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Chemistry

Synthèse de nanoparticules d’or modifiées Aptamer-PEI-g-PEG chargées de doxorubicine pour l’administration ciblée de médicaments

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61139
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 3, 3
1College of Life Sciences, Xinyang Normal University, 2Department of Imaging & Pathology, University of Leuven and Oral & Maxillofacial Surgery, University Hospitals Leuven, 3Analysis & Testing Center, Xinyang Normal University

Summary

Dans ce protocole, les nanoparticules d’or modifiées AS1411-g-PEI-g-PEG chargées de doxorubicine sont synthétisées via des réactions d’amide en trois étapes. Ensuite, la doxorubicine est chargée et administrée pour cibler les cellules cancéreuses pour le traitement du cancer.

Abstract

En raison de la résistance aux médicaments et de la toxicité dans les cellules saines, l’utilisation de la doxorubicine (DOX) a été limitée dans le traitement clinique du cancer. Ce protocole décrit la conception de poly(éthylénimine) greffée avec des nanoparticules d’or fonctionnalisées de polyéthylène glycol (PEI-g-PEG) avec des aptamères chargés (AS1411) et du DOX par des réactions d’amide. AS1411 est spécifiquement lié avec des récepteurs nucléoline ciblés sur les cellules cancéreuses afin que DOX cible les cellules cancéreuses au lieu des cellules saines. Tout d’abord, le PEG est carboxylé, puis greffé à l’Î.-P.-É. ramifié pour obtenir un copolymère PEI-g-PEG, ce qui est confirmé par une analyse RMN de 1H. Ensuite, les nanoparticules d’or revêtues de copolymère PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs) sont synthétisées, et DOX et AS1411 sont liés de manière covalente aux AuNPs progressivement via des réactions d’amide. Le diamètre de l’AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs préparé est d’environ 39,9 nm, avec un potentiel zêta de -29,3 mV, ce qui indique que les nanoparticules sont stables dans l’eau et le milieu cellulaire. Les tests de cytotoxicité cellulaire montrent que les AuNPs chargés de DOX nouvellement conçus sont capables de tuer les cellules cancéreuses (A549). Cette synthèse démontre la disposition délicate des copolymères PEI-g-PEG, des aptamères et des DOX sur les AuNPs qui sont obtenus par des réactions séquentielles d’amide. Ces Aptamères-PEI-g-PEG fonctionnalisés AuNPs fournissent une plate-forme prometteuse pour l’administration ciblée de médicaments dans le traitement du cancer.

Introduction

Étant le principal problème de santé publique dans le monde, le cancer est largement caractérisé comme ayant un faible taux de guérison, un taux de récidive élevé et un taux de mortalité élevé1,2. Les méthodes anticancéreuse conventionnelles actuelles comprennent la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie3,parmi lesquelles la chimiothérapie est le traitement principal pour les patients atteints de cancer dans la clinique4. Les médicaments anticancéreux utilisés cliniquement comprennent principalement le paclitaxel (PTX)5 et la doxorubicine (DOX)6,7. DOX, un médicament antinéoplasique, a été largement appliqué en chimiothérapie clinique, en raison des avantages de la cytotoxicité du cancer et de l’inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses8,9. Cependant, DOX provoque une cardiotoxicité10,11,et la courte demi-vie de DOX restreint son application dans la clinique12. Par conséquent, des porteurs de médicaments dégradables sont nécessaires pour charger dox et libérer subequently d’une manière contrôlée à une zone ciblée.

Les nanoparticules ont été largement utilisées dans les systèmes d’administration de médicaments ciblés et présentent plusieurs avantages dans le traitement du cancer (c.-à-d. rapport surface/volume important, petite taille, capacité d’encapsuler divers médicaments et chimie de surface accordable, etc.) 13,14,15. En particulier, les nanoparticules d’or (AuNPs) ont été largement utilisées dans des applications biologiques et biomédicales, telles que le traitement photothermique du cancer16,17. Les propriétés uniques des AuNPs, telles que la synthèse facile et la fonctionnalisation générale de surface, ont d’excellentes perspectives dans le domaine clinique du traitement du cancer18. En outre, les AuNPs ont été utilisés pour identifier les stratégies d’administration de médicaments, diagnostiquer les tumeurs et surmonter la résistance dans de nombreuses études19,20.

