Summary
In dit protocol worden doxorubicine-geladen AS1411-g-PEI-g-PEG gemodificeerde gouden nanodeeltjes gesynthetiseerd via driestapsamidereacties. Vervolgens wordt doxorubicine geladen en afgeleverd om kankercellen te targeten voor kankertherapie.
Abstract
Vanwege resistentie en toxiciteit van geneesmiddelen in gezonde cellen is het gebruik van doxorubicine (DOX) beperkt in klinische kankertherapie. Dit protocol beschrijft het ontwerpen van poly(ethyleenimine) geënt met polyethyleenglycol (PEI-g-PEG) copolymeer gefunctionaliseerde gouden nanodeeltjes (AuNPs) met geladen aptamer (AS1411) en DOX door middel van amidereacties. AS1411 is specifiek gebonden met gerichte nucleolin receptoren op kankercellen, zodat DOX zich richt op kankercellen in plaats van gezonde cellen. Eerst wordt PEG carboxyleerd en vervolgens geënt op vertakte PEI om een PEI-g-PEG-copolymeer te verkrijgen, wat wordt bevestigd door 1H NMR-analyse. Vervolgens worden PEI-g-PEG copolymeer gecoate gouden nanodeeltjes (PEI-g-PEG@AuNPs) gesynthetiseerd en worden DOX en AS1411 geleidelijk via amidereacties covalent aan AuNPs gebonden. De diameter van de voorbereide AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39,9 nm, met een zetapotentiaal van -29,3 mV, wat aangeeft dat de nanodeeltjes stabiel zijn in water en celmedium. Celcytotoxiciteitstesten tonen aan dat de nieuw ontworpen DOX geladen AuNPs kankercellen kunnen doden (A549). Deze synthese toont de delicate opstelling van PEI-g-PEG copolymeren, aptamers en DOX op AuNPs die worden bereikt door sequentiële amidereacties. Dergelijke aptamer-PEI-g-PEG gefunctionaliseerde AuNPs bieden een veelbelovend platform voor gerichte medicijnafgifte in kankertherapie.
Introduction
Omdat kanker wereldwijd het grootste volksgezondheidsprobleem is, wordt kanker algemeen gekenmerkt als een laag genezingspercentage, een hoog recidiefpercentage en een hoogsterftecijfer 1,2. De huidige conventionele antikankermethoden omvatten chirurgie, chemotherapie en radiotherapie3, waaronder chemotherapie de primaire behandeling is voor kankerpatiënten in de kliniek4. Klinisch gebruikte geneesmiddelen tegen kanker omvatten voornamelijk paclitaxel (PTX)5 en doxorubicine (DOX)6,7. DOX, een antineoplastisch geneesmiddel, is breed toegepast in klinische chemotherapie, vanwege de voordelen van kankercytotoxiciteit en remming van de proliferatie van kankercellen8,9. DOX veroorzaakt echter cardiotoxiciteit10,11, en de korte halfwaardetijd van DOX beperkt de toepassing ervan in de kliniek12. Daarom zijn afbreekbare medicijndragers nodig om DOX te laden en op een gecontroleerde manier op een gecontroleerde manier vrij te geven naar een gericht gebied.
Nanodeeltjes zijn veel gebruikt in gerichte systemen voor het afleveren van geneesmiddelen en hebben verschillende voordelen bij de behandeling van kanker (d.w.z. een aanzienlijke oppervlakte-volumeverhouding, kleine grootte, vermogen om verschillende geneesmiddelen in te kapselen, en afstembare oppervlaktechemie, enz.) 13,14,15. In het bijzonder zijn gouden nanodeeltjes (AuNPs) veel gebruikt in biologische en biomedische toepassingen, zoals fotothermische kankertherapie16,17. De unieke eigenschappen van AuNPs, zoals facile synthese en algemene oppervlakte functionalisatie, hebben uitstekende vooruitzichten op het klinische gebied van kankertherapie18. Ook, AuNPs zijn gebruikt om drug levering strategieën te identificeren, tumoren te diagnosticeren, en weerstand te overwinnen in vele studies19,20.
