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Chemistry

Síntesis De Aptamer-PEI-g-PEG Nanopartículas De Oro Modificadas Cargadas Con Doxorrubicina Para La Administración De Fármacos Dirigidos

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61139
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 3, 3
1College of Life Sciences, Xinyang Normal University, 2Department of Imaging & Pathology, University of Leuven and Oral & Maxillofacial Surgery, University Hospitals Leuven, 3Analysis & Testing Center, Xinyang Normal University

Summary

En este protocolo, las nanopartículas de oro modificadas con doxorrubicina AS1411-g-PEI-g-PEG se sintetizan a través de reacciones de amida de tres pasos. Luego, la doxorrubicina se carga y se administra a las células cancerosas diana para el tratamiento del cáncer.

Abstract

Debido a la resistencia a los medicamentos y a la toxicidad en células sanas, el uso del doxorubicin (DOX) se ha limitado en terapia clínica del cáncer. Este protocolo describe el diseño de poli(etilenimina) injertado con polietilenglicol (PEI-g-PEG) copolímero funcionalizado nanopartículas de oro (AuNPs) con aptámero cargado (AS1411) y DOX a través de reacciones de amida. AS1411 se une específicamente con los receptores de nucleolina dirigidos en las células cancerosas para que DOX se dirija a las células cancerosas en lugar de las células sanas. Primero, la CLAVIJA es carboxylated, después injertada a PEI ramificado para obtener un copolímero de PEI-g-PEG, que es confirmado por el análisis de 1H NMR. A continuación, se sintetizan nanopartículas de oro recubiertas de copolímero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs), y DOX y AS1411 se unen covalentemente a AuNPs gradualmente a través de reacciones de amida. El diámetro del AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs preparado es de ~39,9 nm, con un potencial zeta de -29,3 mV, lo que indica que las nanopartículas son estables en agua y medio celular. Los ensayos de citotoxicidad celular muestran que los AuNPs cargados de DOX de nuevo diseño son capaces de matar las células cancerosas (A549). Esta síntesis demuestra la delicada disposición de los copolímeros PEI-g-PEG, aptámeros y DOX en AuNPs que se logran mediante reacciones secuenciales de amida. Tales AuNPs funcionalizados aptamer-PEI-g-PEG proporcionan una plataforma prometedora para la entrega de la droga apuntada en terapia del cáncer.

Introduction

Siendo el principal problema de salud pública en todo el mundo, el cáncer se caracteriza ampliamente por tener una baja tasa de curación, alta tasa de recurrencia y alta tasa de mortalidad1,2. Los métodos anticancerígenos convencionales actuales incluyen cirugía, quimioterapia y radioterapia3,entre los cuales la quimioterapia es el tratamiento primario para los pacientes con cáncer en la clínica4. Los fármacos contra el cáncer utilizados clínicamente incluyen principalmente paclitaxel (PTX)5 y doxorrubicina (DOX)6,7. Dox, un fármaco antineoplásico, se ha aplicado ampliamente en la quimioterapia clínica, debido a las ventajas de la citotoxicidad del cáncer y la inhibición de la proliferación de células cancerosas8,9. Sin embargo, el DOX causa cardiotoxicidad10,11,y la corta vida media del DOX restringe su aplicación en la clínica12. Por lo tanto, los portadores degradables de la droga son necesarios cargar DOX y subquently liberar de una manera controlada a un área apuntada.

Las nanopartículas se han utilizado ampliamente en sistemas de administración de fármacos dirigidos y tienen varias ventajas en el tratamiento del cáncer (es decir, una relación superficie-volumen considerable, tamaño pequeño, capacidad para encapsular varios fármacos y química de superficie sintonizable, etc.) 13,14,15. En particular, las nanopartículas de oro (AuNPs) se han utilizado ampliamente en aplicaciones biológicas y biomédicas, como la terapia fototérmica contra el cáncer16,17. Las propiedades únicas de los AuNPs, como la síntesis fácil y la funcionalización general de la superficie, tienen excelentes perspectivas en el campo clínico de la terapia contra el cáncer18. Además, los AuNPs se han utilizado para identificar estrategias de administración de fármacos, diagnosticar tumores y superar la resistencia en muchos estudios19,20.