Néanmoins, les AuNPs doivent être davantage adaptés pour surmonter la résistance aux médicaments via une libération locale élevée aux lésions tumorales par perméation et rétention améliorées (EPR), telles que les propriétés de ciblage et d’accessibilité. Les polymères fonctionnalisés AuNPs ont présenté des avantages uniques, tels que l’amélioration de la solubilité dans l’eau des médicaments anticancéreux hydrophobes et le temps de circulation prolongé21,22. Divers polymères biocompatibles ont été utilisés pour les revêtements AuNP, tels que le polyéthylène glycol (PEG), la polyéthylèneimine (PEI), l’acide hyaluronique, l’héparine et la gomme xanthane. Ensuite, la stabilité, ainsi que la charge utile, des AuNPs est améliorée bien23. Plus précisément, PEI est un polymère hautement ramifié qui est composé de nombreuses unités répétitrices d’amines primaires, secondaires et tertiaires24. L’Île-du-Prince-Édouard a une excellente solubilité, une faible viscosité et un haut degré de fonctionnalité, ce qui convient au revêtement sur les AuNPs.

D’autre part, les médicaments anticancéreux doivent être livrés directement aux cellules cancéreuses avec une efficacité de chargement améliorée et une toxicité plus faible pour le traitement des tumeurs métastatiques primaires et avancées25. Les ligands ciblés ont un grand potentiel pour les systèmes d’administration ciblés de médicaments anticancéreux26. Sa sélectivité pour la liaison à la molécule cible confère une spécificité de ciblage des médicaments anticancéreux et augmente l’enrichissement des médicaments dans les tissusmalades 27. Plus de ligands comprennent des anticorps, des polypeptides et de petites molécules. Par rapport à d’autres ligands, les aptamères d’acides nucléiques peuvent être synthétisés in vitro et sont faciles à modifier. AS1411 est un oligonucléotide phosphodiétre de 26 pb non modifié qui forme une structure G-tétramère dimérique stable pour se lier spécifiquement à un récepteur protéique nucléaire cible surexprimé sur les cellules cancéreuses28,29,30. L’AS1411 inhibe la prolifération de nombreuses cellules cancéreuses mais n’affecte pas la croissance des cellules saines31,32. En conséquence, AS1411 a été utilisé pour fabriquer un système d’administration de médicaments ciblé idéal.

Dans cette étude, un copolymère PEI-g-PEG est synthétisé via une réaction d’amide, puis des nanoparticules d’or recouvertes de copolymere PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs) sont fabriquées. En outre, DOX et AS1411 sont liés séquentiellement à la pei-g-PEG@AuNPs préparée, comme indiqué dans Figure 1. Ce protocole détaillé vise à aider les chercheurs à éviter bon nombre des pièges courants associés à la fabrication de nouveaux pei-g-PEG@AuNPs chargés de DOX et d’AS1411.

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Protocol

ATTENTION : Assurez-vous de consulter toutes les fiches signalétiques (FS) pertinentes avant d’utiliser tous les produits chimiques. Plusieurs des produits chimiques utilisés pour la préparation des copolymères et des nanoparticules sont extrêmement toxiques. Les nanoparticules présentent également des dangers potentiels. Assurez-vous d’utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées et l’équipement de protection individuelle, y compris les gants, le sarrau de laboratoire, les capuches, les pantalons pleine longueur et les chaussures à bout fermé.

1. Synthèse du polyéthylène glycol double-carboxyle (CT-PEG)33

  1. Ajouter 1,46 g (14,6 mmol) d’anhydride succinique (SA) et 209 mg (1,71 mmol) de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) dans une fiole de fond ronde de 100 mL.
  2. Ajouter 15 mL de tétrahydrofurane anhydre (THF) dans la fiole utilisée à l’étape 1.1 et installer un bouchon en verre. Maintenir le ballon à 0 °C pendant 30 min.
  3. Ajouter 4,28 g (4,28 mmol) de polyéthylène glycol (PEG) et 1,8 mL (12,8 mmol) de triéthylamine (TEA) dans une nouvelle fiole.
  4. Ajouter 15 mL de THF anhydre dans la fiole utilisée à l’étape 1.3 et installer un bouchon en verre. Transer lentement la solution dans le ballon utilisé à l’étape 1.2, à l’aide d’une seringue sous atmosphère d’azote.
  5. Agiter la solution à 0 °C pendant 2 h, puis poursuivre la réaction à température ambiante (TA) pendant une nuit.
  6. À l’aide d’un évaporateur rotatif (40 °C, 0,1 MPa), concentrer la solution de réaction et éliminer le solvant THF.
  7. A TA, dissoudre la solution réactionive de l’étape 1.6 dans 15 mL de 1,325 g/mL de dichlorométhane (DCM), puis ajouter 15 mL d’éther diéthylique froid(Et2O)pour obtenir le produit de précipitation (diacide de polyéthylène glycol). Retirez le solvant à l’intermédiaire du papier filtre.
    Remarque : L’étape de précipitation peut être répétée 3x.
  8. Sécher les précipités sous vide à TA pendant 48 h.