Desondanks moeten AuNP's verder worden aangepast om de resistentie tegen geneesmiddelen te overwinnen via een hoge lokale afgifte bij tumorlaesies door verbeterde permeatie en retentie (EPR), zoals de targeting- en toegankelijkheidseigenschappen. Polymeer gefunctionaliseerde AuNPs hebben unieke voordelen, zoals verbeterde oplosbaarheid in water van hydrofobe antikanker drugs en verlengde circulatie tijd21,22. Verschillende biocompatibele polymeren zijn gebruikt voor AuNP-coatings, zoals polyethyleenglycol (PEG), polyethyleenimine (PEI), hyaluronzuur, heparine en xanthaangom. Dan wordt de stabiliteit, evenals de lading, van AuNPs goed verbeterd23. Pei is een sterk vertakt polymeer dat bestaat uit vele herhalende eenheden van primaire, secundaire en tertiaire aminen24. PEI heeft een uitstekende oplosbaarheid, lage viscositeit en een hoge mate van functionaliteit, die geschikt is voor coating op AuNPs.
Aan de andere kant moeten antikankermedicijnen rechtstreeks aan kankercellen worden geleverd met een verbeterde laadefficiëntie en met een lagere toxiciteit voor de behandeling van primaire en gevorderde gemetastaseerde tumoren25. Gerichte liganden hebben een groot potentieel voor anti-kanker geneesmiddel gerichte toedieningssystemen26. De selectiviteit voor doelmolecuulbinding verleent antikankermedicijnen die gericht zijn op specificiteit en verhoogt de verrijking van geneesmiddelen in zieke weefsels27. Meer liganden omvatten antilichamen, polypeptiden en kleine moleculen. In vergelijking met andere liganden kunnen nucleïnezuur aptamers in vitro worden gesynthetiseerd en zijn ze gemakkelijk aan te passen. AS1411 is een ongewijzigd fosfodiëster oligonucleotide van 26 bp dat een stabiele dimerische G-tetramerstructuur vormt om zich specifiek te binden aan een overexpressie van nucleaire eiwitreceptor op kankercellen28,29,30. AS1411 remt de proliferatie van veel kankercellen , maar heeft geen invloed op de groei van gezonde cellen31,32. Als gevolg hiervan is AS1411 gebruikt om een ideaal gericht medicijnafgiftesysteem te fabriceren.
In deze studie wordt een PEI-g-PEG copolymeer gesynthetiseerd via een amidereactie, waarna PEI-g-PEG copolymeer gecoate gouden nanodeeltjes (PEI-g-PEG@AuNPs) worden vervaardigd. Bovendien zijn DOX en AS1411 opeenvolgend gekoppeld aan de voorbereide PEI-g-PEG@AuNPs, zoals weergegeven in figuur 1. Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen veel van de gemeenschappelijke valkuilen te vermijden die verband houden met de fabricage van nieuwe PEI-g-PEG@AuNPs geladen met DOX en AS1411.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Zorg ervoor dat u alle relevante materiaalveiligheidsinformatiebladen (MSDS) raadpleegt voordat u alle chemicaliën gebruikt. Verschillende chemicaliën die worden gebruikt voor de bereiding van copolymeer en nanodeeltjes zijn acuut giftig. Nanodeeltjes hebben ook potentiële gevaren. Zorg ervoor dat u alle geschikte veiligheidspraktijken en persoonlijke beschermingsmiddelen gebruikt, waaronder handschoenen, laboratoriumjas, kappen, broeken over de hele lengte en schoenen met een dichte tenen.
1. Synthese van dubbelcarboxyl polyethyleenglycol (CT-PEG)33
- Voeg 1,46 g (14,6 mmol) barnsteenanhydride (SA) en 209 mg (1,71 mmol) 4-dimethylamineopyridine (DMAP) toe aan een ronde bodemkolf van 100 ml.
- Voeg 15 ml watervrij tetrahydrofuran (THF) toe aan de kolf die in stap 1.1 wordt gebruikt en plaats een glazen stop. Bewaar de kolf gedurende 30 minuten op 0 °C.
- Voeg 4,28 g (4,28 mmol) polyethyleenglycol (PEG) en 1,8 ml (12,8 mmol) triethylamine (TEA) toe aan een nieuwe kolf.