No obstante, los AuNPs necesitan ser adaptados más a fondo para superar resistencia a los medicamentos vía el alto lanzamiento local en las lesiones del tumor con la permeación y la retención aumentadas (EPR), tales como las propiedades de la blanco y de la accesibilidad. Los AuNPs funcionalizados con polímeros han exhibido ventajas únicas, como la mejora de la solubilidad en agua de los fármacos hidrofóbicos contra el cáncer y el tiempo de circulación prolongado21,22. Se han utilizado varios polímeros biocompatibles para recubrimientos de AuNP, como el polietilenglicol (PEG), la polietilenimina (PEI), el ácido hialurónico, la heparina y la goma xantana. Entonces la estabilidad, así como la carga útil, de AuNPs se mejora bien23. Específicamente, pei es un polímero altamente ramificado que se compone de muchas unidades de repetición de aminas primarias, secundarias y terciarias24. PEI tiene una excelente solubilidad, baja viscosidad y un alto grado de funcionalidad, que es adecuado para el recubrimiento en AuNPs.

Por otro lado, los fármacos anticancerígenos deben ser entregados a las células cancerosas directamente con una mejor eficiencia de carga, y con menor toxicidad para el tratamiento de tumores metastásicos primarios y avanzados25. Los ligandos dirigidos tienen un gran potencial para los sistemas de administración dirigidos a fármacos contra el cáncer26. Su selectividad para la unión a moléculas diana confiere especificidad a los fármacos contra el cáncer y aumenta el enriquecimiento de fármacos en tejidos enfermos27. Más ligandos incluyen anticuerpos, polipéptidos y moléculas pequeñas. En comparación con otros ligandos, los aptámeros de ácidos nucleicos se pueden sintetizar in vitro y son fáciles de modificar. AS1411 es un oligonucleótido fosfodiester de 26 pb no modificado que forma una estructura dimérica estable de G-tetrámero para unirse específicamente a un receptor de proteína nuclear objetivo sobreexpresado en las células cancerosas28,29,30. AS1411 inhibe la proliferación de muchas células cancerosas pero no afecta el crecimiento de células sanas31,32. Como resultado, AS1411 se ha utilizado para fabricar un sistema ideal de administración de fármacos dirigidos.

En este estudio, un copolímero PEI-g-PEG se sintetiza a través de una reacción de amida, a continuación, se fabrican nanopartículas de oro recubiertas de copolímero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs). Además, DOX y AS1411 están vinculados secuencialmente a la PEG@AuNPs PEI-g preparada, como se muestra en la Figura 1. Este protocolo detallado está destinado a ayudar a los investigadores a evitar muchos de los escollos comunes asociados con la fabricación de nuevos PEI-g-PEG@AuNPs cargados con DOX y AS1411.

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Protocol

PRECAUCIÓN: Asegúrese de consultar todas las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de usar todos los productos químicos. Varios de los productos químicos utilizados para preparar copolímeros y nanopartículas son agudamente tóxicos. Las nanopartículas también tienen peligros potenciales. Asegúrese de usar todas las prácticas de seguridad y el equipo de protección personal apropiados, incluidos guantes, bata de laboratorio, capuchas, pantalones largos y zapatos de punta cerrada.

1. Síntesis de doble carboxilo polietilenglicol (CT-PEG)33

  1. Añadir 1,46 g (14,6 mmol) de anhídrido succínico (SA) y 209 mg (1,71 mmol) de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) a un matraz inferior redondo de 100 ml.
  2. Añadir 15 ml de tetrahidrofurán anhidro (THF) al matraz utilizado en el paso 1.1 y colocar un tapón de vidrio. Mantenga el matraz a 0 °C durante 30 min.
  3. Añadir 4,28 g (4,28 mmol) de polietilenglicol (PEG) y 1,8 mL (12,8 mmol) de trietilamina (TEA) a un nuevo matraz.
  4. Añadir 15 ml de THF anhidro al matraz utilizado en el paso 1.3 y colocar un tapón de vidrio. Transferir la solución lentamente al matraz utilizado en el paso 1.2, utilizando una jeringa bajo atmósfera nitrogenada.
  5. Revuelva la solución a 0 °C durante 2 h y, a continuación, continúe la reacción a temperatura ambiente (RT) durante la noche.
  6. Con un evaporador rotatorio (40 °C, 0,1 MPa), concentre la solución de reacción y retire el disolvente THF.
  7. En RT, disuelva la solución de reacción a partir de la etapa 1,6 en 15 mL de 1,325 g/mL de diclorometano (DCM), a continuación, añadir 15 mL de éter dietílico frío (Et2O) para obtener el producto de precipitación (polietilenglicol diácido). Retire el disolvente mediante papel de filtro.
    NOTA: El paso de precipitación se puede repetir 3x.
  8. Secar los precipitados al vacío a RT durante 48 h.

