cellule è aumentato, indicando che la tossicità è stata ridotta.
Insieme alle immagini di microscopia ottica (Figura 8), i risultati mostrano che il numero di cellule è diminuito dopo la ristrutturazione con AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (Figura 8a−d) rispetto al gruppo di controllo senza aggiungere nanoparticelle (Figura 8e,f). Inoltre, è stato studiato il profilo di rilascio DOX del preparato AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in PBS(Figura 9). I risultati mostrano che il rilascio prolungato di DOX da nanoparticelle funzionalizzate causò la diminuzione delle cellule A549, e il rilascio cumulativo di DOX fu di circa il 63,5% ± 3,2% a 72 ore.
Figura 1: Illustrazione schematica della sintesi di PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: 1H Spettri NMR di (a) polimero CT-PEG sintetizzato e (b) pei-g-PEG copolimero. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Spettri UV-vis di (a) AuNPs, DOX e AS1411 e (b) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Spettri XPS di (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Distribuzione delle dimensioni di PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm = diametro medio della nanoparticella. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagini TEM di (a) PEI-g-PEG@AuNPs, b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
Barre di scala = 50 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Valori di densità ottica a 570 nm (OD570) di cellule A549 dopo la ristrutturazione con AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 μg/mL e 110 μg/mL) rispettivamente per 24 h e 48 h.
Le cellule con DOX libero e cellule senza aggiungere nanoparticelle sono incluse come gruppi di controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immagini microscopiche ottiche di cellule A549 dopo la ristrutturazione con AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs a 220 μg/mL (a,b) e 110 μg/ml (c,d), o la 15a zione senza aggiungere nanoparticelle come gruppo di controllo (e,f) a 24 h (pannelli inferiori) e 48 h (pannelli inferiori). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Profilo di rilascio di DOX da AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in PBS per 72 h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo spettro 1H NMR (Figura 2) conferma la sintesi riuscita del copolimero CT-PEG e del copolimero PEI-g-PEG. I pesi molecolari di PEG e PEI erano rispettivamente 1.000 e 1.200. Inoltre, il sistema catalitico EDC/NHS è stato utilizzato per sintetizzare il copolimero PEI-g-PEG attraverso reazioni di ammide. Va notato che se i pesi molecolari di PEG e PEI sono cambiati per sintetizzare il copolimero PEI-g-PEG, allora il tempo di reazione e il sistema catalitico devono essere rivalutati. Inoltre, la condizione di reazione per il rivestimento in copolimero PEI-g-PEG sugli AuNP deve essere ulteriormente regolata, principalmente perché il peso della molecola e la struttura del copolimero PEG-g-PEI possono influenzare l'efficienza del rivestimento e il diametro degli AuNP. Successivamente, anche la morfologia degli AuRP funzionalizzati al copolimero può essere modificata. Il numero di ammino gruppi del polimero PEI può influenzare la struttura della sintesi finale del copolimero PEI-g-PEG, e l'azione di collegamento incrociato tra PEI e CT-PEG si verificherà inevitabilmente. Pertanto, il passaggio 2.4 deve essere eseguito con attenzione e la soluzione PEI deve essere aggiunta lentamente drop-by-drop. Dopo la reazione di sintesi, la dialisi (fasi 2.5 e 2.6) deve essere utilizzata per rimuovere il copolimero reticolato e i polimeri non reazionati.
Inoltre, DOX e AS1411 sono funzionalizzati in sequenza su PEI-g-PEG@AuNPs tramite reazioni ammide, e viene utilizzato il sistema catalitico EDC/NHS. Richiede 3 giorni per ogni reazione (fase 4.3 e fase 5.3) qui; tuttavia, se il tempo di reazione richiede meno di 3 giorni, l'efficienza di funzionalizzazione diminuirà. Quando si richiedono più di 3 giorni, è stato ottenuto lo stesso risultato. Va notato che L'EDC chimico, il SSN e il DOX o l'AS1411 non collegato possono essere rimossi attraverso il trattamento dialitico (fase 4.4 e fase 5.4). Gli spettri UV-vis e XPS sono metodi efficaci per studiare la corretta funzionalizzazione del copolimero sulle nanoparticelle e sono stati ottenuti risultati coerenti (Figura 3 e Figura 4).