2. Synthèse du copolymère PEI-g-PEG

  1. Ajouter 305,47 mg de CT-PEG de l’étape 1.8 et 5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans une fiole et agiter à TA pour que le CT-PEG soit complètement dissous dans le DMSO.
  2. Dissoudre 49,46 mg de chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC) dans 5 mL de DMSO, puis ajouter la solution dans le ballon utilisé à l’étape 2.1 et agiter pendant 30 min à TA.
  3. Dissoudre 29,69 mg de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans 5 mL de DMSO et ajouter la solution dans la fiole utilisée à l’étape 2.1. Continuer à remuer à RT pendant 3 h.
  4. Dissoudre 28,6 μL de polyéthylèneimine (PEI) dans 10 mL de DMSO et ajouter la solution goutte à goutte dans la fiole utilisée à l’étape 2.1. Remuer pendant 3 jours au moins.
  5. Transférer la solution réagie de l’étape 2.4 dans un sac de dialyse (coupure de poids moléculaire de 1 000 [MWCO]). Placer le sac de dialyse dans un bécher de 1 L avec 500 mL d’eau ultrapure comme dialysat. Changer l’eau ultrapure toutes les 12 h pendant 3 jours.
  6. Transattribuer la solution à l’étape 2.5 dans un autre sac de dialyse (10 000 MWCO). Placer le sac de dialyse dans un bécher de 1 L avec 500 mL d’eau ultrapure comme dialysat. Changer l’eau ultrapure toutes les 12 h pendant 3 jours.
  7. Concentrer la solution de l’étape 2.6 à l’aide d’un évaporateur rotatif (40 °C, 0,1 MPa) et sécher l’échantillon pour obtenir la poudre PEI-g-PEG.

3. Synthèse de PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Dissoudre 5 mg de PEI-g-PEG préparé (étape 2.7) dans 5 mL d’eau ultrapure dans une nouvelle fiole et l’adapter à un bouchon en verre.
  2. Ajouter 100 mL de solution HAuCl4 de 0,3 mM dans la fiole et agiter la solution pendant 3 h à TA.
    Remarque : la couleur de la solution doit changer immédiatement de jaune à orange.
  3. Ajouter 1 mL de solution de NaBH 4 à1 mg/mL dans le ballon et agiter la solution pendant 3 h à TA.
    REMARQUE: La solution de réaction devrait instantanément devenir bordeaux.
  4. Dialyser le produit réactionnel à l’aide d’un sac de dialyse (1 000 MWCO) pendant 3 jours comme décrit à l’étape 2.5 pour obtenir la solution PEI-g-PEG@AuNPs.

4. Synthèse de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Ajouter 1 mL de solution DOX à 2,2 mg/mL et 20 mL de solution PEI-g-PEG@AuNPs dans une nouvelle fiole et l’adapter à un bouchon en verre.
  2. Dissoudre 0,727 mg d’EDC dans 1 mL d’eau ultrapure et ajouter la solution EDC à la fiole utilisée à l’étape 4.1.
  3. Dissoudre 0,437 mg de NHS dans 1 mL d’eau ultrapure. Ajouter la solution nhs dans le ballon et agiter à TA pendant 1 h.
  4. Dialyser le produit réactionnel à l’aide d’un sac de dialyse (1 000 MWCO) pendant 3 jours comme décrit à l’étape 2.5 pour obtenir la solution DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