2. Síntesis del copolímero PEI-g-PEG

  1. Añadir 305,47 mg de CT-PEG de los pasos 1,8 y 5 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) a un matraz y remover en RT para asegurarse de que CT-PEG se disuelve completamente en DMSO.
  2. Disolver 49,46 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) en 5 mL de DMSO, después añadir la solución al matraz utilizado en el paso 2.1 y remover durante 30 min en RT.
  3. Disolver 29,69 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) en 5 mL de DMSO y añadir la solución al matraz utilizado en el paso 2.1. Continuar agitando en RT durante 3 h.
  4. Disolver 28,6 μL de polietilenoimina (PEI) en 10 mL de DMSO y añadir la solución gota a gota al matraz utilizado en el paso 2.1. Revuelva durante 3 días, al menos.
  5. Transferir la solución reaccionada del paso 2.4 a una bolsa de diálisis (corte de peso molecular de 1.000 [MWCO]). Coloque la bolsa de diálisis en un castor de 1 L con 500 mL de agua ultrapura como dializador. Cambiar el agua ultrapura cada 12 h durante 3 días.
  6. Transfiera la solución en el paso 2.5 a otra bolsa de diálisis (10.000 MWCO). Coloque la bolsa de diálisis en un castor de 1 L con 500 mL de agua ultrapura como dializador. Cambiar el agua ultrapura cada 12 h durante 3 días.
  7. Concentre la solución del paso 2.6 utilizando un evaporador rotativo (40 °C, 0.1 MPa) y liofile la muestra para obtener el polvo PEI-g-PEG.

3. Síntesis de PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Disolver 5 mg de PEI-g-PEG preparado (paso 2.7) en 5 ml de agua ultrapura en un matraz nuevo y colocar con un tapón de vidrio.
  2. Añadir 100 mL de solución HAuCl4 de 0,3 mM al matraz y remover la solución durante 3 h al RT.
    NOTA: El color de la solución debe cambiar inmediatamente de amarillo a naranja.
  3. Añadir 1 mL de 1 mg/mL de naBH4 de solución al matraz y remover la solución durante 3 h al RT.
    NOTA: La solución de reacción debe girar instantáneamente burdeos.
  4. Dializar el producto de reacción utilizando una bolsa de diálisis (1.000 MWCO) durante 3 días como se describe en el paso 2.5 para obtener la solución pei-g-PEG@AuNPs.

4. Síntesis de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Añadir 1 mL de solución DOX de 2,2 mg/ml y 20 mL de solución pei-g-PEG@AuNPs a un matraz nuevo y colocarlo con un tapón de vidrio.
  2. Disolver 0,727 mg de EDC en 1 mL de agua ultrapura y añadir la solución de EDC al matraz utilizado en el paso 4.1.
  3. Disolver 0,437 mg de NHS en 1 mL de agua ultrapura. Añadir la solución NHS al matraz y remover en RT durante 1 h.
  4. Dializar el producto de reacción utilizando una bolsa de diálisis (1.000 MWCO) durante 3 días como se describe en el paso 2.5 para obtener la solución DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

5. Síntesis de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Añadir 20 ml de solución DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y 4OD de AS1411 (OD = densidad óptica; 1OD ≈ 33 μg) a un nuevo matraz.
  2. Disolver 28,76 mg de EDC en 1 mL de agua ultrapura y añadir la solución de EDC al matraz utilizado en el paso 5.1.
  3. Disolver 17,27 mg de NHS en 1 mL de agua ultrapura. Añadir la solución NHS al matraz utilizado en el paso 5.1 y remover la reacción durante 1 h al RT.
  4. Dializar el producto de reacción mediante el uso de una bolsa de diálisis (1.000 MWCO) durante 3 días como se describe en el paso 2.5 para obtener AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