- Voeg 15 ml watervrije THF toe aan de kolf die in stap 1.3 wordt gebruikt en plaats een glazen stop. Breng de oplossing langzaam over in de kolf die in stap 1.2 wordt gebruikt, met behulp van een spuit onder stikstofatmosfeer.
- Roer de oplossing gedurende 2 uur op 0 °C en zet de reactie vervolgens 's nachts voort bij kamertemperatuur (RT).
- Concentraat van de reactieoplossing met behulp van een roterende verdamper (40 °C, 0,1 MPa) en verwijder het THF-oplosmiddel.
- Los bij RT de reactieoplossing op vanaf stap 1.6 in 15 ml van 1.325 g/ml dichloormethaan (DCM) en voeg vervolgens 15 ml koude diethylether (Et2O) toe om het neerslagproduct (polyethyleenglycoldiacid) te verkrijgen. Verwijder het oplosmiddel via filterpapier.
OPMERKING: De neerslagstap kan 3x worden herhaald. - Droog de neerslag gedurende 48 uur onder vacuüm bij RT.
2. Synthese van PEI-g-PEG copolymeer
- Voeg 305,47 mg CT-PEG uit stap 1.8 en 5 ml dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan een kolf en roer bij RT om ervoor te zorgen dat CT-PEG volledig is opgelost in DMSO.
- Los 49,46 mg 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDC) op in 5 ml DMSO, voeg vervolgens de oplossing toe aan de kolf die in stap 2.1 wordt gebruikt en roer gedurende 30 minuten bij RT.
- Los 29,69 mg N-hydroxysuccinimide (NHS) op in 5 ml DMSO en voeg de oplossing toe aan de kolf die in stap 2.1 wordt gebruikt. Blijf roeren bij RT gedurende 3 uur.
- Los 28,6 μL polyethyleenimine (PEI) op in 10 ml DMSO en voeg de oplossing druppelgewijs toe aan de kolf die in stap 2.1 wordt gebruikt. Roer minstens 3 dagen.
- Breng de gereageerde oplossing over van stap 2.4 naar een dialysezak (1.000 moleculaire gewichtsafsnijding [MWCO]). Plaats de dialysezak in een bekerglas van 1 L met 500 ml ultrapure water als dialysaat. Ververs het ultrapure water om de 12 uur gedurende 3 dagen.
- Breng de oplossing in stap 2.5 over naar een andere dialysezak (10.000 MWCO). Plaats de dialysezak in een bekerglas van 1 L met 500 ml ultrapure water als dialysaat. Ververs het ultrapure water om de 12 uur gedurende 3 dagen.
- Concentreer de oplossing vanaf stap 2.6 met behulp van een roterende verdamper (40 °C, 0,1 MPa) en vries het monster in om het PEI-g-PEG-poeder te verkrijgen.
3. Synthese van PEI-g-PEG@AuNPs
- Los 5 mg bereide PEI-g-PEG (stap 2.7) op in 5 ml ultrapure water in een nieuwe kolf en plaats deze met een glazen stop.
- Voeg 100 ml 0,3 mM HAuCl4-oplossing toe aan de kolf en roer de oplossing gedurende 3 uur bij RT.
OPMERKING: De kleur van de oplossing moet onmiddellijk veranderen van geel naar oranje. - Voeg 1 ml 1 mg/ml NaBH4-oplossing toe aan de kolf en roer de oplossing gedurende 3 uur bij RT.
OPMERKING: De reactieoplossing moet onmiddellijk bordeauxrood worden. - Dialyseer het reactieproduct met behulp van een dialysezak (1.000 MWCO) gedurende 3 dagen zoals beschreven in stap 2.5 om de PEI-g-PEG@AuNPs oplossing te verkrijgen.
4. Synthese van DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
- Voeg 1 ml DOX-oplossing van 2,2 mg/ml en 20 ml PEI-g-PEG@AuNPs-oplossing toe aan een nieuwe kolf en pas deze aan met een glazen stop.
- Los 0,727 mg EDC op in 1 ml ultrapure water en voeg de EDC-oplossing toe aan de kolf die in stap 4.1 wordt gebruikt.
- Los 0,437 mg NHS op in 1 ml ultrapure water. Voeg de NHS-oplossing toe aan de kolf en roer gedurende 1 uur bij RT.