5. Synthèse de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Ajouter 20 mL de solution DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs et 4OD d’AS1411 (DO = densité optique; 1OD ≈ 33 μg) à une nouvelle fiole.
  2. Dissoudre 28,76 mg d’EDC dans 1 mL d’eau ultrapure et ajouter la solution EDC à la fiole utilisée à l’étape 5.1.
  3. Dissoudre 17,27 mg de NHS dans 1 mL d’eau ultrapure. Ajouter la solution nhs à la fiole utilisée à l’étape 5.1 et agiter la réaction pendant 1 h à TA.
  4. Dialysez le produit de réaction à l’aide d’un sac de dialyse (1 000 MWCO) pendant 3 jours comme décrit à l’étape 2.5 pour obtenir as1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

6. Caractérisation de l’échantillon

  1. Dissoudre le polymère CT-PEG (étape 1.8) et le copolymère PEI-g-PEG (étape 2.7) dans le chloroforme-d dans des tubes de résonance magnétique nucléaire (RMN), respectivement. Analyser les échantillons à l’aide d’un spectromètre RMN 600 MHz équipé d’un aimant supraconducteur de 14,09 T et d’une sonde haute résolution à gradient Z à large bande de 5,0 mm 600 MHz pour confirmer la structure chimique34.
  2. Disperser les AUNPs, dox et AS1411, et préparer pei-g-PEG@AuNPs (étape 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (étape 4.4) et AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (étape 5.4), respectivement dans de l’eau ultrapure. Ensuite, transférez vers des cuvettes et enregistrez les spectres ultraviolets visibles (UV-vis) à l’aide d’un spectrophotomètre UV-vis.
  3. Fixez un adhésif double face (~ 2 mm x 2 mm) à la feuille d’aluminium et trempez la solution d’échantillon (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs et AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) sur l’ensemble du ruban uniformément. Analyser les échantillons à l’aide d’un analyseur de spectroscopie photoélectronique à rayons X.
  4. Disperser les solutions PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs et AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, respectivement, dans de l’eau ultrapure. Ensuite, transférer aux cuvettes et évaluer la distribution de la taille à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière.
  5. Disperser les solutions PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs et AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs dans de l’eau ultrapure (une goutte d’échantillon par 5 mL d’eau ultrapure pour chaque échantillon). Sonicate pendant 2 h. Trempez la grille de cuivre dans des solutions d’échantillons et séchez sous une lampe infrarouge. Caractériser la morphologie à l’aide d’un microscope électronique à transmission.
  6. Injecter 1 mg d’AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs dans une cassette de dialyse MWCO de 20 kDa, puis placer dans 80 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 5 % d’albumine sérique bovine (BSA). Remuer à 37 °C.
  7. Aux points de temps prédéterminés, recueillir des aliquotes de 100 μL et les remplacer par du PBS frais. Utilisez un spectrophotomètre UV-vis pour mesurer l’intensité de fluorescence DOX des aliquotes.

7. Dosage CCK-8 des nanoparticules AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Cultiver des cellules A549 dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine sous une atmosphère humidifiée de 95 % d’air et de 5 % deCO2 à 37 °C. Remplacez le milieu de culture tous les 2 jours. Utiliser des cellules au passage 5 pour les essais de prolifération cellulaire et de cytotoxicité afin d’évaluer quantitativement la cytotoxicité des nanoparticules as1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs préparées.
  2. Ajouter 100 μL de solution de nanoparticules dans chaque puits contenant 1 mL de milieu cellulaire. Après la culture pendant 24 h et 48 h, retirez immédiatement le milieu de culture des plaques de culture cellulaire, puis ajoutez immédiatement 300 μL de milieux de culture frais et 30 μL de solutions de kit de comptage cellulaire kit-8 (CCK-8) à chaque puits. Incuber pendant 4 h dans un incubateur deCO2 à 37 °C.
  3. Transférer 200 μL de solutions de réaction de l’étape 7.2 dans une plaque de 96 puits. Lire la densité optique (DO) de chaque puits à 570 nm avec un lecteur de microplaque.
  4. Observer la morphologie des cellules à 24 h et 48 h au microscope.

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Representative Results

1 La spectroscopie RMN H a été utilisée pour confirmer la synthèse réussie du polymère CT-PEG et des copolymères PEI-g-PEG (Figure 2). La figure 2a montre que le signal du proton de méthylène à δ = 3,61 ppm et le signal du proton carboxyle à δ = 2,57 ppm confirment la synthèse réussie des polymères CT-PEG. La figure 2b montre que le signal de proton de méthylène du PEG à δ = 2,6 ppm et le signal protonique de l’Î.-P.-É. à δ = 1,66 ppm confirment la synthèse des copolymères PEI-g-PEG.

