Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntese af Aptamer-PEI-g-PEG Modificeret Guld Nanopartikler Fyldt med Doxorubicin for målrettet drug delivery

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61139
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 3, 3
1College of Life Sciences, Xinyang Normal University, 2Department of Imaging & Pathology, University of Leuven and Oral & Maxillofacial Surgery, University Hospitals Leuven, 3Analysis & Testing Center, Xinyang Normal University

Summary

I denne protokol syntetiseres doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modificerede guld nanopartikler via tre-trins midt reaktioner. Derefter er doxorubicin lastet og leveret til at målrette kræftceller til kræftbehandling.

Abstract

På grund af resistens over for lægemidler og toksicitet i raske celler, brug af doxorubicin (DOX) har været begrænset i klinisk kræftbehandling. Denne protokol beskriver udformningen af poly (ethylenimine) podet med polyethylen glycol (PEI-g-PEG) copolymer funktionaliserede guld nanopartikler (AuNPs) med lastet aptamer (AS1411) og DOX gennem amide reaktioner. AS1411 er specifikt bundet med målrettede nukleolinreceptorer på kræftceller, så DOX målretter kræftceller i stedet for raske celler. For det første podes PEG til forgrenet PEI for at opnå en PEI-g-PEG-copolymer, hvilket bekræftes af 1H NMR-analyse. Dernæst syntetiseres PEI-g-PEG copolymer coated gold nanopartikler (PEI-g-PEG@AuNPs), og DOX og AS1411 er kovalent bundet til AuNPs gradvist via midt reaktioner. Diameteren af den forberedte AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs er ~39,9 nm, med et zetapotentiale på -29,3 mV, hvilket indikerer, at nanopartiklerne er stabile i vand- og cellemedie. Celle cytotoksicitet assays viser, at den nydesignede DOX indlæst AuNPs er i stand til at dræbe kræftceller (A549). Denne syntese viser den delikate arrangement af PEI-g-PEG copolymers, aptamers, og DOX på AuNPs, der opnås ved sekventielle midt reaktioner. Sådanne aptamer-PEI-g-PEG funktionaliserede aunps giver en lovende platform for målrettet lægemiddellevering i kræftbehandling.

Introduction

At være den største folkesundhed problem på verdensplan, kræft er bredt karakteriseret som havende en lav helbredelse, høj gentagelsesrate, og højdødelighed 1,2. Nuværende konventionelle anti-cancer metoder omfatter kirurgi, kemoterapi, ogstrålebehandling 3, blandt hvilke kemoterapi er den primære behandling for kræftpatienter i klinikken4. Klinisk anvendte kræftlægemidler omfatter hovedsageligt paclitaxel (PTX)5 og doxorubicin (DOX)6,7. DOX, et antineoplastisk lægemiddel, er stort set blevet anvendt i klinisk kemoterapi på grund af fordelene ved kræft cytotoksicitet og hæmning af kræftcellespredning8,9. DOX forårsager dog kardiotoksicitet10,11, og DOX's korte halveringstid begrænser dens anvendelse i klinikken12. Derfor er nedbrydelige lægemiddelbærere nødvendige for at indlæse DOX og diskret frigive på en kontrolleret måde til et målrettet område.

Nanopartikler er blevet udbredt i målrettede narkotikaleveringssystemer og har flere fordele i kræftbehandling (dvs. betydeligt overflade-til-volumen-forhold, lille størrelse, evne til at indkapsle forskellige lægemidler og tunabel overfladekemi osv.) 13,14,15. Især guld nanopartikler (AuNPs) har været meget udbredt i biologiske og biomedicinske applikationer, såsom fototermisk kræftbehandling16,17. De unikke egenskaber ved AuNPs, såsom let syntese og generel overfladefunktionalisering, har fremragende udsigter inden for det kliniske område af kræftbehandling18. Også, AuNPs er blevet brugt til at identificere narkotika levering strategier, diagnosticere tumorer, og overvinde resistens i mange undersøgelser19,20.