- Dialyseer het reactieproduct met behulp van een dialysezak (1.000 MWCO) gedurende 3 dagen zoals beschreven in stap 2.5 om de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs oplossing te verkrijgen.
5. Synthese van AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
- Voeg 20 ml DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs oplossing en 4OD AS1411 (OD = optische dichtheid; 1OD ≈ 33 μg) toe aan een nieuwe kolf.
- Los 28,76 mg EDC op in 1 ml ultrapure water en voeg de EDC-oplossing toe aan de kolf die in stap 5.1 wordt gebruikt.
- Los 17,27 mg NHS op in 1 ml ultrapure water. Voeg de NHS-oplossing toe aan de kolf die in stap 5.1 wordt gebruikt en roer de reactie gedurende 1 uur bij RT.
- Dialyseer het reactieproduct met behulp van een dialysezak (1.000 MWCO) gedurende 3 dagen zoals beschreven in stap 2.5 om AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs te verkrijgen.
6. Voorbeeldkarakterisering
- Los het CT-PEG-polymeer (stap 1.8) en PEI-g-PEG-copolymeer (stap 2.7) op in respectievelijk chloroform-d in nucleaire magnetische resonantiebuizen (NMR). Analyseer de monsters met behulp van een 600 MHz NMR spectrometer uitgerust met een 14,09 T supergeleidende magneet en 5,0 mm 600 MHz breedband Z-gradiënt hoge resolutie sonde om de chemische structuur te bevestigen34.
- Verspreid AuNPs, DOX en AS1411 en bereide PEI-g-PEG@AuNPs (stap 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (stap 4.4) en AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (stap 5.4), respectievelijk in ultrapure water. Breng vervolgens over naar cuvetten en registreer ultraviolet-zichtbare (UV-vis) spectra met behulp van een UV-vis spectrofotometer.
- Bevestig een dubbelzijdige lijm (~2 mm x 2 mm) aan de aluminiumfolie en dompel de monsteroplossing (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) gelijkmatig op de hele tape. Analyseer de monsters met behulp van een röntgenfoto-elektrotronspectroscopieanalysator.
- Verspreid PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs oplossingen, respectievelijk in ultrapure water. Breng vervolgens over naar cuvettes en evalueer de grootteverdeling met behulp van dynamische lichtverstrooiing.
- Verspreid PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs oplossingen in ultrapure water (één druppel monster per 5 ml ultrapure water voor elk monster). Sonicaat voor 2 uur. Dompel het koperen rooster in monsteroplossingen en droog onder een infraroodlamp. Karakteriseer de morfologie met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.
- Injecteer 1 mg AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in een 20 kDa MWCO dialysecassette en plaats vervolgens in 80 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 5% runderserumalbumine (BSA). Roer bij 37 °C.
- Verzamel op de vooraf bepaalde tijdstippen 100 μL aliquots en vervang door verse PBS. Gebruik een UV-vis spectrofotometer om de DOX fluorescentie intensiteit van de aliquots te meten.
7. CCK-8 test van AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs nanodeeltjes
- Kweek A549-cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine onder een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 bij 37 °C. Vervang het cultuurmedium om de 2 dagen. Gebruik cellen in passage 5 voor de celproliferatie- en cytotoxiciteitstesten om de cytotoxiciteit van bereide AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs nanodeeltjes kwantitatief te evalueren.
- Voeg 100 μL nanodeeltjesoplossing toe aan elke put met 1 ml celmedium. Verwijder na het cultiveren gedurende 24 uur en 48 uur de kweekmedia van celkweekplaten en voeg vervolgens onmiddellijk 300 μL verse kweekmedia en 30 μL celtellingskit-8 (CCK-8) kitoplossingen onmiddellijk toe aan elke put. Incubeer gedurende 4 uur in een CO2 incubator bij 37 °C.
- Breng 200 μL reactieoplossingen over van stap 7.2 naar een putplaat van 96. Lees de optische dichtheid (OD) van elke put bij 570 nm met een microplaatlezer.