La spectroscopie UV-vis a été réalisée pour déterminer la fonctionnalisation réussie du copolymère préparé sur les AuNPs(Figure 3). Dans les spectres UV-vis, la présence des bandes à ~523 nm, 507 nm et 260 nm correspond aux pics de résonance plasmonique de surface (SPR) des AuNPs, DOX et AS1411, respectivement(Figure 3a). Les bandes à ~360 nm dans le spectre UV-vis de PEI-g-PEG@AuNPs, ~532 nm dans le spectre UV-vis de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, et ~546 nm dans le spectre UV-vis d’AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs confirment la synthèse réussie des copolymères PEI-g-PEG attachés aux AuNPs. Ils confirment également que DOX et AS1411 ont été chargés progressivement sur des AuNPs fonctionnalisés(Figure 3b).

La spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) a été utilisée pour étudier la liaison chimique du copolymère sur les AuNPs(Figure 4). Le spectre XPS du PEI-g-PEG@AuNPs a montré des pics C1, O1, N1 et Au4f indiquaient la connexion entre les AuNPs et le copolymère PEI-g-PEG(Figure 4a). Il y a eu un léger changement dans le spectre XPS de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, car DOX a été greffé davantage sur PEI-g-PEG@AuNPs(Figure 4b). En outre, l’apparition du pic P2p pour AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs était principalement due à la greffe réussie d’AS1411 sur DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(figure 4c). La distribution granmétrique des nanoparticules préparées a été analysée à l’aide de DLS(Figure 5). Comparé à PEI-g-PEG@AuNPs, le diamètre moyen d’hydratation a légèrement augmenté dans DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs et a encore augmenté une fois que l’AS1411 a été greffé sur.

Tem a été utilisé pour déterminer la morphologie des nanoparticules, et les images ont montré que toutes les nanoparticules étaient uniformes sans agrégation (Figure 6). En raison des interactions entre les copolymères à la surface des AuNPs, la distance des AuNPs a progressivement augmenté. Un test de viabilité cellulaire a été utilisé pour déterminer la propriété cible du système d’administration DOX préparé(figure 7 et figure 8). Les résultats de CCK-8 (Figure 7) ont montré que 1) le nombre de cellules A549 diminuait après la culture avec AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs au fil du temps et 2) le nombre de cellules diminuait avec l’augmentation de la concentration de nanoparticules. Par rapport au groupe DOX libre, le nombre de cellules a augmenté, indiquant que la toxicité a été réduite.

Avec les images de microscopie optique(figure 8),les résultats montrent que le nombre de cellules a diminué après la culture avec AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(figure 8a−d)par rapport au groupe témoin sans ajouter de nanoparticules(figure 8e,f). De plus, le profil de rejet dox de l’AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs préparé dans le PBS a été étudié(figure 9). Les résultats montrent que la libération soutenue de DOX à partir de nanoparticules fonctionnalisées a causé la diminution des cellules A549, et la libération cumulative de DOX était d’environ 63,5% ± 3,2% à 72 h.

Figure 1
Figure 1 : Illustration schématique de la synthèse de PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP et AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Spectres RMN 1H du polymère CT-PEG synthétisé et b) du copolymère PEI-g-PEG. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Spectres UV-vis de (a) AuNPs, DOX et AS1411, et (b) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs et AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Spectres XPS de (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs et (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Distribution granmétrique de PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs et AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm = diamètre moyen de la nanoparticule. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Images TEM de (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs et (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
Barres d’échelle = 50 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Valeurs de densité optique à 570 nm (DO570) des cellules A549 après culture avec AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 μg/mL et 110 μg/mL) pendant 24 h et 48 h, respectivement.
Les cellules avec DOX libre et les cellules sans ajout de nanoparticules sont incluses en tant que groupes témoins. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Images microscopiques optiques de cellules A549 après culture avec AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs à 220 μg/mL (a,b) et 110 μg/ml (c,d), ou culture sans ajout de nanoparticules comme groupe témoin (e,f) à 24 h (panneaux supérieurs) et 48 h (panneaux inférieurs). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Profil de libération de DOX d’AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs dans pbs pendant 72 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le spectre RMN 1H (Figure 2) confirme la synthèse réussie du copolymère CT-PEG et du copolymère PEI-g-PEG. Les poids moléculaires du PEG et de l’Île-du-Prince-Édouard étaient de 1 000 et 1 200, respectivement. De plus, le système catalytique EDC/NHS a été utilisé pour synthétiser le copolymère PEI-g-PEG via des réactions d’amide. Il convient de noter que si les poids moléculaires du PEG et de l’Î.-P.-É. changent pour synthétiser le copolymère PEI-g-PEG, le temps de réaction et le système catalytique doivent être réévalués. En outre, la condition de réaction pour le revêtement de copolymère PEI-g-PEG sur les AuNPs doit être ajustée davantage, principalement parce que le poids de la molécule et la structure du copolymère PEG-g-PEI peuvent influencer l’efficacité du revêtement et le diamètre des AuNPs. Par la suite, la morphologie du copolymère fonctionnalisé AuNPs peut également être modifiée. Le nombre de groupes aminés du polymère PEI peut influencer la structure de la synthèse finale des copolymères PEI-g-PEG, et l’action de réticulation entre PEI et CT-PEG se produira inévitablement. Ainsi, l’étape 2.4 doit être effectuée avec soin, et la solution PEI doit être ajoutée lentement goutte à goutte. Après la réaction de synthèse, la dialyse (étapes 2.5 et 2.6) doit être opérée pour éliminer le copolymère réticulé et les polymères n’ayant pas réagi.