Ikke desto mindre skal auNPs skræddersys yderligere for at overvinde resistens over for lægemidler via høj lokal frigivelse ved tumorlæsioner gennem øget gennemtrængning og fastholdelse (EPR), såsom målretnings- og tilgængelighedsegenskaber. Polymerfunktionaliserede godkendelsesprogrammer har udvist unikke fordele, såsom forbedret vandopløselighed af hydrofobe anticancermedicin og forlænget cirkulationstid21,22. Forskellige biokompatible polymerer er blevet brugt til AuNP-belægninger, såsom polyethylenglycol (PEG), polyethylenetimine (PEI), hyaluronsyre, heparin og xanthangummi. Så stabiliteten, samt nyttelasten, af AuNPs er forbedret godt23. Specifikt er PEI en stærkt forgrenet polymer, der består af mange gentagne enheder af primære, sekundære og tertiære aminer24. PEI har fremragende opløselighed, lav viskositet og en høj grad af funktionalitet, som er velegnet til belægning på AuNPs.

På den anden side skal kræftmedicin leveres til kræftceller direkte med forbedret belastningseffektivitet og med lavere toksicitet til behandling af primære og avancerede metastatiske tumorer25. Målrettede ligands har et stort potentiale for anti-cancer lægemiddel målrettet levering systemer26. Dens selektivitet for målmolekylebinding giver anti-cancer lægemiddel rettet mod specificitet og øger lægemiddelberigelsen i syge væv27. Flere ligands omfatter antistoffer, polypeptider og små molekyler. Sammenlignet med andre ligands, nukleinsyre aptamers kan syntetiseres in vitro og er nemme at ændre. AS1411 er en uændret 26 bp phosphodiester oligonukleotid , der danner en stabil dimerisk G-tetramer struktur til specifikt at binde sig til en overekspresseret mål nuklear protein receptor på kræftceller28,29,30. AS1411 hæmmer spredningen af mange kræftceller, men påvirker ikke væksten af raske celler31,32. Som et resultat, AS1411 er blevet brugt til at fremstille en ideel målrettet lægemiddellevering system.

I denne undersøgelse syntetiseres en PEI-g-PEG copolymer via en midtreaktion, hvorefter PEI-g-PEG copolymer coatede guld nanopartikler (PEI-g-PEG@AuNPs) fremstilles. Derudover er DOX og AS1411 fortløbende knyttet til de forberedte PEI-g-PEG@AuNPs, som vist i figur 1. Denne detaljerede protokol er beregnet til at hjælpe forskere med at undgå mange af de almindelige faldgruber forbundet med fremstillingen af nye PEI-g-PEG@AuNPs fyldt med DOX og AS1411.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ADVARSEL: Sørg for at konsultere alle relevante datablade om materialesikkerhed (MSDS), før du bruger alle kemikalier. Flere af de kemikalier, der anvendes til fremstilling af copolymer og nanopartikler, er akut giftige. Nanopartikler har også potentielle farer. Sørg for at bruge alle relevante sikkerhedspraksisser og personlige værnemidler, herunder handsker, laboratoriekittel, hætter, bukser i fuld længde og nærtåede sko.

1. Syntese af dobbelt-carboxyl polyethylen glycol (CT-PEG)33

  1. Der tilsættes 1,46 g (14,6 mmol) succinisk anhydrid (SA) og 209 mg (1,71 mmol) 4-dimethylaminopyridin (DMAP) til en 100 mL rund bundkolbe.
  2. Der tilsættes 15 mL vandfri tetrahydrofuran (THF) til den kolbe, der anvendes i trin 1.1, og der monteres en glasprop. Kolben opbevares ved 0 °C i 30 min.
  3. Der tilsættes 4,28 g (4,28 mmol) polyethylenglycol (PEG) og 1,8 mL (12,8 mmol) trietylamin (TEA) til en ny kolbe.
  4. Der tilsættes 15 mL vandfri THF til den kolbe, der anvendes i trin 1.3, og der monteres en glasprop. Opløsningen overføres langsomt til den kolbe, der anvendes i trin 1.2, ved hjælp af en sprøjte under nitrogenatmosfære.
  5. Opløsningen omrøres ved 0 °C i 2 timer, og reaktionen fortsættes derefter ved stuetemperatur (RT) natten over.
  6. Ved hjælp af en roterende fordamper (40 °C, 0,1 MPa) koncentreres reaktionsopløsningen, og THF-opløsningsmidlet fjernes.
  7. Ved RT opløses reaktionsopløsningen fra trin 1.6 i 15 ml på 1,325 g/mL dichlormethan (DCM), hvorefter der tilsættes 15 ml kold dithylether (Et2O) for at opnå bundfaldsproduktet (polyethylenglycoldiacid). Fjern opløsningsmidlet via filterpapir.
    BEMÆRK: Nedbørstrinnet kan gentages 3x.
  8. Tør bundfaldet under vakuum ved RT i 48 timer.