6. Caracterización de la muestra

  1. Disolver el polímero CT-PEG (paso 1.8) y el copolímero PEI-g-PEG (paso 2.7) en cloroformo-d en tubos de resonancia magnética nuclear (RMN), respectivamente. Analice las muestras utilizando un espectrómetro de RMN de 600 MHz equipado con un imán superconductor de 14,09 T y una sonda de alta resolución de gradiente Z de banda ancha de 5,0 mm a 600 MHz para confirmar la estructura química34.
  2. Dispersar AuNPs, DOX y AS1411, y preparar PEI-g-PEG@AuNPs (paso 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (paso 4.4) y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (paso 5.4), respectivamente en agua ultrapura. Luego, transfiera a las cubetas y registre los espectros ultravioleta-visibles (UV-vis) usando un espectrofotómetro UV-vis.
  3. Conecte un adhesivo de doble cara (~ 2 mm x 2 mm) al papel de aluminio y sumerja la solución de muestra (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) en toda la cinta de manera uniforme. Analice las muestras utilizando un analizador de espectroscopia de fotoelectrones de rayos X.
  4. Dispersar pei-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, respectivamente en agua ultrapura. Luego, transfiera a las cubetas y evalúe la distribución del tamaño utilizando la dispersión dinámica de luz.
  5. Dispersar pei-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en agua ultrapura (una gota de muestra por 5 mL de agua ultrapura para cada muestra). Sonicar durante 2 h. Sumerja la rejilla de cobre en soluciones de muestra y séquelas bajo una lámpara infrarroja. Caracterizar la morfología utilizando un microscopio electrónico de transmisión.
  6. Inyecte 1 mg de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en un casete de diálisis MWCO de 20 kDa, luego coloque 80 mL de solución salina tamponada con fosfato con albúmina sérica bovina (BSA) al 5%. Revuelva a 37 °C.
  7. En los puntos de tiempo predeterminados, recoja las alícuotas de 100 μL y reemplácelas con PBS fresco. Utilice un espectrofotómetro UV-vis para medir la intensidad de fluorescencia DOX de las alícuotas.

7. Ensayo CCK-8 de nanopartículas AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Cultivar células A549 en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina bajo una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO2 a 37 °C. Reemplace el medio de cultivo cada 2 días. Utilice las células en el paso 5 para los análisis de la proliferación de célula y de la citotoxicidad para evaluar cuantitativo la citotoxicidad de las nanopartículas preparadas de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
  2. Añadir 100 μL de solución de nanopartículas en cada pozo que contenga 1 mL de medio celular. Después de cultivar durante 24 h y 48 h, retire el medio de cultivo de las placas de cultivo celular, luego agregue 300 μL de medios de cultivo frescos y 30 μL de soluciones de kit de conteo celular-8 (CCK-8) inmediatamente a cada pozo. Incubar durante 4 h en una incubadora de CO2 a 37 °C.
  3. Transfiera 200 μL de soluciones de reacción del paso 7.2 a una placa de 96 pozos. Lea la densidad óptica (OD) de cada pozo a 570 nm con un lector de microplacas.
  4. Observar la morfología de las células a las 24 h y 48 h bajo un microscopio.

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Representative Results

1 Se utilizó la espectroscopia de RMN H para confirmar la síntesis exitosa de polímero CT-PEG y copolímeros PEI-g-PEG(Figura 2). La Figura 2a muestra que la señal de protones de metileno a δ = 3,61 ppm y la señal de protones carboxilos a δ = 2,57 ppm confirman la síntesis exitosa de polímeros CT-PEG. La Figura 2b muestra que la señal de protones de metileno de PEG a δ = 2,6 ppm y la señal de protones de PEI a δ = 1,66 ppm confirman la síntesis de copolímeros PEI-g-PEG.