En outre, DOX et AS1411 sont fonctionnalisés séquentiellement sur PEI-g-PEG@AuNPs via des réactions d’amide, et le système catalytique EDC / NHS est utilisé. Il faut 3 jours pour chaque réaction (étape 4.3 et étape 5.3) ici; cependant, si le temps de réaction nécessite moins de 3 jours, l’efficacité de la fonctionnalisation diminuera. Lorsque vous avez besoin de plus de 3 jours, le même résultat a été obtenu. Il convient de noter que l’EDC chimique, le NHS et le DOX ou l’AS1411 non connectés peuvent être éliminés par traitement de dialyse (étape 4.4 et étape 5.4). Les spectres UV-vis et XPS sont des méthodes efficaces pour étudier la fonctionnalisation réussie du copolymère sur les nanoparticules, et des résultats cohérents ont été obtenus(Figure 3 et Figure 4).

Différent des bandes UV-vis caractéristiques des AuNPs, DOX, et AS1411, les pics uniques de PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, et AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs sont difficiles à observer, en raison du chevauchement de chaque pic. En outre, nous avons effectué une méthode différente pour fabriquer DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (synthétiser DOX-g-PEI-g-PEG d’abord, et réalisation de la fonctionnalisation sur auNPs); cependant, les nanoparticules d’or utilisant une telle approche ont conduit à une faible efficacité de chargement DOX35,36. Ainsi, il convient de noter que la méthode de synthèse de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs dans ce travail assurera une efficacité de chargement DOX suffisante ainsi qu’un profil de libération supplémentaire. Si une expérience ne tient pas compte de l’efficacité de chargement DOX des nanoparticules d’or, il existe d’autres méthodes pour obtenir as1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Ceux-ci incluent la synthèse de DOX-g-PEI-g-PEG ou AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG via une réaction d’amide d’abord, puis la fonctionnalisation sur des nanoparticules d’or. Ainsi, la méthode utilisée ici ainsi que les copolymères obtenus peuvent être appliqués à diverses applications médicales, telles que l’ingénierie tissulaire.

La distribution granmitique et la morphologie des nanoparticules préparées peuvent être étudiées par DLS et TEM. Les données DLS (Figure 5) montrent que les nanoparticules de diamètre d’hydratation varient selon les revêtements, et plus d’un pic apparaît pour chaque échantillon. En ce qui concerne la structure du PEI-g-PEG(figure 1),la courbe de distribution normale du DLS n’est pas observée. Il convient de noter que les nanoparticules sont dispersées dans de l’eau ultrapure lors du test DLS, différents rapports de volume sont utilisés et des pics multiples existent toujours, en raison des interactions entre copolymères à la surface des nanoparticules. Ainsi, les images TEM sont utilisées pour confirmer la morphologie des nanoparticules. Les images TEM de PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs et AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs sont illustrées à la figure 6.