2. Sammenfatning af PEI-g-PEG-copolymer

  1. Der tilsættes 305,47 mg CT-PEG fra trin 1,8 og 5 mL dimethylsulfoxid (DMSO) til en kolbe og omrøres ved RT for at sikre, at CT-PEG er fuldt opløst i DMSO.
  2. 49,46 mg 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) opløses i 5 ml DMSO, hvorefter opløsningen til kolben, der anvendes i trin 2.1, tilsættes, og der omrøres i 30 min ved RT.
  3. 29,69 mg N-hydroxysuccinimid (NHS) opløses i 5 ml DMSO, og opløsningen tilsættes til den kolbe, der anvendes i trin 2.1. Fortsæt med at røre ved RT i 3 timer.
  4. 28,6 μL polyethylenethylen (PEI) opløses i 10 ml DMSO, og opløsningen tilsættes dropwise til den kolbe, der anvendes i trin 2.1. Rør i mindst 3 dage.
  5. Den reagerede opløsning overføres fra trin 2.4 til en dialysepose (1.000 skæringsløsning af molekylvægt [MWCO]). Dialyseposen anbringes i et 1 L bægerglas med 500 mL ultrapurevand som dialysate. Skift ultrapure vand hver 12. time i 3 dage.
  6. Overfør opløsningen i trin 2.5 til en anden dialysepose (10.000 MWCO). Dialyseposen anbringes i et 1 L bægerglas med 500 mL ultrapurevand som dialysate. Skift ultrapure vand hver 12. time i 3 dage.
  7. Opløsningen koncentreres fra trin 2.6 ved hjælp af en roterende fordamper (40 °C, 0,1 MPa) og frysetørres prøven for at opnå PEI-g-PEG-pulveret.

3. Sammenfatning af PEI-g-PEG@AuNPs

  1. 5 mg tilberedt PEI-g-PEG (trin 2.7) opløses i 5 mL ultrapurevand i en ny kolbe og monteres med en glasprop.
  2. Der tilsættes 100 ml 0,3 mM HAuCl4 opløsning til kolben og omrøres opløsningen i 3 timer ved RT.
    BEMÆRK: Farven på opløsningen skal ændres straks fra gul til orange.
  3. Der tilsættes 1 ml 1 mg/mL NaBH4 opløsning til kolben og omrøres opløsningen i 3 timer ved RT.
    BEMÆRK: Reaktionsopløsningen skal øjeblikkeligt blive bordeaux.
  4. Dialyze reaktionsproduktet ved hjælp af en dialysepose (1.000 MWCO) i 3 dage som beskrevet i trin 2.5 for at opnå PEI-g-PEG@AuNPs-opløsningen.

4. Syntese af DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Der tilsættes 1 ml 2,2 mg/mL DOX-opløsning og 20 ml PEI-g-PEG@AuNPs opløsning til en ny kolbe og monteres med en glasprop.
  2. 0,727 mg EDC opløses i 1 ml ultrapurt vand, og EDC-opløsningen tilsættes den kolbe, der anvendes i trin 4.1.
  3. 0,437 mg NHS opløses i 1 mL ultrapurevand. Tilsæt NHS-opløsningen til kolben og rør ved RT i 1 time.
  4. Dialyze reaktionsproduktet ved hjælp af en dialysepose (1.000 MWCO) i 3 dage som beskrevet i trin 2.5 for at opnå DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs-opløsningen.

5. Sammenfatning af AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Der tilsættes 20 ml DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs opløsning og 4OD AS1411 (OD = optisk massefylde; 1OD ≈ 33 μg) til en ny kolbe.
  2. 28,76 mg EDC opløses i 1 ml ultrapurt vand, og EDC-opløsningen tilsættes den kolbe, der anvendes i trin 5.1.
  3. 17,27 mg NHS opløses i 1 mL ultrapurt vand. NHS-opløsningen tilsættes den kolbe, der anvendes i trin 5.1, og reaktionen omrøres i 1 time ved RT.
  4. Dialyze reaktionsproduktet ved hjælp af en dialysepose (1.000 MWCO) i 3 dage som beskrevet i trin 2.5 for at opnå AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