La espectroscopia UV-vis se llevó a cabo para determinar la funcionalización exitosa del copolímero preparado en AuNPs(Figura 3). En espectros UV-vis, la presencia de las bandas a ~523 nm, 507 nm y 260 nm corresponde a los picos de resonancia de plasmón superficial (SPR) de AuNPs, DOX y AS1411, respectivamente (Figura 3a). Las bandas a ~360 nm en el espectro UV-vis de PEI-g-PEG@AuNPs, ~532 nm en el espectro UV-vis de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, y ~546 nm en el espectro UV-vis de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs confirman la síntesis exitosa de copolímeros PEI-g-PEG unidos a AuNPs. También confirman que DOX y AS1411 se cargaron en AuNPs funcionalizados gradualmente (Figura 3b).

Se utilizó la espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) para investigar el enlace químico del copolímero en AuNPs(Figura 4). El espectro XPS de PEI-g-PEG@AuNPs mostró que los picos C1s, O1s, N1s y Au4f indicaron la conexión entre AuNPs y el copolímero PEI-g-PEG(Figura 4a). Hubo un ligero cambio en el espectro XPS de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, ya que DOX se injertaba aún más en PEI-g-PEG@AuNPs(Figura 4b). Además, la aparición del pico P2p para AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs se debió principalmente al injerto exitoso de AS1411 en DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(Figura 4c). La distribución del tamaño de las nanopartículas preparadas se analizó mediante DLS(Figura 5). Comparado a PEI-g-PEG@AuNPs, el diámetro medio de la hidración aumentó levemente de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y aumentó más lejos una vez que el AS1411 fue injertado encendido.

Tem se utilizó para determinar la morfología de las nanopartículas, y las imágenes mostraron que todas las nanopartículas eran uniformes sin agregación (Figura 6). Debido a las interacciones entre copolímeros en la superficie de AuNPs, la distancia de AuNPs aumentó gradualmente. Se utilizó una prueba de viabilidad celular para determinar la propiedad objetivo del sistema de entrega DOX preparado (Figura 7 y Figura 8). Los resultados de CCK-8(Figura 7)mostraron que 1) el número de células A549 disminuyó después del cultivo con AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs con el tiempo y 2) el número de células disminuyó con el aumento de la concentración de nanopartículas. Comparado al grupo libre de DOX, el número de la célula aumentó, indicando que la toxicidad fue reducida.

Junto con las imágenes de microscopía óptica (Figura 8), los resultados muestran que el número de células disminuyó después del cultivo con AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (Figura 8a−d) en comparación con el grupo control sin añadir nanopartículas (Figura 8e,f). Además, se investigó el perfil de liberación DOX de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs preparado en PBS (Figura 9). Los resultados muestran que la liberación sostenida de DOX de nanopartículas funcionalizadas causó la disminución de las células A549, y la liberación acumulativa de DOX fue de aproximadamente 63,5% ± 3,2% a las 72 h.

Figure 1
Figura 1: Ilustración esquemática de la síntesis de PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2: 1espectro de RMN H de (a) polímero CT-PEG sintetizado y (b) copolímero PEI-g-PEG. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Espectros UV-vis de (a) AuNPs, DOX y AS1411, y (b) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Espectros XPS de (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Distribución de tamaño de PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm = diámetro medio de la nanopartícula. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Imágenes TEM de (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, y (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
Barras de escala = 50 nm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Valores de densidad óptica a 570 nm (OD570)de células A549 después del cultivo con AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 μg/mL y 110 μg/mL) durante 24 h y 48 h, respectivamente.
Las células con DOX libre y las células sin añadir nanopartículas se incluyen como grupos de control. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Imágenes microscópicas ópticas de células A549 después de cultivar con AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs a 220 μg/mL (a,b) y 110 μg/ml (c,d), o cultivar sin añadir nanopartículas como grupo control (e,f) a 24 h (paneles superiores) y 48 h (paneles inferiores). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 9
Cuadro 9: Libere el perfil de DOX de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en PBS para 72 h. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discussion