- Observeer de morfologie van cellen op 24 uur en 48 uur onder een microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 H NMR-spectroscopie werd gebruikt om de succesvolle synthese van CT-PEG-polymeer en PEI-g-PEG-copolymeren te bevestigen (figuur 2). Figuur 2a toont aan dat het methyleenprotonsignaal bij δ = 3,61 ppm en carboxylprotonsignaal bij δ = 2,57 ppm de succesvolle synthese van CT-PEG-polymeren bevestigen. Figuur 2b toont aan dat het methyleenprotonsignaal van PEG bij δ = 2,6 ppm en protonsignaal van PEI bij δ = 1,66 ppm de synthese van PEI-g-PEG-copolymeren bevestigen.
Uv-visspectroscopie werd uitgevoerd om de succesvolle functionalisering van bereid copolymeer op AuNPs te bepalen (Figuur 3). In UV-vis spectra komt de aanwezigheid van de banden bij respectievelijk ~523 nm, 507 nm en 260 nm overeen met de oppervlakteplasmonresonantie (SPR) pieken van respectievelijk AuNPs, DOX en AS1411 (figuur 3a). De banden bij ~360 nm in UV-vis spectrum van PEI-g-PEG@AuNPs, ~532 nm in UV-vis spectrum van DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, en ~546 nm in het UV-vis spectrum van AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs bevestigen de succesvolle synthese van PEI-g-PEG copolymeren bevestigd aan AuNPs. Zij bevestigen ook dat DOX en AS1411 geleidelijk op gefunctionaliseerde AuNPs werden geladen (figuur 3b).
Röntgenfoto-elektrotronspectroscopie (XPS) werd gebruikt om de chemische binding van copolymeer op AuNPs te onderzoeken (figuur 4). Het XPS-spectrum van PEI-g-PEG@AuNPs C1's, O1's, N1's en Au4f-pieken vertoonde, duidde op het verband tussen AuNPs en PEI-g-PEG-copolymeer (figuur 4a). Er was een lichte verandering in het XPS-spectrum van DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, aangezien DOX verder werd geënt op PEI-g-PEG@AuNPs (figuur 4b). Bovendien was het verschijnen van P2p-piek voor AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs voornamelijk te wijten aan de succesvolle ent van AS1411 op DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (figuur 4c). De grootteverdeling van bereide nanodeeltjes werd geanalyseerd met dls (figuur 5). In vergelijking met PEI-g-PEG@AuNPs nam de gemiddelde hydratatiediameter licht toe in DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en nam verder toe nadat de AS1411 was geënt.
TEM werd gebruikt om de morfologie van de nanodeeltjes te bepalen, en de afbeeldingen toonden aan dat alle nanodeeltjes uniform waren zonder aggregatie (Figuur 6). Door de interacties tussen copolymeren op het oppervlak van AuNPs nam de afstand van AuNPs geleidelijk toe. Een cel levensvatbaarheidstest werd gebruikt om de doeleigenschap van het voorbereide DOX-afgiftesysteem te bepalen (figuur 7 en figuur 8). CCK-8 resultaten (Figuur 7) toonden aan dat 1) het A549 celnummer afnam na cultivering met AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs in de loop van de tijd en 2) het celaantal daalde met een verhoogde concentratie nanodeeltjes. In vergelijking met de vrije DOX-groep nam het celgetal toe, wat aangeeft dat de toxiciteit was verminderd.
Samen met optische microscopiebeelden (figuur 8) laten de resultaten zien dat het celgetal afnam na cultivering met AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (figuur 8a−d) in vergelijking met de controlegroep zonder nanodeeltjes toe te voegen (figuur 8e,f). Verder is het DOX-releaseprofiel van voorbereide AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in PBS onderzocht (figuur 9). De resultaten tonen aan dat de aanhoudende afgifte van DOX uit gefunctionaliseerde nanodeeltjes de afname van A549-cellen veroorzaakte, en de cumulatieve DOX-afgifte was ongeveer 63,5% ± 3,2% bij 72 uur.
Figuur 1: Schematische illustratie van de synthese van PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP en AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: 1H NMR spectra van (a) gesynthetiseerd CT-PEG polymeer en (b) PEI-g-PEG copolymeer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: UV-vis spectra van (a) AuNPs, DOX en AS1411, en (b) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: XPS-spectra van a) PEI-g-PEG@AuNPs, b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Grootteverdeling van PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm = gemiddelde diameter van het nanodeeltje. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: TEM-afbeeldingen van a) PEI-g-PEG@AuNPs, b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
Schaalbalken = 50 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Optische dichtheidswaarden bij 570 nm (OD570) A549-cellen na cultivering met AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 μg/ml en 110 μg/ml) gedurende respectievelijk 24 uur en 48 uur.
Cellen met vrije DOX en cellen zonder toevoeging van nanodeeltjes worden opgenomen als controlegroepen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Optische microscopische beelden van A549-cellen na cultivering met AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs bij 220 μg/ml (a,b) en 110 μg/ml (c,d), of cultiveren zonder nanodeeltjes toe te voegen als controlegroep (e,f) bij 24 uur (bovenste panelen) en 48 uur (onderste panelen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9: Ontgrendelingsprofiel van DOX van AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in PBS gedurende 72 uur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het 1H NMR spectrum (Figuur 2) bevestigt de succesvolle synthese van CT-PEG copolymeer en PEI-g-PEG copolymeer. De molecuulgewichten van PEG en PEI waren respectievelijk 1.000 en 1.200. Bovendien werd het EDC/NHS-katalytische systeem gebruikt om PEI-g-PEG-copolymeer te synthetiseren via amidereacties. Opgemerkt moet worden dat als de molecuulgewichten van PEG en PEI veranderen voor het synthetiseren van PEI-g-PEG-copolymeer, de reactietijd en het katalytische systeem opnieuw moeten worden geëvalueerd. Ook moet de reactieconditie voor PEI-g-PEG copolymeercoating op AuNPs verder worden aangepast, voornamelijk omdat het molecuulgewicht en de structuur van PEG-g-PEI-copolymeer de coatingefficiëntie en diameter van AuNPs kunnen beïnvloeden. Daarna kan ook de morfologie van copolymeer gefunctionaliseerde AuNPs worden veranderd. Het aantal aminogroepen van PEI-polymeer kan de structuur van de uiteindelijke PEI-g-PEG-copolymeersynthese beïnvloeden en de crosslink-actie tussen PEI en CT-PEG zal onvermijdelijk optreden. Stap 2.4 moet dus zorgvuldig worden uitgevoerd en de PEI-oplossing moet langzaam druppel voor druppel worden toegevoegd. Na de synthesereactie moet dialyse (stappen 2.5 en 2.6) worden uitgevoerd om het gekruiste copolymeer en de niet-geacteerde polymeren te verwijderen.
Bovendien worden DOX en AS1411 opeenvolgend gefunctionaliseerd op PEI-g-PEG@AuNPs via amidereacties en wordt het EDC/NHS-katalytische systeem gebruikt. Het vereist 3 dagen voor elke reactie (stap 4.3 en stap 5.3) hier; als de reactietijd echter minder dan 3 dagen vereist, zal de functionaliseringsefficiëntie afnemen. Wanneer het meer dan 3 dagen nodig heeft, is hetzelfde resultaat verkregen. Opgemerkt moet worden dat chemische EDC, NHS en niet-verbonden DOX of AS1411 kunnen worden verwijderd door dialysebehandeling (stap 4.4 en stap 5.4). UV-vis spectra en XPS zijn effectieve methoden om de succesvolle functionalisering van copolymeer op nanodeeltjes te onderzoeken, en consistente resultaten zijn verkregen (figuur 3 en figuur 4).
Anders dan de karakteristieke UV-vis-banden van AuNPs, DOX en AS1411, zijn unieke pieken van PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs uitdagend om waar te nemen, vanwege de overlapping van elke piek. Bovendien hebben we een andere methode uitgevoerd om DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs te fabriceren (eerst DOX-g-PEI-g-PEG synthetiseren en functionaliseren op AuNPs); gouden nanodeeltjes die een dergelijke aanpak gebruiken , hebben echter geleid tot een lage DOX-beladingsefficiëntie35,36. Er zij derhalve op gewezen dat de methode voor de synthese van DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs in dit werk zal zorgen voor een voldoende DOX-beladingsefficiëntie en een verder vrijgaveprofiel. Als een experiment geen rekening houdt met dox-belastingsefficiëntie van gouden nanodeeltjes, zijn er andere methoden om AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs te verkrijgen. Deze omvatten synthese van DOX-g-PEI-g-PEG of AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG via eerst eenamidereactie en vervolgens functionalisatie op gouden nanodeeltjes. Zo kan de hier gebruikte methode en de verkregen copolymeren worden toegepast op diverse medische toepassingen, zoals weefseltechnologie.