6. Stikprøvekarakterisering

  1. CT-PEG-polymeren (trin 1.8) og PEI-g-PEG-copolymeren (trin 2.7) opløses i henholdsvis chloroform-d i nukleare magnetiske resonansrør (NMR). Analyser prøverne ved hjælp af et 600 MHz NMR-spektrometer udstyret med en 14,09 T superledende magnet og 5,0 mm 600 MHz bredbånd Z-gradient højopløsningssonde for at bekræfte den kemiske struktur34.
  2. Spred aunps, DOX og AS1411, og forberedt PEI-g-PEG@AuNPs (trin 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (trin 4.4) og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (trin 5.4), henholdsvis i ultrapure vand. Derefter overføres til cuvettes og registrere ultraviolet-synlige (UV-vis) spektre ved hjælp af et UV-vis spektrofotometer.
  3. Fastgør et dobbeltsidet klæbemiddel (~2 mm x 2 mm) til aluminiumsfolien, og dyp prøveopløsningen (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) på hele båndet ensartet. Analysere prøverne ved hjælp af en røntgen fotoelektrisk spektroskopi analysator.
  4. Udstøb PEI-g-PEG@AuNPs-, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs-løsninger i henholdsvis ultrapurt vand. Overfør derefter til cuvettes og evaluere størrelsesfordelingen ved hjælp af dynamisk lysspredning.
  5. Lad PEI-g-PEG@AuNPs-, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs-opløsninger i ultrapure vand (en dråbe prøve pr. 5 mL ultrapure vand for hver prøve). Sonicate i 2 timer. Dyp kobbergitteret i prøveopløsninger og tør under en infrarød lampe. Karakterisere morfologien ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop.
  6. Der injiceres 1 mg AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i en 20 kDa MWCO dialysekassette, hvorefter der anbringes 80 mL fosfatbufferet saltvand (PBS) med 5% kvægserumalbumin (BSA). Rør ved 37 °C.
  7. Ved de forudbestemte tidspunkter opsamles 100 μL aliquots og erstattes med frisk PBS. Brug et UV-vis-spektrofotometer til at måle ALIQUOTS DOX-fluorescensintensitet.

7. CCK-8 analyse af AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs nanopartikler

  1. Grow A549 celler i Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% føtal kvæg serum, 100 U / mL penicillin, og 100 μg/mL streptomycin under en befugtet atmosfære på 95% luft og 5% CO2 ved 37 °C. Udskift kulturmediet hver 2. dag. Brug celler ved passage 5 til cellesprednings- og cytotoksicitetsanalyserne til kvantitativt at evaluere cytotoksiciteten af forberedte AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs nanopartikler.
  2. Der tilsættes 100 μL nanopartikelopløsning til hver brønd, der indeholder 1 ml cellemedium. Efter dyrkning i 24 timer og 48 timer fjernes dyrkningsmediet fra cellekulturplader, og derefter tilsættes 300 μL friske kulturmedier og 30 μL celletællingssæt-8 (CCK-8) kitløsninger straks til hver brønd. Inkuberes i 4 timer i en CO 2-inkubator ved 37 °C.
  3. 200 μL reaktionsopløsninger overføres fra trin 7.2 til en 96 brøndplade. Læs den optiske tæthed (OD) af hver brønd ved 570 nm med en mikropladelæser.
  4. Overhold cellernes morfologi ved 24 timer og 48 timer under et mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1 1 1 1 H NMR-spektroskopi blev anvendt til at bekræfte den vellykkede syntese af CT-PEG polymer og PEI-g-PEG copolymerer (figur 2). Figur 2a viser, at methylenprotonsignalet ved δ = 3,61 ppm og carboxylprotonsignalet ved δ = 2,57 ppm bekræfter den vellykkede syntese af CT-PEG polymerer. Figur 2b viser, at methylenprotonsignalet for PEG ved δ = 2,6 ppm og protonsignalet for PEI ved δ = 1,66 ppm bekræfter syntesen af PEI-g-PEG-copolymerer.