El espectro de RMN 1H(Figura 2)confirma la síntesis exitosa del copolímero CT-PEG y del copolímero PEI-g-PEG. Los pesos moleculares de PEG y PEI fueron de 1.000 y 1.200, respectivamente. Además, se utilizó el sistema catalítico EDC/NHS para sintetizar el copolímero PEI-g-PEG mediante reacciones de amida. Cabe señalar que si los pesos moleculares de PEG y PEI cambiaron para sintetizar el copolímero PEI-g-PEG, entonces el tiempo de reacción y el sistema catalítico deben ser reevaluados. Además, la condición de reacción para el recubrimiento de copolímero PEI-g-PEG en AuNPs debe ajustarse aún más, principalmente porque el peso de la molécula y la estructura del copolímero PEG-g-PEI pueden influir en la eficiencia del recubrimiento y el diámetro de AuNPs. Posteriormente, la morfología del copolímero funcionalizado AuNPs puede ser cambiada, también. El número de grupos amino del polímero PEI puede influir en la estructura de la síntesis final del copolímero PEI-g-PEG, y la acción de reticulado entre PEI y CT-PEG ocurrirá inevitablemente. Por lo tanto, el paso 2.4 debe realizarse con cuidado, y la solución PEI debe agregarse lentamente gota a gota. Después de la reacción de síntesis, la diálisis (pasos 2.5 y 2.6) necesita ser operada para eliminar el copolímero reticulado y los polímeros no reaccionados.

Además, DOX y AS1411 se funcionalizan secuencialmente en PEI-g-PEG@AuNPs a través de reacciones de amida, y se utiliza el sistema catalítico EDC/NHS. Requiere 3 días para cada reacción (paso 4.3 y paso 5.3) aquí; sin embargo, si el tiempo de reacción requiere menos de 3 días, la eficiencia de funcionalización disminuirá. Cuando se requieren más de 3 días, se ha obtenido el mismo resultado. Cabe señalar que la EDC química, el NHS y el DOX o AS1411 no conectados se pueden eliminar mediante tratamiento de diálisis (paso 4.4 y paso 5.4). Los espectros UV-vis y XPS son métodos efectivos para investigar la funcionalización exitosa del copolímero en nanopartículas, y se han obtenido resultados consistentes (Figura 3 y Figura 4).

A diferencia de las bandas UV-vis características de AuNPs, DOX y AS1411, los picos únicos de PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs son difíciles de observar, debido a la superposición de cada pico. Además, hemos realizado un método diferente para fabricar DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (sintetizar DOX-g-PEI-g-PEG primero, y la realización de la funcionalización en AuNPs); sin embargo, las nanopartículas de oro que utilizan este enfoque han llevado a una baja eficiencia de carga DOX35,36. Por lo tanto, cabe señalar que el método para la síntesis de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en este trabajo garantizará una eficiencia de carga DOX suficiente, así como un perfil de liberación adicional. Si un experimento no tiene en cuenta la eficiencia de carga DOX de las nanopartículas de oro, existen otros métodos para obtener AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Estos incluyen la síntesis de DOX-g-PEI-g-PEG o AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG a través de una reacción de amida primero, luego la funcionalización en nanopartículas de oro. Por lo tanto, el método utilizado aquí, así como los copolímeros obtenidos se pueden aplicar a diversas aplicaciones médicas, como la ingeniería de tejidos.

La distribución del tamaño y la morfología de las nanopartículas preparadas pueden ser investigadas por DLS y TEM. Los datos de DLS(Figura 5)muestran que las nanopartículas de diámetro de hidratación varían de diferentes recubrimientos, y aparece más de un pico para cada muestra. En cuanto a la estructura de PEI-g-PEG(Figura 1),no se observa la curva de distribución normal de DLS. Cabe señalar que las nanopartículas se dispersan en agua ultrapura durante la prueba DLS, se utilizan diferentes relaciones de volumen y todavía existen múltiples picos, debido a las interacciones entre copolímeros en la superficie de las nanopartículas. Por lo tanto, las imágenes TEM se utilizan para confirmar la morfología de las nanopartículas. Las imágenes TEM de PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs se muestran en la Figura 6.

Basándose en diferentes componentes de las superficies de las nanopartículas de oro, las distancias entre las nanopartículas cambian. Además, las nanopartículas preparadas dispersas en agua son estables según las pruebas de potencial zeta (-29 a 50 mV para diferentes nanopartículas después de las pruebas de tiempo). La funcionalización adicional de DOX y AS1411 (secciones 4 y 5 del protocolo) no influyen en el diámetro de las nanopartículas de oro. Se puede concluir que el UV-vis es un método eficaz para confirmar DOX y AS1411 cargados en nanopartículas sin utilizar todos los métodos de prueba.

La propiedad apuntada en las células cancerosas fue investigada usando las células A549 cultivadas con diversas concentraciones de AuNPs cargados preparados AS1411 y DE DOX y sin la adición de nanopartículas como grupo de control. Al mismo tiempo, también se probaron los efectos de dox libre sobre la viabilidad de las células A549 (Figura 7 y Figura 8). En comparación con el grupo sin añadir nanopartículas, el preparado AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs conducir a una disminución de las células A549. Sin embargo, mientras que la concentración de nanopartículas disminuye (100 μg/mL), las células muestran mejor actividad a las 24 h en comparación con el grupo DOX libre. Esto se debe principalmente a que el copolímero PEI-g-PEG tiene una excelente citocompatibilidad37 y la toxicidad inespecífica del polímero pei ramificado se mejora.

Finalmente, debido a la propiedad específica del aptámero AS1411, las nanopartículas obtenidas se acumulan en células cancerosas en lugar de células sanas. Una vez que se reconoce el aptámero, el DOX se libera para matar las células cancerosas. Se registró el perfil de liberación de DOX de AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs en PBS (Figura 9). Este protocolo demuestra un acercamiento para preparar los aptámeros y DOX injertado en AuNPs modificado copolímero vía una reacción de la amida del multi-paso. Las nanopartículas sintetizadas tienen potencial para aplicaciones de terapia contra el cáncer.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31700840); el Proyecto clave de investigación científica de la provincia de Henan (18B430013, 18A150049). Esta investigación fue apoyada por el Nanhu Scholars Program for Young Scholars de XYNU. A los autores les gustaría agradecer al estudiante de licenciatura Zebo Qu de la Facultad de Ciencias de la Vida en XYNU por sus útiles trabajos. A los autores les gustaría agradecer al Centro de Análisis y Pruebas de XYNU por el uso de sus equipos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Dimethylaminopyridine Macklin D807273
A549 cell ATCC CCL-185TM
AS1411 BBI Life Sciences Corporation 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411)
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Cell counting kit-8 (CCK-8) Sigma Aldrich 96992-500TESTS-F
Dichloromethane Traditional Chinese medicine 80047318
Diethyl ether (Et2O) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Dimethyl sulfoxide Macklin D806645
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Sigma Aldrich
Doxorubicin hydrochloride Rhawn R017518
Ether absolute Traditional Chinese medicine 80059618
Field Emission Transmission Electron Microscope FEI Company Tecnai G2 F 20
Gold(III) chloride trihydrate Rhawn R016035
Laser Particle-size Instrument Malvern Instruments Ltd ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Macklin N808856
N-Hydroxysuccinimide Macklin H6231
NMR software Delta 5.2.1
Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer JEOL JNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5 OriginLab
Penicillin Sigma Aldrich V900929-100ML
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P4417-100TAB
Poly(ethylene glycol) Sigma Aldrich 81188 BioUltra, average Mn ~ 1000
Poly (ethyleneimine) solution Sigma Aldrich 482595 average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O
Sodium borohydride, powder Acros C18930
Streptomycin Sigma Aldrich 85886-10ML
Succinic anhydride Traditional Chinese medicine 30171826
Tetrahydrofuran Traditional Chinese medicine 40058161
Triethylamine Traditional Chinese medicine 80134318
UV/VIS/NIR Spectrometer Lambda950 Lambda950
X-ray Photoelectron Spectrometer Thermo Fisher Scientific K-ALPHA 0.5EV

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References

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Química Número 160 aptámero nanopartículas de oro doxorrubicina copolímero administración de fármacos terapia contra el cáncer
Síntesis De Aptamer-PEI-g-PEG Nanopartículas De Oro Modificadas Cargadas Con Doxorrubicina Para La Administración De Fármacos Dirigidos
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