Summary
I detta protokoll syntetiseras doxorubicin-laddade AS1411-g-PEI-g-PEG modifierade guldnanopartiklar via trestegs mitt i reaktioner. Sedan laddas doxorubicin och levereras för att rikta in sig på cancerceller för cancerbehandling.
Abstract
På grund av läkemedelsresistens och toxicitet i friska celler har användningen av doxorubicin (DOX) begränsats vid klinisk cancerbehandling. Detta protokoll beskriver utformningen av poly (etylnimin) ympat med polyetylenglykol (PEI-g-PEG) copolymer funktionaliserade guld nanopartiklar (AuNPs) med laddade aptamer (AS1411) och DOX genom amid reaktioner. AS1411 är specifikt bunden med riktade nukleolinreceptorer på cancerceller så att DOX riktar sig mot cancerceller istället för friska celler. Först karboxyleras PEG och ympas sedan till förgrenad PEI för att erhålla en PEI-g-PEG-copolymer, vilket bekräftas av 1H NMR-analys. Därefter syntetiseras PEI-g-PEG-koolymerbelagda guldnanopartiklar (PEI-g-PEG@AuNPs) och DOX och AS1411 binds kovalst till AuNPs gradvis via amidreaktioner. Diametern på den beredda AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs är ~39,9 nm, med en zetapotential på -29,3 mV, vilket indikerar att nanopartiklarna är stabila i vatten och cellmedium. Cellcytotoxicitetsanalyser visar att de nydesignade DOX-laddade AuNPs kan döda cancerceller (A549). Denna syntes visar det känsliga arrangemanget av PEI-g-PEG-copolymers, aptamerer och DOX på AuNPs som uppnås genom sekventiella amidreaktioner. Sådana aptamer-PEI-g-PEG-funktionaliserade AuNPs ger en lovande plattform för riktad läkemedelsleverans vid cancerbehandling.
Introduction
Som det största folkhälsoproblemet över hela världen kännetecknas cancer allmänt av att ha en låg botemedel, hög återfallsfrekvens och högdödlighet 1,2. Nuvarande konventionella anti-cancer metoder inkluderar kirurgi, kemoterapi, och strålbehandling3, bland vilka kemoterapi är den primära behandlingen för cancerpatienter ikliniken 4. Kliniska läkemedel mot cancer omfattar främst paklitaxel (PTX)5 och doxorubicin (DOX)6,7. DOX, ett antineoplastiskt läkemedel, har tillämpats i stor utsträckning i klinisk kemoterapi, på grund av fördelarna med cancercytotoxicitet och hämning av cancercellsproliferation8,9. DOX orsakar dock kardiotoxicitet10,11, och dox korta halveringstid begränsar dess tillämpning påkliniken 12. Därför behövs nedbrytbara läkemedelsbärare för att ladda DOX och underligt släppa ut på ett kontrollerat sätt till ett riktat område.
Nanopartiklar har använts i stor utsträckning i riktade drug delivery-system och har flera fördelar vid cancerbehandling (dvs. betydande yt-till-volym-förhållande, liten storlek, förmåga att kapsla in olika läkemedel och tunable ytkemi, etc.) 13,14,15. I synnerhet har guldnanopartiklar (AuNPs) använts i stor utsträckning i biologiska och biomedicinska tillämpningar, såsom fototermisk cancerbehandling16,17. De unika egenskaperna hos AuNPs, såsom underlättande syntes och allmän ytfunktionalisering, har utmärkta utsikter inom det kliniska området cancerbehandling18. Dessutom har AuNPs använts för att identifiera drug delivery strategier, diagnostisera tumörer, och övervinna resistens i många studier19,20.
Trots detta måste AuNPs skräddarsys ytterligare för att övervinna läkemedelsresistens via hög lokal frisättning vid tumörskador genom förbättrad permeation och retention (EPR), såsom inriktnings- och tillgänglighetsegenskaper. Polymer functionalized AuNPs har uppvisat unika fördelar, såsom förbättrad vattenlöslighet av hydrofobiska cancer läkemedel och förlängdcirkulationstid 21,22. Olika biokompatibla polymerer har använts för AuNP-beläggningar, såsom polyetylenglykol (PEG), polyetylenimin (PEI), hyaluronsyra, heparin och xantangummi. Då förbättras stabiliteten, liksom nyttolasten, hos AuNPs väl23. Specifikt är PEI en mycket förgrenad polymer som består av många upprepande enheter av primära, sekundära och tertiära aminer24. PEI har utmärkt löslighet, låg viskositet och en hög grad av funktionalitet, som är lämplig för beläggning på AuNPs.
Å andra sidan måste anti-cancerläkemedel levereras till cancerceller direkt med förbättrad belastningseffektivitet och med lägre toxicitet för behandling av primära och avancerade metastaserade tumörer25. Riktade ligands har stor potential för anti-cancer läkemedel riktade leveranssystem26. Dess selektivitet för målmolekylbindning ger anti-cancerläkemedel som är inriktade på specificitet och ökar läkemedelsberikningen i sjukavävnader 27. Fler ligands inkluderar antikroppar, polypeptider och små molekyler. Jämfört med andra ligands kan nukleinsyraaptamerer syntetiseras in vitro och är lätta att modifiera. AS1411 är en omodifierad 26 bp fosfodiester oligonukleotid som bildar en stabil dimeric G-tetramer struktur för att specifikt binda till ett överuttryckt mål nukleär protein receptor på cancerceller28,29,30. AS1411 hämmar spridningen av många cancerceller men påverkar inte tillväxten av friska celler31,32. Som ett resultat har AS1411 använts för att tillverka ett idealiskt riktat drug delivery-system.
I denna studie syntetiseras en PEI-g-PEG-copolymer via en amidreaktion, sedan är PEI-g-PEG copolymerbelagda guldnanopartiklar (PEI-g-PEG@AuNPs) tillverkade. Dessutom är DOX och AS1411 sekventiellt kopplade till den beredda PEI-g-PEG@AuNPs, som visas i figur 1. Detta detaljerade protokoll är avsett att hjälpa forskare att undvika många av de vanliga fallgroparna i samband med tillverkning av nya PEI-g-PEG@AuNPs laddade med DOX och AS1411.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
VARNING: Se till att konsultera alla relevanta datablad för materialsäkerhet (MSDS) innan du använder alla kemikalier. Flera av de kemikalier som används för att förbereda koolymerer och nanopartiklar är akut giftiga. Nanopartiklar har också potentiella faror. Se till att använda alla lämpliga säkerhetsrutiner och personlig skyddsutrustning, inklusive handskar, labbrock, huvor, byxor i full längd och närbesläktade skor.
1. Syntes av dubbelkarboxylpolyetylenglykol (CT-PEG)33
- Tillsätt 1,46 g (14,6 mmol) succinic anhydrid (SA) och 209 mg (1,71 mmol) 4-dimetyllaminopyridin (DMAP) till en rund bottenkolv på 100 ml.
- Tillsätt 15 ml vattenfri tetrahydrofuran (THF) till kolven som används i steg 1.1 och montera en glaspropp. Håll kolven på 0 °C i 30 min.
- Tillsätt 4,28 g (4,28 mmol) polyetylenglykol (PEG) och 1,8 ml (12,8 mmol) trietylamin (TEA) till en ny kolv.
- Tillsätt 15 ml vattenfri THF till kolven som används i steg 1.3 och montera en glaspropp. Överför lösningen långsamt till kolven som används i steg 1.2 med en spruta under kväveatmosfären.
- Rör om lösningen vid 0 °C i 2 timmar och fortsätt sedan reaktionen vid rumstemperatur (RT) över natten.
- Koncentrera reaktionslösningen med hjälp av en roterande förångare (40 °C, 0,1 MPa) och ta bort THF-lösningsmedlet.
- Vid RT, lös upp reaktionslösningen från steg 1,6 i 15 ml 1,325 g/ml diklormetan (DCM), tillsätt sedan 15 ml kall dietyleter (Et2O) för att erhålla utfällningsprodukten (polyetylenglykoldiacid). Ta bort lösningsmedlet via filterpapper.
OBS: Nederbördssteget kan upprepas 3x. - Torka fällorna under vakuum vid RT i 48 timmar.
2. Syntes av PEI-g-PEG copolymer
- Tillsätt 305,47 mg CT-PEG från steg 1,8 och 5 ml dimetylsulfoxid (DMSO) till en kolv och rör om vid RT för att säkerställa att CT-PEG är helt upplöst i DMSO.
- Lös upp 49,46 mg 1-(3-dimetyllaminopropyl)-3-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC) i 5 ml DMSO och tillsätt sedan lösningen till kolven som används i steg 2.1 och rör om i 30 minuter vid RT.
- Lös upp 29,69 mg N-hydroxisuccinimid (NHS) i 5 ml DMSO och tillsätt lösningen till kolven som används i steg 2.1. Fortsätt att röra på RT i 3 timmar.
- Lös upp 28,6 μL polyetylenimin (PEI) i 10 ml DMSO och tillsätt lösningen droppevis till kolven som används i steg 2.1. Rör om i minst 3 dagar.
- Överför den reagerade lösningen från steg 2.4 till en dialyspåse (1 000 molekylviktsavskärning [MWCO]). Placera dialyspåsen i en 1 L bägare med 500 ml ultrapurevatten som dialysat. Byt ultrapurvatten var 12: e timme i 3 dagar.
- Överför lösningen i steg 2.5 till en annan dialyspåse (10 000 MWCO). Placera dialyspåsen i en 1 L bägare med 500 ml ultrapurevatten som dialysat. Byt ultrapurvatten var 12: e timme i 3 dagar.
- Koncentrera lösningen från steg 2.6 med en roterande förångare (40 °C, 0,1 MPa) och frystorka provet för att erhålla PEI-g-PEG-pulvret.
3. Syntes av PEI-g-PEG@AuNPs
- Lös upp 5 mg preparerad PEI-g-PEG (steg 2.7) i 5 ml ultrapurvatten i en ny kolv och passa med en glaspropp.
- Tillsätt 100 ml 0,3 m HAuCl4-lösning till kolven och rör om lösningen i 3 timmar på RT.
OBS: Lösningens färg bör omedelbart ändras från gul till orange. - Tillsätt 1 ml 1 mg/ml NaBH4-lösning till kolven och rör om lösningen i 3 timmar på RT.
OBS: Reaktionslösningen ska omedelbart bli vinröd. - Dialysera reaktionsprodukten med en dialyspåse (1 000 MWCO) i 3 dagar enligt beskrivningen i steg 2.5 för att erhålla PEI-g-PEG@AuNPs-lösningen.
4. Syntes av DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
- Tillsätt 1 ml 2,2 mg/ml DOX-lösning och 20 ml PEI-g-PEG@AuNPs-lösning till en ny kolv och passa med en glaspropp.
- Lös upp 0,727 mg EDC i 1 ml ultrapurvatten och tillsätt EDC-lösningen till kolven som används i steg 4.1.
- Lös upp 0,437 mg NHS i 1 ml ultrapurevatten. Tillsätt NHS-lösningen i kolven och rör om vid RT i 1 timme.
- Dialysera reaktionsprodukten med hjälp av en dialyspåse (1 000 MWCO) i 3 dagar enligt beskrivningen i steg 2.5 för att erhålla DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs-lösningen.
5. Syntes av AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
- Tillsätt 20 ml DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs-lösning och 4OD as1411 (OD = optisk densitet; 1OD ≈ 33 μg) till en ny kolv.
- Lös upp 28,76 mg EDC i 1 ml ultrapurvatten och tillsätt EDC-lösningen till kolven som används i steg 5.1.
- Lös upp 17,27 mg NHS i 1 ml ultrapurevatten. Tillsätt NHS-lösningen i kolven som används i steg 5.1 och rör om reaktionen i 1 timme vid RT.
- Dialysera reaktionsprodukten med hjälp av en dialyspåse (1 000 MWCO) i 3 dagar enligt beskrivningen i steg 2.5 för att erhålla AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
6. Exempel karakterisering
- Lös upp CT-PEG-polymeren (steg 1.8) respektive PEI-g-PEG-koolymeren (steg 2.7) i kloroform-d i nmr-rör (Nuclear Magnetic Resonance). Analysera proverna med hjälp av en 600 MHz NMR-spektrometer utrustad med en 14,09 T supraledande magnet och 5,0 mm 600 MHz bredband Z-gradient högupplöst sond för att bekräfta den kemiska strukturen34.
- Sprid AuNPs, DOX och AS1411 och förberedde PEI-g-PEG@AuNPs (steg 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (steg 4.4) respektive AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (steg 5.4), i ultrapurevatten. Överför sedan till cuvettes och spela in ultraviolett synliga (UV-vis) spektra med hjälp av en UV-vis spektrofotometer.
- Fäst ett dubbelsidigt lim (~ 2 mm x 2 mm) på aluminiumfolien och doppa provlösningen (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs och AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs) på hela tejpen jämnt. Analysera proverna med hjälp av en röntgenfotoelektronspektroskopianalysator.
- Sprid PEI-g-PEG@AuNPs-, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs- respektive AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs-lösningar i ultrapurevatten. Överför sedan till cuvettes och utvärdera storleksfördelningen med hjälp av dynamisk ljusspridning.
- Sprid PEI-g-PEG@AuNPs-, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs- och AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs-lösningar i ultrapurvatten (en droppe prov per 5 ml ultrapurevatten för varje prov). Ultraljudsbehandling i 2 h. Doppa kopparnätet i provlösningar och torka under en infraröd lampa. Karakterisera morfologin med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop.
- Injicera 1 mg AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i en 20 kDa MWCO dialyskassett och placera sedan i 80 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 5% bovin serumalbumin (BSA). Rör vid 37 °C.
- Vid de förutbestämda tidspunkterna, samla in 100 μL alikvoter och ersätt med färsk PBS. Använd en UV-vis-spektrofotometer för att mäta ALIKVOTENS DOX fluorescensintensitet.
7. CCK-8-analys av NANOPartiklar av AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
- Odla A549 celler i Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) kompletterat med 10% fetala nötkreatur serum, 100 U/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin under en fuktad atmosfär av 95% luft och 5% CO2 vid 37 °C. Byt ut kulturmediet varannan dag. Använd celler vid passage 5 för cellproliferation och cytotoxicitetsanalyser för att kvantitativt utvärdera cytotoxiciteten hos beredda AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs nanopartiklar.
- Tillsätt 100 μL nanopartikellösning i varje brunn som innehåller 1 ml cellmedium. Efter odling i 24 timmar och 48 timmar, ta bort odlingsmedierna från cellodlingsplattorna och tillsätt sedan 300 μL färska odlingsmedier och 30 μL cellräkningskit-8 (CCK-8) kitlösningar omedelbart till varje brunn. Inkubera i 4 timmar i en CO2-inkubator vid 37 °C.
- Överför 200 μL reaktionslösningar från steg 7,2 till en 96 brunnsplatta. Läs den optiska densiteten (OD) för varje brunn vid 570 nm med en mikroplatta läsare.
- Observera cellernas morfologi vid 24 timmar och 48 timmar under ett mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 (på 1) H NMR-spektroskopi användes för att bekräfta den framgångsrika syntesen av CT-PEG-polymer och PEI-g-PEG-sampolymerer (figur 2). Figur 2a visar att metylprotonsignalen vid δ = 3,61 ppm och kartongylprotonsignalen vid δ = 2,57 ppm bekräftar den framgångsrika syntesen av CT-PEG-polymerer. Figur 2b visar att peg-metylenprotonsignalen vid δ = 2,6 ppm och protonsignalen för PEI vid δ = 1,66 ppm bekräftar syntesen av PEI-g-PEG-kopolymerer.
UV-vis spektroskopi genomfördes för att fastställa den framgångsrika funktionaliseringen av förberedd copolymer på AuNPs (Figur 3). I UV-vis-spektra motsvarar närvaron av banden vid ~523 nm, 507 nm respektive 260 nm ytplasmonsonanstopparna (SPR) för AuNPs, DOX respektive AS1411 (figur 3a). Banden på ~360 nm i UV-vis spektrum av PEI-g-PEG@AuNPs, ~532 nm i UV-vis spektrum av DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, och ~546 nm i UV-vis spektrumet av AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs bekräftar den framgångsrika syntesen av PEI-g-PEG copolymers fäst vid AuNPs. De bekräftar också att DOX och AS1411 laddades på funktionella aunps gradvis(figur 3b).
Röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) användes för att undersöka den kemiska bindningen av copolymer på AuNPs(figur 4). XPS-spektrumet av PEI-g-PEG@AuNPs visade C1-, O1-, N1- och Au4f-toppar indikerade sambandet mellan AuNPs och PEI-g-PEG copolymer (Figur 4a). Det var en liten förändring i XPS-spektrumet av DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, eftersom DOX ymppades ytterligare på PEI-g-PEG@AuNPs (figur 4b). Dessutom berodde utseendet på P2p-toppen för AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs främst på det framgångsrika transplantatet AV AS1411 på DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (figur 4c). Storleksfördelningen av beredda nanopartiklar analyserades med hjälp av DLS (figur 5). Jämfört med PEI-g-PEG@AuNPs ökade den genomsnittliga hydreringsdiametern något i DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs och ökade ytterligare när AS1411 ympades på.
TEM användes för att bestämma nanopartiklarnas morfologi, och bilderna visade att alla nanopartiklar var enhetliga utan aggregering (figur 6). På grund av interaktionerna mellan copolymers på aunps yta ökade avståndet mellan AuNPs gradvis. Ett cellkraftstest användes för att bestämma målegenskapen för det förberedda DOX-leveranssystemet (figur 7 och figur 8). CCK-8-resultaten (figur 7) visade att 1) A549-cellnumret minskade efter odling med AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs över tid och 2) cellnumret minskade med ökad koncentration av nanopartiklar. Jämfört med den fria DOX-gruppen ökade cellnumret, vilket indikerar att toxiciteten minskade.
Tillsammans med optiska mikroskopibilder (figur 8) visar resultaten att cellnumret minskade efter odling med AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (figur 8a−d) jämfört med kontrollgruppen utan att lägga till nanopartiklar (figur 8e,f). Dessutom undersöktes DOX-frisättningsprofilen från förberedd AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i PBS (figur 9). Resultaten visar att den ihållande frisättningen av DOX från funktionaliserade nanopartiklar orsakade minskningen av A549-celler, och den kumulativa DOX-frisättningen var cirka 63,5% ± 3,2% vid 72 h.
Figur 1: Schematisk illustration av syntesen av PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP och AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: 1H NMR-spektra av a) syntetiserad CT-PEG-polymer och b) PEI-g-PEG-koolymer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: UV-vis-spektra av a) AuNPs, DOX och AS1411 och (b) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs och AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: XPS-spektra av a) PEI-g-PEG@AuNPs, b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs och c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Storleksfördelning av PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs och AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm = nanopartiklarnas genomsnittliga diameter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: TEM-bilder av a) PEI-g-PEG@AuNPs, b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs och c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
Skalstänger = 50 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Optiska densitetsvärden vid 570 nm (OD570)av A549-celler efter odling med AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 μg/ml respektive 110 μg/ml) i 24 timmar respektive 48 timmar.
Celler med gratis DOX och celler utan att tillsätta nanopartiklar ingår som kontrollgrupper. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8: Optiska mikroskopiska bilder av A549-celler efter odling med AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs vid 220 μg/ml (a,b) och 110 μg/ml (c,d) eller odling utan att nanopartiklar tillsätts som kontrollgrupp (t.ex. vid 24 h (övre paneler) och 48 h (bottenpaneler). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 9: Släpp dox-profilen från AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs PBS i 72 timmar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1H NMR-spektrumet (figur 2) bekräftar den framgångsrika syntesen av CT-PEG-koolymer och PEI-g-PEG-koolymer. Molekylvikterna för PEG och PEI var 1 000 respektive 1 200. Dessutom användes EDC/NHS katalytiska systemet för att syntetisera PEI-g-PEG copolymer via amidreaktioner. Det bör noteras att om molekylvikterna för PEG och PEI ändrades för att syntetisera PEI-g-PEG copolymer, måste reaktionstiden och katalyssystemet omvärderas. Reaktionsvillkoret för PEI-g-PEG-koolymerbeläggning på AuNPs måste också justeras ytterligare, främst för att molekylvikten och strukturen hos PEG-g-PEI-koolymer kan påverka aunps beläggningseffektivitet och diameter. Efteråt kan morfologin hos copolymer-funktionaliserade AuNPs också ändras. Antalet aminogrupper från PEI-polymer kan påverka strukturen hos den slutliga PEI-g-PEG-koolymersyntesen, och tvärlänksåtgärden mellan PEI och CT-PEG kommer oundvikligen att uppstå. Steg 2.4 måste därför utföras noggrant, och PEI-lösningen måste långsamt läggas till droppe för droppe. Efter syntesreaktionen måste dialys (steg 2.5 och 2.6) användas för att avlägsna de korslänkade copolymer och oredovisade polymererna.
Dessutom är DOX och AS1411 sekventiellt funktionaliserade på PEI-g-PEG@AuNPs via amidreaktioner, och EDC/ NHS katalytiska systemet används. Det kräver 3 dagar för varje reaktion (steg 4.3 och steg 5.3) här; Men om reaktionstiden kräver mindre än 3 dagar kommer funktionaliseringseffektiviteten att minska. När det krävs mer än 3 dagar har samma resultat erhållits. Det bör noteras att kemisk EDC, NHS och oansluten DOX eller AS1411 kan avlägsnas genom dialysbehandling (steg 4. 4 och steg 5. 4). UV-vis-spektra och XPS är effektiva metoder för att undersöka den framgångsrika funktionaliseringen av koolymer på nanopartiklar, och konsekventa resultat har erhållits (figur 3 och figur 4).
Till skillnad från de karakteristiska UV-vis-banden i AuNPs, DOX och AS1411 är unika toppar av PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs och AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs utmanande att observera, på grund av överlappningen av varje topp. Dessutom har vi utfört en annan metod för att tillverka DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (syntetisera DOX-g-PEI-g-PEG först och utföra funktionalisering på AuNPs); Guldnanopartiklar som använder ett sådant tillvägagångssätt har dock lett till låg DOX-belastningseffektivitet35,36. Det bör därför noteras att metoden för syntes av DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i detta arbete kommer att säkerställa en tillräcklig DOX-belastningseffektivitet samt ytterligare frisättningsprofil. Om man inte tar hänsyn till dox-lasteffektiviteten hos guldnanopartiklar finns det andra metoder för att erhålla AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Dessa inkluderar syntes av DOX-g-PEI-g-PEG eller AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG via en amidreaktion först, sedan funktionalisering på guldnanopartiklar. Således kan den metod som används här samt de erhållna sampolymererna tillämpas på olika medicinska applikationer, såsom vävnadsteknik.
Storleksfördelningen och morfologin hos beredda nanopartiklar kan undersökas av DLS och TEM. DLS-data (figur 5) visar att nanopartiklarna med hydreringsdiameter varierar från olika beläggningar, och mer än en topp visas för varje prov. När det gäller strukturen hos PEI-g-PEG(figur 1)observeras inte DLS normala fördelningskurva. Det bör noteras att nanopartiklarna sprids i ultrapurevatten under DLS-testet, olika volymförhållanden används och multitoppar finns fortfarande, på grund av interaktioner mellan kopolymerer på nanopartiklarnas yta. Således används TEM-bilder för att bekräfta nanopartiklarnas morfologi. TEM-bilder av PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs och AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs visas i figur 6.
Baserat på olika komponenter i ytorna på guldnanopartiklar förändras avstånden mellan nanopartiklar. Dessutom är de beredda nanopartiklarna spridda i vatten stabila enligt zeta potentiella tester (-29 till 50 mV för olika nanopartiklar efter tidstester). Den ytterligare funktionaliseringen av DOX och AS1411 (avsnitten 4 och 5 i protokollet) påverkar inte diametern på guldnanopartiklar. Slutsatsen kan dras att UV-vis är en effektiv metod för att bekräfta DOX och AS1411 laddade på nanopartiklar utan att använda alla testmetoder.
Den riktade egenskapen på cancerceller undersöktes med hjälp av A549-celler odlade med olika koncentrationer av beredda AS1411- och DOX-laddade AuNPs och utan att lägga till nanopartiklar som kontrollgrupp. Samtidigt testades också effekterna av fri DOX på A549-cellens livskraft (figur 7 och figur 8). Jämfört med gruppen utan att lägga till nanopartiklar leder den beredda AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs till en minskning av A549-celler. Medan koncentrationen av nanopartiklar minskar (100 μg/ml) visar cellerna dock bättre aktivitet vid 24 timmar jämfört med den fria DOX-gruppen. Detta beror främst på att PEI-g-PEG copolymer har utmärkt cytokompatibilitet37 och den ospecificerade toxiciteten hos förgrenade PEI-polymeren är smält.
Slutligen, på grund av aptamer AS1411: s riktade egenskap, ackumuleras de erhållna nanopartiklarna i cancerceller istället för friska celler. När aptameren känns igen släpps DOX för att döda cancercellerna. Frisättningsprofilen för DOX från AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs i PBS registrerades (figur 9). Detta protokoll visar en metod för att förbereda aptamers och DOX ympas på copolymer modifierade AuNPs via en multi-step amide reaktion. De syntetiserade nanopartiklarna har potential för cancerbehandlingstillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av National Natural Science Foundation of China (31700840); Det viktigaste vetenskapliga forskningsprojektet i Provinsen Henan (18B430013, 18A150049). Denna forskning stöddes av Nanhu Scholars Program for Young Scholars of XYNU. Författarna vill tacka kandidatstudenten Zebo Qu från College of Life Sciences i XYNU för hans hjälpsamma verk. Författarna vill uppmärksamma Analys & Testcenter i XYNU för användning av deras utrustning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
- Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
- Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
- Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
- Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
- Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
- de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
- Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
- Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
- Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
- Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
- Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
- Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
- Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
- Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
- Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
- Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
- Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
- Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
- Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
- Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
- Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
- Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
- Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
- Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
- Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
- Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
- Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
- Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
- Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).