Uv-vis-spektroskopi blev udført for at bestemme en vellykket funktionalisering af forberedt copolymer på aunps(figur 3). I UV-vis-spektre svarer tilstedeværelsen af båndene til ~523 nm, 507 nm og 260 nm til overfladeplasmon resonanstoppene (SPR) i henholdsvis AuNPs, DOX og AS1411 (Figur 3a). Båndene på ~ 360 nm i UV-vis spektrum af PEI-g-PEG@AuNPs, ~532 nm i UV-vis spektrum af DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, og ~ 546 nm i UV-vis spektrum af AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs bekræfte en vellykket syntese af PEI-g-PEG copolymers knyttet til AuNPs. De bekræfter også, at DOX og AS1411 gradvist blev lastet på funktionaliserede godkendelsesprogrammer (Figur 3b).

Røntgenfotoelektrisk spektroskopi (XPS) blev brugt til at undersøge copolymers kemiske binding på aunps (figur 4). XPS-spektret af PEI-g-PEG@AuNPs viste C1'er, O1'er, N1'er og Au4f-toppe, at forbindelsen mellem aunps og PEI-g-PEG-copolymer (figur 4a). Der var en mindre ændring i XPS-spektret af DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, da DOX blev yderligere podet på PEI-g-PEG@AuNPs (Figur 4b). Desuden skyldtes udseendet af P2p peak for AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs hovedsagelig den vellykkede graft af AS1411 på DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (Figur 4c). Størrelsesfordelingen af forberedte nanopartikler blev analyseret ved hjælp af DLS (Figur 5). Sammenlignet med PEI-g-PEG@AuNPs steg den gennemsnitlige hydreringsdiameter en smule i DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og steg yderligere, når AS1411 blev podet på.

TEM blev brugt til at bestemme nanopartiklernes morfologi, og billederne viste, at alle nanopartikler var ensartede uden sammenlægning (Figur 6). På grund af samspillet mellem copolymerer på overfladen af aunps steg afstanden mellem aunps gradvist. Der blev anvendt en cellelevedygtighedstest til at bestemme målegenskaben for det forberedte DOX-leveringssystem(figur 7 og figur 8). CCK-8-resultaterne (Figur 7) viste, at 1) A549-celletallet faldt efter dyrkning med AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs over tid, og 2) celletallet faldt med øget koncentration af nanopartikler. Sammenlignet med den frie DOX-gruppe steg celletallet, hvilket indikerer, at toksiciteten blev reduceret.

Sammen med optiske mikroskopibilleder (Figur 8) viser resultaterne, at celletallet faldt efter dyrkning med AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (figur 8a−d) sammenlignet med kontrolgruppen uden at tilføje nanopartikler (figur 8e,f). Desuden blev DOX-frigivelsesprofilen fra forberedt AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i PBS undersøgt (Figur 9). Resultaterne viser, at den vedvarende frigivelse af DOX fra funktionaliserede nanopartikler forårsagede faldet i A549-celler, og den kumulative DOX-frigivelse var omkring 63,5% ± 3,2% ved 72 timer.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af syntese af PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: 1H NMR-spektre af a) syntetiseret CT-PEG-polymer og b) PEI-g-PEG-copolymer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: UV-vis-spektre af a) AuNPs, DOX og AS1411 og b) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: XPS-spektre af (a) PEI-g-PEG@AuNPs, b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Størrelsesfordeling af PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm = nanopartikelens gennemsnitlige diameter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: TEM-billeder af (a) PEI-g-PEG@AuNPs, b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
Skalalinjer = 50 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Optiske tæthedsværdier ved 570 nm (OD570) af A549-celler efter dyrkning med AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 μg/mL og 110 μg/mL) i henholdsvis 24 timer og 48 timer.
Celler med fri DOX og celler uden at tilføje nanopartikler er inkluderet som kontrolgrupper. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Optiske mikroskopiske billeder af A549-celler efter dyrkning med AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ved 220 μg/mL (a) b) og 110 μg/ml (c,d) eller dyrkning uden at tilsætte nanopartikler som kontrolgruppe (e,f) ved 24 timer (øverste paneler) og 48 timer (bundpaneler). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Frigivelsesprofil for DOX fra AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i PBS i 72 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1H NMR-spektret (figur 2) bekræfter den vellykkede syntese af CT-PEG-copolymer og PEI-g-PEG-copolymer. De molekylære vægte af PEG og PEI var henholdsvis 1.000 og 1.200. Derudover blev EDC/NHS-katalysatorsystemet brugt til at syntetisere PEI-g-PEG-copolymer via amide reaktioner. Det skal bemærkes, at hvis peg's og PEI's molekylvægte ændres for syntetisering af PEI-g-PEG-copolymer, skal reaktionstiden og katalysatorsystemet revurderes. Reaktionstilstanden for PEI-g-PEG-copolymerbelægning på godkendelsesprogrammer skal også justeres yderligere, hovedsageligt fordi molekylevægten og strukturen af PEG-g-PEI-copolymer kan påvirke overfladebehandlingseffektiviteten og diameteren af AuNPs. Bagefter kan morfologien af copolymer funktionaliserede auNPs også ændres. Antallet af aminogrupper fra PEI-polymer kan påvirke strukturen af den endelige PEI-g-PEG-copolymersyntese, og krydslink-aktionen mellem PEI og CT-PEG vil uundgåeligt forekomme. Trin 2.4 skal således udføres omhyggeligt, og PEI-løsningen skal langsomt tilføjes dråbe for dråbe. Efter syntesereaktionen skal dialyse (trin 2.5 og 2.6) betjenes for at fjerne de krydslinkede copolymer og ureagerede polymerer.