Sur la base des différents composants des surfaces des nanoparticules d’or, les distances entre les nanoparticules changent. Par ailleurs, les nanoparticules préparées dispersées dans l’eau sont stables selon des tests de potentiel zêta (-29 à 50 mV pour différentes nanoparticules après des tests chronométré). La fonctionnalisation ultérieure de DOX et AS1411 (sections 4 et 5 du protocole) n’influence pas le diamètre des nanoparticules d’or. On peut conclure que l’UV-vis est une méthode efficace pour confirmer le DOX et l’AS1411 chargés sur des nanoparticules sans utiliser toutes les méthodes d’essai.

La propriété ciblée sur les cellules cancéreuses a été étudiée à l’aide de cellules A549 cultivées avec différentes concentrations d’AUNPs préparés as1411 et DOX chargés et sans ajouter de nanoparticules comme groupe témoin. Dans le même temps, les effets du DOX libre sur la viabilité des cellules A549 ont également été testés(figure 7 et figure 8). Par rapport au groupe sans ajout de nanoparticules, l’AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs préparé entraîne une diminution des cellules A549. Cependant, alors que la concentration de nanoparticules diminue (100 μg/mL), les cellules montrent une meilleure activité à 24 h par rapport au groupe DOX libre. C’est principalement parce que le copolymère PEI-g-PEG a une excellente cytocompatibilité37 et la toxicité non spécifique du polymère PEI ramifié est améliorée.

Enfin, en raison de la propriété ciblée de l’aptamère AS1411, les nanoparticules obtenues sont accumulées dans les cellules cancéreuses au lieu de cellules saines. Une fois que l’aptamère est reconnu, le DOX est libéré pour tuer les cellules cancéreuses. Le profil de rejet de DOX de l’AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs dans pbs a été enregistré(Figure 9). Ce protocole démontre une approche pour préparer des aptamères et des DOX greffés sur des AuNPs modifiés en copolymère par l’intermédiaire d’une réaction d’amide en plusieurs étapes. Les nanoparticules synthétisées ont un potentiel pour des applications de thérapie du cancer.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31700840); le projet de recherche scientifique clé de la province du Henan (18B430013, 18A150049). Cette recherche a été soutenue par le Nanhu Scholars Program for Young Scholars de XYNU. Les auteurs tiennent à remercier Zebo Qu, étudiant en licence au College of Life Sciences de XYNU, pour ses travaux utiles. Les auteurs tiennent à remercier le Centre d’analyse et de test de XYNU pour l’utilisation de leur équipement.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Dimethylaminopyridine Macklin D807273
A549 cell ATCC CCL-185TM
AS1411 BBI Life Sciences Corporation 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411)
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Cell counting kit-8 (CCK-8) Sigma Aldrich 96992-500TESTS-F
Dichloromethane Traditional Chinese medicine 80047318
Diethyl ether (Et2O) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Dimethyl sulfoxide Macklin D806645
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Sigma Aldrich
Doxorubicin hydrochloride Rhawn R017518
Ether absolute Traditional Chinese medicine 80059618
Field Emission Transmission Electron Microscope FEI Company Tecnai G2 F 20
Gold(III) chloride trihydrate Rhawn R016035
Laser Particle-size Instrument Malvern Instruments Ltd ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Macklin N808856
N-Hydroxysuccinimide Macklin H6231
NMR software Delta 5.2.1
Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer JEOL JNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5 OriginLab
Penicillin Sigma Aldrich V900929-100ML
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P4417-100TAB
Poly(ethylene glycol) Sigma Aldrich 81188 BioUltra, average Mn ~ 1000
Poly (ethyleneimine) solution Sigma Aldrich 482595 average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O
Sodium borohydride, powder Acros C18930
Streptomycin Sigma Aldrich 85886-10ML
Succinic anhydride Traditional Chinese medicine 30171826
Tetrahydrofuran Traditional Chinese medicine 40058161
Triethylamine Traditional Chinese medicine 80134318
UV/VIS/NIR Spectrometer Lambda950 Lambda950
X-ray Photoelectron Spectrometer Thermo Fisher Scientific K-ALPHA 0.5EV

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Chimie Numéro 160 aptamère nanoparticules d’or doxorubicine copolymère administration de médicaments traitement du cancer
Synthèse de nanoparticules d’or modifiées Aptamer-PEI-g-PEG chargées de doxorubicine pour l’administration ciblée de médicaments
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Nie, L., Sun, S., Sun, M., Zhou, Q., Zhang, Z., Zheng, L., Wang, L. Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery. J. Vis. Exp. (160), e61139, doi:10.3791/61139 (2020).

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