Diverse dalle caratteristiche bande UV-vis di AuNPs, DOX e AS1411, picchi unici di PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs sono difficili da osservare, a causa della sovrapposizione di ogni picco. Inoltre, abbiamo eseguito un metodo diverso per fabbricare DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (sintetizzare prima DOX-g-PEI-g-PEG e realizzazione della funzionalizzazione su AuNPs); tuttavia, le nanoparticelle d'oro che utilizzano un tale approccio hanno portato a una bassa efficienza di carico DOX35,36. Pertanto, va notato che il metodo di sintesi di DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in questo lavoro garantirà una sufficiente efficienza di carico DOX e un ulteriore profilo di rilascio. Se un esperimento non tiene conto dell'efficienza di caricamento DOX delle nanoparticelle d'oro, ci sono altri metodi per ottenere AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Questi includono la sintesi di DOX-g-PEI-g-PEG o AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG attraverso una reazione ammide prima, poi la funzionalizzazione su nanoparticelle d'oro. Pertanto, il metodo utilizzato qui e i copolimeri ottenuti possono essere applicati a diverse applicazioni mediche, come l'ingegneria tissutale.
La distribuzione delle dimensioni e la morfologia delle nanoparticelle preparate possono essere studiate da DLS e TEM. I dati DLS (Figura 5) mostrano che le nanoparticelle del diametro di idratazione variano da rivestimenti diversi e per ogni campione appare più di un picco. Per quanto riguarda la struttura di PEI-g-PEG (Figura 1), la curva di distribuzione normale di DLS non è osservata. Va notato che le nanoparticelle sono disperse in acqua ultrapura durante il test DLS, vengono utilizzati diversi rapporti di volume e esistono ancora picchi multi- a causa delle interazioni tra copolimeri sulla superficie delle nanoparticelle. Pertanto, le immagini TEM sono usate per confermare la morfologia delle nanoparticelle. Le immagini TEM di PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs e AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs sono mostrate nella figura 6.
Sulla base di diverse componenti delle superfici delle nanoparticelle d'oro, le distanze tra le nanoparticelle cambiano. Inoltre, le nanoparticelle preparate disperse in acqua sono stabili secondo i potenziali test zeta (da -29 a 50 mV per diverse nanoparticelle dopo i test del tempo). L'ulteriore funzionalizzazione di DOX e AS1411 (sezioni 4 e 5 del protocollo) non influenza il diametro delle nanoparticelle d'oro. Si può concludere che l'UV-vis è un metodo efficace per confermare DOX e AS1411 caricati su nanoparticelle senza utilizzare tutti i metodi di test.
La proprietà mirata sulle cellule tumorali è stata studiata utilizzando cellule A549 coltivate con diverse concentrazioni di AuNP preparati caricati da AS1411 e DOX e senza aggiungere nanoparticelle come gruppo di controllo. Allo stesso tempo, sono stati sperimentati anche gli effetti del DOX libero sulla vitalità cellulare A549(figura 7 e figura 8). Rispetto al gruppo senza aggiungere nanoparticelle, le cellule AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs preparate portano ad una diminuzione delle cellule A549. Tuttavia, mentre la concentrazione di nanoparticelle diminuisce (100 μg/mL), le cellule mostrano una migliore attività a 24 ore rispetto al gruppo DOX libero. Ciò è dovuto principalmente al fatto che il copolimero PEI-g-PEG ha un'eccellente citocompatibilità37 e la tossicità non specifica del polimero PEI ramificato è migliorare.
Infine, a causa della proprietà mirata dell'aptamero AS1411, le nanoparticelle ottenute vengono accumulate nelle cellule tumorali anziché nelle cellule sane. Una volta riconosciuto l'aptamero, il DOX viene rilasciato per uccidere le cellule tumorali. È stato registrato il profilo di rilascio di DOX da AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs in PBS (Figura 9). Questo protocollo dimostra un approccio per la preparazione di aptameri e DOX innestati su AuNP modificati da copolimero attraverso una reazione di ammide in più step. Le nanoparticelle sintetizzata hanno un potenziale per applicazioni di terapia del cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dalla National Natural Science Foundation of China (31700840); il Progetto chiave di ricerca scientifica della provincia di Henan (18B430013, 18A150049). Questa ricerca è stata supportata dal Nanhu Scholars Program for Young Scholars of XYNU. Gli autori vorrebbero ringraziare lo studente di laurea Zebo Qu del College of Life Sciences di XYNU per le sue utili opere. Gli autori vorrebbero riconoscere il Centro analisi & test di XYNU per l'uso delle loro apparecchiature.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
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