Desuden er DOX og AS1411 sekventielt funktionaliseret på PEI-g-PEG@AuNPs via amide reaktioner, og EDC / NHS katalytisk system anvendes. Det kræver 3 dage for hver reaktion (trin 4.3 og trin 5.3) her; Men hvis reaktionstiden kræver mindre end 3 dage, vil funktionaliseringseffektiviteten falde. Når det kræver mere end 3 dage, er det samme resultat opnået. Det skal bemærkes, at kemisk EDC, NHS og usammenhængende DOX eller AS1411 kan fjernes gennem dialysebehandling (trin 4.4 og trin 5.4). UV-vis spektre og XPS er effektive metoder til at undersøge en vellykket funktionalisering af copolymer på nanopartikler, og der er opnået ensartede resultater (figur 3 og figur 4).

Forskellige fra de karakteristiske UV-vis bånd af AuNPs, DOX, og AS1411, unikke toppe af PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs er udfordrende at observere, på grund af overlapning af hver top. Desuden har vi udført en anden metode til at fremstille DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (syntetisere DOX-g-PEI-g-PEG først og realisering af funktionalisering på aunps); guld nanopartikler ved hjælp af en sådan tilgang har imidlertid ført til lav DOX-belastningseffektivitet35,36. Det skal derfor bemærkes, at metoden til syntese af DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i dette arbejde vil sikre en tilstrækkelig DOX-belastningseffektivitet samt yderligere frigivelsesprofil. Hvis et forsøg ikke tager hensyn til DOX-belastningseffektiviteten af guldnanopartikler, er der andre metoder til at opnå AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Disse omfatter syntese af DOX-g-PEI-g-PEG eller AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG via en amide reaktion først, derefter funktionalisering på guld nanopartikler. Således kan den metode, der anvendes her såvel som de opnåede copolymerer, anvendes til forskellige medicinske applikationer, såsom vævsteknik.

Størrelsesfordelingen og morfologien af forberedte nanopartikler kan undersøges af DLS og TEM. DLS-data (Figur 5) viser, at nanopartiklerne med hydreringsdiameter varierer fra forskellige belægninger, og at der er mere end én top for hver prøve. Med hensyn til PEI-g-PEG 's struktur (figur 1) observeres DLS' normale fordelingskurve ikke. Det skal bemærkes, at nanopartiklerne spredes i ultrapure vand under DLS-testen, der anvendes forskellige volumenforhold, og der findes stadig multitoppe på grund af interaktioner mellem copolymerer på overfladen af nanopartikler. Således bruges TEM-billeder til at bekræfte nanopartiklernes morfologi. TEM-billeder af PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs er vist i figur 6.

Baseret på forskellige komponenter i overfladerne af guld nanopartikler ændres afstandene mellem nanopartikler. Desuden er de forberedte nanopartikler, der er spredt i vand, stabile i henhold til zeta-potentielle tests (-29 til 50 mV for forskellige nanopartikler efter tidstest). Den yderligere funktionalisering af DOX og AS1411 (afsnit 4 og 5 i protokollen) påvirker ikke diameteren af guld nanopartikler. Det kan konkluderes, at UV-vis er en effektiv metode til at bekræfte DOX og AS1411 læsset på nanopartikler uden at bruge alle testmetoder.