De grootteverdeling en morfologie van voorbereide nanodeeltjes kan worden onderzocht door DLS en TEM. Dls-gegevens (figuur 5) tonen aan dat de nanodeeltjes met een hydratatiediameter verschillen van verschillende coatings en dat er voor elk monster meer dan één piek verschijnt. Wat de structuur van PEI-g-PEG (figuur 1) betreft, wordt de normale distributiecurve van DLS niet waargenomen. Opgemerkt moet worden dat de nanodeeltjes tijdens de DLS-test in ultrapure water worden verspreid, verschillende volumeverhoudingen worden gebruikt en er nog steeds meerdere pieken bestaan als gevolg van interacties tussen copolymeren op het oppervlak van nanodeeltjes. Zo worden TEM-beelden gebruikt om de morfologie van nanodeeltjes te bevestigen. TEM-afbeeldingen van PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs worden weergegeven in figuur 6.
Gebaseerd op verschillende componenten van de oppervlakken van gouden nanodeeltjes, veranderen afstanden tussen nanodeeltjes. Bovendien zijn de voorbereide nanodeeltjes die in water worden verspreid stabiel volgens zeta-potentiële tests (-29 tot 50 mV voor verschillende nanodeeltjes na tijdtests). De verdere functionalisering van DOX en AS1411 (secties 4 en 5 van het protocol) heeft geen invloed op de diameter van gouden nanodeeltjes. Geconcludeerd kan worden dat de UV-vis een effectieve methode is om DOX en AS1411 geladen op nanodeeltjes te bevestigen zonder alle testmethoden te gebruiken.
De beoogde eigenschap op kankercellen werd onderzocht met behulp van A549-cellen gekweekt met verschillende concentraties voorbereide AS1411 en DOX geladen AuNPs en zonder nanodeeltjes toe te voegen als controlegroep. Tegelijkertijd werden ook de effecten van vrije DOX op de levensvatbaarheid van A549-cellen getest (figuur 7 en figuur 8). In vergelijking met de groep zonder nanodeeltjes toe te voegen, leidt de voorbereide AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs tot een afname van A549-cellen. Hoewel de concentratie nanodeeltjes afneemt (100 μg/ml), vertonen de cellen een betere activiteit bij 24 uur in vergelijking met de vrije DOX-groep. Dit komt vooral omdat het PEI-g-PEG copolymeer een uitstekende cytocompatibiliteit37 heeft en de aspecifieke toxiciteit van vertakte PEI-polymeer wordt verzacht.
Ten slotte, als gevolg van de beoogde eigenschap van aptamer AS1411, worden de verkregen nanodeeltjes opgehoopt in kankercellen in plaats van gezonde cellen. Zodra de aptamer wordt herkend, wordt de DOX vrijgegeven om de kankercellen te doden. Het releaseprofiel van DOX van AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs in PBS werd geregistreerd (Figuur 9). Dit protocol toont een aanpak voor het voorbereiden van aptamers en DOX geënt op copolymeer gemodificeerde AuNPs via een multi-step amide reactie. De gesynthetiseerde nanodeeltjes hebben potentieel voor kankertherapie toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31700840); het belangrijkste wetenschappelijke onderzoeksproject van de provincie Henan (18B430013, 18A150049). Dit onderzoek werd ondersteund door het Nanhu Scholars Program for Young Scholars van XYNU. De auteurs willen bachelorstudent Zebo Qu van het College of Life Sciences in XYNU bedanken voor zijn nuttige werken. De auteurs willen graag het Analysis & Testing Center van XYNU erkennen voor het gebruik van hun apparatuur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
- Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
- Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
- Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
- Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
- Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
- de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
- Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
- Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
- Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
- Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
- Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
- Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
- Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
- Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
- Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
- Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
- Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
- Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
- Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
- Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
- Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
- Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
- Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
- Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
- Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
- Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
- Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
- Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
- Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).