Den målrettede egenskab på kræftceller blev undersøgt ved hjælp af A549-celler dyrket med forskellige koncentrationer af forberedt AS1411 og DOX indlæste AuNPs og uden at tilføje nanopartikler som kontrolgruppe. Samtidig blev virkningerne af gratis DOX på A549-celles levedygtighed også testet (figur 7 og figur 8). Sammenlignet med gruppen uden at tilføje nanopartikler fører de forberedte AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs til et fald i A549-celler. Men mens koncentrationen af nanopartikler falder (100 μg/mL), viser cellerne bedre aktivitet ved 24 timer sammenlignet med den frie DOX-gruppe. Dette skyldes hovedsagelig, at PEI-g-PEG copolymer har fremragende cytokompatibilitet37, og at den ikke-specifikke toksicitet af forgrenet PEI-polymer er forbedret.

Endelig, på grund af den målrettede egenskab af aptamer AS1411, de opnåede nanopartikler er akkumuleret i kræftceller i stedet for raske celler. Når aptamer er anerkendt, DOX er frigivet til at dræbe kræftceller. Frigivelsesprofilen for DOX fra AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs i PBS blev registreret (Figur 9). Denne protokol viser en tilgang til at forberede aptamers og DOX podet på copolymer modificeret AuNPs via en multi-trins midt reaktion. De syntetiserede nanopartikler har potentiale for kræftbehandling applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (31700840); Henanprovinsens vigtigste videnskabelige forskningsprojekt (18B430013, 18A150049). Denne forskning blev støttet af Nanhu Scholars Program for Young Scholars of XYNU. Forfatterne vil gerne takke bachelorstuderende Zebo Qu fra College of Life Sciences i XYNU for hans nyttige værker. Forfatterne vil gerne anerkende Analysis &Testing Center af XYNU for brugen af deres udstyr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Dimethylaminopyridine Macklin D807273
A549 cell ATCC CCL-185TM
AS1411 BBI Life Sciences Corporation 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411)
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Cell counting kit-8 (CCK-8) Sigma Aldrich 96992-500TESTS-F
Dichloromethane Traditional Chinese medicine 80047318
Diethyl ether (Et2O) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Dimethyl sulfoxide Macklin D806645
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Sigma Aldrich
Doxorubicin hydrochloride Rhawn R017518
Ether absolute Traditional Chinese medicine 80059618
Field Emission Transmission Electron Microscope FEI Company Tecnai G2 F 20
Gold(III) chloride trihydrate Rhawn R016035
Laser Particle-size Instrument Malvern Instruments Ltd ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Macklin N808856
N-Hydroxysuccinimide Macklin H6231
NMR software Delta 5.2.1
Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer JEOL JNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5 OriginLab
Penicillin Sigma Aldrich V900929-100ML
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P4417-100TAB
Poly(ethylene glycol) Sigma Aldrich 81188 BioUltra, average Mn ~ 1000
Poly (ethyleneimine) solution Sigma Aldrich 482595 average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O
Sodium borohydride, powder Acros C18930
Streptomycin Sigma Aldrich 85886-10ML
Succinic anhydride Traditional Chinese medicine 30171826
Tetrahydrofuran Traditional Chinese medicine 40058161
Triethylamine Traditional Chinese medicine 80134318
UV/VIS/NIR Spectrometer Lambda950 Lambda950
X-ray Photoelectron Spectrometer Thermo Fisher Scientific K-ALPHA 0.5EV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  3. Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
  4. Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
  5. Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
  6. Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
  7. Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
  8. de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
  9. Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
  10. Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
  11. Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
  12. Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
  13. Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
  14. Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
  15. Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
  16. Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
  17. Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
  18. Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
  19. Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
  20. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
  21. Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
  22. Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
  23. Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
  24. Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
  25. Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
  26. Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
  27. Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
  28. Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
  29. Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
  30. Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
  31. Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
  32. Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
  33. Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
  34. Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
  35. Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
  36. Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
  37. Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).

Tags

Kemi aptamer guld nanopartikler doxorubicin copolymer lægemiddellevering kræftbehandling
Syntese af Aptamer-PEI-g-PEG Modificeret Guld Nanopartikler Fyldt med Doxorubicin for målrettet drug delivery
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nie, L., Sun, S., Sun, M., Zhou, Q., … More

Nie, L., Sun, S., Sun, M., Zhou, Q., Zhang, Z., Zheng, L., Wang, L. Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery. J. Vis. Exp. (160), e61139, doi:10.3791/61139 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter