Summary
Een protocol voor het bestuderen van FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen door therapeutische antilichamen in menselijke natural killer cellen wordt hier beschreven. Dit kunstmatige stimulatieplatform maakt het mogelijk om stroomafwaartse effectorfuncties te onderzoeken, zoals degranulatie, chemokine / cytokineproductie en signaalroutes gemedieerd door de FcγRIIIa- en Fc-delen van antilichamen die betrokken zijn bij binding.
Abstract
Een werkingsmechanisme voor klinische werkzaamheid door therapeutische antilichamen is de bevordering van immuungerelateerde functies, zoals cytokinesecretie en cytotoxiciteit, aangedreven door FcγRIIIa (CD16) uitgedrukt op natural killer (NK) cellen. Deze observaties hebben geleid tot onderzoek gericht op methoden om Fc-receptor-gemedieerde gebeurtenissen te verhogen, waaronder verwijdering van een fucose-deel dat wordt aangetroffen op het Fc-gedeelte van het antilichaam. Verdere studies hebben de mechanistische veranderingen in signalering, cellulaire processen en cytotoxische kenmerken opgehelderd die de ADCC-activiteit verhogen met afucosylated antilichamen. Bovendien hebben andere studies de potentiële voordelen van deze antilichamen in combinatie met kleine molecuulremmers aangetoond. Deze experimenten toonden de moleculaire en cellulaire mechanismen aan die ten grondslag liggen aan de voordelen van het gebruik van afucosylated antilichamen in combinatie-instellingen. Veel van deze waarnemingen waren gebaseerd op een kunstmatige in vitro activatie assay waarbij de FcγRIIIa op menselijke NK cellen werd geactiveerd door therapeutische antilichamen. Deze test bood de flexibiliteit om downstream effector NK-celfuncties te bestuderen, zoals cytokineproductie en degranulatie. Bovendien is deze test gebruikt om signaalroutes te ondervragen en moleculen te identificeren die kunnen worden gemoduleerd of gebruikt als biomarkers. Ten slotte zijn andere therapeutische moleculen (d.w.z. kleine molecuulremmers) aan het systeem toegevoegd om inzicht te geven in de combinatie van deze therapeutica met therapeutische antilichamen, wat essentieel is in de huidige klinische ruimte. Dit manuscript heeft tot doel een technische basis te bieden voor het uitvoeren van deze kunstmatige menselijke NK-celactiveringstest. Het protocol demonstreert belangrijke stappen voor celactivering en potentiële downstream-toepassingen die variëren van functionele uitlezingen tot meer mechanistische waarnemingen.
Introduction
In de afgelopen decennia is er een enorme focus geweest op het ontwikkelen van gerichte kankertherapieën met behulp van antilichamen. Therapeutische antilichamen, zoals trastuzumab en rituximab, werken via meerdere mechanismen, waaronder de preventie van dimerisatie van signaalmoleculen en mobilisatie van het immuunsysteem1,2. Dit laatste wordt bereikt door antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC), waarbij lymfocyten die natural killer (NK) -cellen worden genoemd, door het antilichaam1,2naar een doelcel worden gebracht. Door de cellen in de nabijheid van elkaar te plaatsen, wordt de NK-cel geactiveerd en kan een tumor/ doelcel lyseren door de afscheiding van effectormoleculen3.
Op moleculair niveau bindt het Fab-gedeelte van het antilichaam zijn verwante antigeen dat tot expressie komt op de tumorcellen, terwijl het Fc-gedeelte de FcγRIIIa tot expressie brengt op NK-cellen om de twee cellen samen te brengen1,2. Na betrokkenheid van de FcγRIIIa stimuleren signaleringsroutes (d.w.z. MAPK- en PI3K-routes) cytoskeletale herschikking, cytokineproductie en cytotoxiciteit4,5,6,7,8,9. ADCC is dus een FcγRIIIa-gedreven gebeurtenis gemedieerd door NK-cellen en antilichamen.
Omdat ADCC werd beschouwd als een werkingsmechanisme voor deze therapeutische antilichamen, zochten onderzoekers naar methoden om ADCC te verhogen door het antilichaam te wijzigen. Een wijziging was de verwijdering van fucose op de oligosaccharideketen bevestigd aan asparagine 297, die de bindingsaffiniteit van het Fc-gedeelte van het antilichaam tegen de FcγRIIIa10,11,12verhoogt. In dierstudies vertoonden muizen die afucosylated antilichamen kregen een langzamere tumorgroei in vergelijking met muizen die werden behandeld met zijn gefucosyleerde tegenhanger13. Wat nog belangrijker is, obinutuzumab (bijv. Gazyva, een goedgekeurd afucosylated antilichaam) vertoonde een betere werkzaamheid ten opzichte van rituximab (bijv. Rituxan, zijn gefucosyleerde tegenhanger) bij patiënten met de diagnose chronische lymfatische leukemie of folliculair lymfoom14,15.
Tot voor kort waren de mechanismen die ten grondslag liggen aan verhoogde ADCC via afucosylated antilichamen onbekend. Gecombineerd met het feit dat er tal van onderzoeksprogramma's zijn die therapeutische antilichamen ontwikkelen om FcγRIIIa-gestuurde mechanismen te gebruiken om kankercellen te targeten, is het noodzakelijk om in vitro assays te ontwikkelen die de moleculaire en cellulaire aspecten onderzoeken die door deze antilichamen worden bevorderd. Dit biedt fundamenteel inzicht in de werkingsmechanismen en het potentieel om biomarkers te ontdekken. Als zodanig werd een kunstmatige activeringstest ontwikkeld om antilichaamafhankelijke FcγRIIIa-gemedieerde functies te bestuderen naast signalering en cellulaire kenmerken8. Door middel van deze studies zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verhoogde werkzaamheid van afucosylated antilichamen opgehelderd, waarbij verbeterde bindingsaffiniteit de signalering verhoogt om cellulaire eigenschappen en cytotoxische kenmerken te bevorderen8.
De huidige trend in klinische studies is het gebruik van een combinatie van therapeutischemoleculen 16. Een van de meest gemuteerde routes is de PI3K-route, die enorme inspanningen heeft geleverd bij het ontwikkelen van kleine molecuulremmers die zich richten op componenten van deze route17,18,19,20. Toch is het relatief onbekend hoe deze moleculen werken in combinatie met therapeutische antilichamen, vooral in combinaties waarbij de remmer moleculen kan beïnvloeden die de PI3K-route nodig hebben om te functioneren, zoals die aangedreven door therapeutische antilichamen.
Hiertoe is de in vitro assay die wordt gebruikt voor de afucosylated antilichaamstudies ook gebruikt om de combinatie van PI3K-remmers en therapeutische antilichamen te bestuderen. Deze studies definieerden de moleculaire kenmerken van PI3K-remming op therapeutische antilichaam PI3K-gedreven gebeurtenissen en beschreven hoe afucosylated antilichamen dit verlies van signalering kunnen compenseren9. Deze bevindingen zijn relevant omdat ze potentiële richtlijnen bieden voor het ontwerpen van klinische onderzoeken. Bovendien leidde deze reeks experimenten ook tot de eerste beschreven waarnemingen voor kinetische regulatie van de PI3K-signaleringsroute om chemokine / cytokine-transcriptie en -productie te moduleren, die kunnen dienen als potentiële biomarkers9.
De kunstmatige in vitro activeringstest die wordt gebruikt om de hierboven beschreven signalerings- en cellulaire kenmerken te definiëren, is ontworpen om FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen in NK-cellen gemedieerd door antilichamen in afwezigheid van doelcellen te bestuderen. Zonder doelcellen in het systeem kunnen alle waargenomen signaleringsgebeurtenissen en functies rechtstreeks aan de NK-cellen worden toegeschreven. In de gepresenteerde test wordt antilichaam toegevoegd aan gezuiverde NK-cellen, waarna het Fc-gedeelte de FcγRIIIa bindt. Dit wordt gevolgd door crosslinking van het antilichaam met behulp van een anti-humaan κ lichte keten antilichaam om de cellen kunstmatig te stimuleren. Crosslinking van het antilichaam bootst de binding van het doelantigeen na om een signaleringsplatform te genereren dat stroomafwaartse gebeurtenissen veroorzaakt. Afhankelijk van de duur van de stimulatie kunnen onderzoekers signalering, cellulaire processen, cytotoxische kenmerken en effectorfunctiesbeoordelen 8,9. Evenzo biedt deze test ook flexibiliteit bij het bestuderen van deze gebeurtenissen wanneer antilichamen worden gecombineerd met anderemoleculen 9.
Samen is dit een ideale in vitro test om therapeutische antilichamen te bestuderen die NK-celresponsen opwekken via hun FcγRIIIa als onderdeel van het werkingsmechanisme. Dit protocol beschrijft de prestaties van deze in vitro activatie assay en geeft inzicht in de verschillende uitleringen die uitgevoerd kunnen worden.
Protocol
Het volgende protocol is in overeenstemming met de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van iQ Bioscience.
1. Isolatie van PBMC's en verrijking/zuivering van NK-cellen
OPMERKING: Andere methoden voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) en verrijking /zuivering kunnen ook worden uitgevoerd.
- Trek 200 ml bloed onder gereguleerde omstandigheden in een buis met heparine.
- Voeg 15 ml van het dichtheidsgradiëntmedium toe aan een buis van 50 ml met een poreuze barrière erin. Draai de buis op 1000 x g gedurende 30 s.
- Voeg 12,5 ml bloed toe aan de buis, gevolgd door nog eens 12,5 ml PBS en keer voorzichtig 3x om. Draai de buis gedurende 15 minuten op 800 x g bij kamertemperatuur (RT) zonder onderbrekingen.
- Bereid een conische buis van 50 ml met 40 ml PBS voor elke buis met een poreuze barrière terwijl de cellen draaien.
- Verwijder de buizen voorzichtig en inspecteer na het centrifugeren. Controleer op een dunne, zichtbaar witte laag PBMC's boven de poreuze barrière, tussen de afbakeningen van 20 ml en 25 ml op de buis van 50 ml.
- Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk vloeistof van de bovenkant met een pipet zonder de dunne, witte PBMC-laag te verstoren.
- Verwijder met een schone serologische pipet van 10 ml voorzichtig de PBMC-laag naast de heldere, gelige vloeistoflaag tot aan het filter van de buis.
- Verdrijft de PBMC's en de vloeistof in de 50 ml conisch bevattende PBS die in stap 1.4 is bereid. Spinbuizen bij RT en 300 x g gedurende 5 min.
- Aspirateer de PBS-was en voeg nog eens 40 ml PBS toe. Spinbuizen bij RT en 300 x g gedurende 5 min.
- Tel na het wassen de cellen en resuspend ze in 40 μL van 2% BSA/PBS per 1 x 107 cellen.
- Ga verder met de isolatie van NK-cellen met behulp van de methode van keuze. Keuzes omvatten handmatige of geautomatiseerde magnetische kralen gebaseerde sortering9,21. Fluorescentie-geactiveerde celsortering kan ook worden uitgevoerd22.
- Verwijder een klein aantal cellen om de zuiverheid van NK-cellen te bepalen door middel van flowcytometrie. Gating-strategie omvat het volgende: gate op levende cellen op basis van forward vs. side scatter profile, beoordeel vervolgens de zuiverheid op basis van NK-markers (bijv. CD3, CD56) in de specifieke live populatie. Typische zuiverheid is >95%.
- Nadat de isolatie is voltooid, spinnen cellen bij RT en 300 x g gedurende 5 minuten om te pelleteren en op te zuigen.
- Resuspend de celkorrel tot 1 x 107 cellen /ml in RPMI 1640 met voedingsstoffen, 10% warmte-geïnactiveerde FBS, 1 mM natriumpyruvaat, 55 mM 2-ME en 10 mM HEPES (pH = 7,2).
2. Antilichaam-gemedieerde activering van NK-cellen via FcγRIIIa
- Stel een gekoelde microcentrifuge in op 4 °C.
- Doseer 1 x 106 (100 μL) geresuspendeerde NK-cellen in buis(en) van 1,5 ml en plaats deze op ijs.
OPMERKING: Cellen kunnen worden gedoseerd in een 96 put U-bodemplaat als er veel monsters zijn. - Bereid 1 μL van 100 μg/ml rituximab (of interessant antilichaam) per monster en voeg 1 μL toe aan de cellen voor een eindconcentratie van 1 μg/ml antilichaam.
OPMERKING: Andere moleculen kunnen op dit punt of eerder aan de cellen worden toegevoegd voor de beoordeling van combinatie-effecten. Hier werd ritixumab gebruikt voor stimulatie. In eerdere studies zijn kleine molecuulremmers toegevoegd aan stimulaties9. - Incubeer het monster op ijs gedurende 30 minuten. Bereid tijdens de incubatie 50 μL van 50 μg/ml anti-humaan κ lichte keten antilichaam per monster in media en warm tot 37 °C op een warmteblok of in een waterbad.
- Voeg na incubatie van cellen op ijs 1 ml ijskoude media toe en draai gedurende 5 minuten bij 4 °C met 135 x g. Was opnieuw met 1 ml ijskoude media.
- Spirateer het supernatant na de laatste wasbeurt en voeg 50 μL van het in stap 2.5 bereide anti-menselijke κ lichte ketenmengsel toe.
- Incubeer onmiddellijk monsters voor de eindgebruiker bepaalde tijdspunten bij 37 °C op een warmteblok of in een waterbad.
- Stop de stimulatie door 1 ml ijskoude media toe te voegen en spin onmiddellijk monsters in een gekoelde centrifuge bij 135 x g gedurende 5 minuten. Nogmaals wassen met 1 ml ijskoude media.
3. Downstream toepassingen en uitleiningen
- Ondervraging van signaalmoleculen in FcγRIIIa-gestimuleerde NK-cellen door western blot-analyse
OPMERKING: Verschillende eiwitscheidings- en membraanoverdrachtsapparaten kunnen worden gebruikt.- Na de laatste wasbeurt met ijskoude media (stap 2.8) mengen lysecellen met 20 μL RIPA-buffer met fosfatase en proteaseremmers gedurende 30 minuten op ijs.
- Spinbuizen bij 2100 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Breng het lysaat over in een schone buis van 1,5 ml en voeg de reagentia toe die nodig zijn voor eiwitscheiding.
- Scheid eiwitten op SDS-PAGE-gel en breng ze over op een nitrocellulose- of PVDF-membraan volgens standaardprotocollen.
- Blokkeer en sonde het membraan volgens de datasheet van de fabrikant voor het primaire detectieantilichaam (hier werden pAKT, pPRAS 40 en pERK1/2 gebruikt).
- Voeg HRP-geconjugeerd secundair antilichaam en chemiluminescentiereagens toe volgens de aanbevelingen van de fabrikant over het PVDF-membraan. Gebruik röntgenfilm of detectie-instrument om te visualiseren (hier werd pAKT gedetecteerd bij 60 kDa, pPRAS40 bij 40 kDa en pERK1/2 bij 42 kDa en 44 kDa).
- Isolatie van mRNA en voorbereiding voor genexpressieanalyse van FcγRIIIa-gestimuleerde NK-cellen (Tabel van materialen)
- Nadat het tijdspunt voor stimulatie is bereikt (stap 2.7), plaatst u de buis op ijs en draait u onmiddellijk in een gekoelde centrifuge bij 135 x g gedurende 5 minuten (vergelijkbaar met stap 2.8).
- Verwijder het bovennatuurlijk en was 2x met 1 ml ijskoude PBS.
- Lyse cellen met behulp van guanidium isothiocyanaat RNA extractie (Tabel van materialen). Gebruik 1 μg mRNA om reverse transcriptie uit te voeren met behulp van willekeurige hexameren met een commerciële kit(Table of Materials).
OPMERKING: Elke methode van RNA-extractie of cDNA-synthese kan worden gebruikt9,23,24. - Bevries cDNA bij -20 °C tot genexpressieanalyse.
- Beoordeling van cytoskeletale herschikking in FcγRIIIa-gestimuleerde NK-cellen
- Na de laatste wasbeurt met ijskoude media (stap 2.8) resuspend de celkorrel met 50 μL 3,7% paraformaldehyde gedurende 10 min bij RT.
- Voeg 1 ml PBS toe en draai 5 minuten op 135 x g bij RT. Herhaal deze wasbeurt nogmaals.
- Voeg 100 μL van 0,1% Triton X-100/PBS gedurende 5 minuten toe om cellen te permeabiliseren, en spincellen bij 135 x g gedurende 5 minuten bij RT aan pellet.
- Voeg 100 μL van 5 eenheden/ml AF488-gelabeld falloïdine verdund in 1% BSA/PBS toe en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
- Voeg 1 ml PBS toe en draai 5 minuten op 135 x g bij RT om te wassen. Resuspend de celkorrel in het gewenste volume voor flowcytometrische analyse.
- Beoordeling van degranulatie van FcγRIIIa-gestimuleerde NK-cellen met behulp van CD107a-oppervlaktekleuring
- Incubeer de cellen met het antilichaam van belang op ijs zoals beschreven in de stappen 2.1-2.4. Bereid tijdens de incubatie 50 μL antilichaammengsel per monster voor. Bereid het mengsel in celmedia met een eindconcentratie van 50 μg/ml anti-humaan κ lichteketenantilichaam en 1 μg/ml met fluorochroom gelabeld CD107a.
- Voeg na incubatie van de cellen op ijs 1 ml ijskoude media toe. Draai gedurende 5 minuten bij 4 °C op 135 x g en was vervolgens opnieuw met 1 ml ijskoude media.
- Adem het supernatant na de laatste wasbeurt op, voeg vervolgens 50 μL van het anti-menselijke κ lichte ketenmengsel toe en incubeer bij 37 °C voor de gewenste tijdspunten.
- Voeg op de gewenste tijdstippen 1 ml PBS toe en draai gedurende 5 minuten op 135 x g bij RT. Aspiraatsupernatant en voeg 100 μL 4% paraformaldehyde toe. Incubeer bij RT gedurende 10 min.
- Voeg 1 ml PBS toe en draai 5 minuten op 135 x g bij RT om te wassen. Resuspend de celkorrel in het gewenste volume voor flowcytometrische analyse.
- Beoordeling van chemokine/cytokine productie uit FcγRIIIa-gestimuleerde NK-cellen
OPMERKING: Verschillende methoden en/of kits kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van de productie van chemokine en cytokine.- Nadat het tijdspunt voor stimulatie is bereikt (stap 2.7), plaatst u de buis onmiddellijk op ijs en draait u gedurende 5 minuten bij 4 °C in een gekoelde centrifuge bij 135 x g.
- Breng het supernatant over in een schoon vat. Vries het supernatant in tot chemokine of cytokine beoordeling met behulp van de gewenste assay.
OPMERKING: Celkorrels kunnen nu worden gewassen met ijskoud PBS en worden verwerkt voor signalerings-, genexpressie- en cytoskeletale herschikkingsstudies.
Representative Results
Het is essentieel dat de NK-celzuiverheid hoog is, omdat het Fc-gedeelte van antilichamen de FcγRIIIa kan binden die tot expressie komt op andere celtypen, zoals monocyten. Met een hoge zuiverheid kunnen de gemaakte waarnemingen direct worden toegeschreven aan FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen in NK-cellen. Hier hadden NK-cellen een zuiverheid van meer dan 90% op basis van CD56- en CD3-vlekken(figuur 1). Daarnaast was de levensvatbaarheid >95%. Voorzichtigheid is toe te dienen bij het gebruik van isolaties met een lagere levensvatbaarheid. Om ervoor te zorgen dat gebeurtenissen werden aangedreven door de FcγRIIIa, werden western blots voor fosfo-AKT (pAKT), fosfo-PRAS40 (pPRAS40) en fosfo-ERK1/2 (pERK1/2) uitgevoerd, waarbij NK-cellen gedurende 1-5 minuten werden geactiveerd. Zoals getoond, werd een accumulatie van deze moleculen waargenomen(figuur 2). Evenzo kwamen geactiveerde NK-cellen tot expressie van MIP-1α, MIP-1β, IFN-γ en TNF-α, zoals blijkt uit genexpressieanalyse(figuur 3).
Bovendien werd cytoskeletale herschikking waargenomen in geactiveerde cellen(figuur 4). Een percentage NK-cellen gestimuleerd gedurende 4 uur uitgedrukt CD107a op het celoppervlak(figuur 5). Bovendien werden IFN-γ, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β en RANTES gedetecteerd in het supernatant na 3 uur stimulatie(figuur 6). Deze uitledigingen worden verwacht op basis van gepubliceerde studies, aangezien geactiveerde NK-cellen deze gefosforyleerde eiwitten zullen hebben, evenals de genexpressie en productie van de genoemde chemokines en cytokines8,9. In alle experimenten moeten stimulatiecondities een anti-menselijke κ lichte keten alleen controle en antilichaam zonder anti-humaan κ licht crosslinking controle omvatten. Deze NK-cellen mogen geen fosfo-signalering, degranulatie, chemokine/cytokineproductie of chemokine/cytokine genexpressie vertonen.
Figuur 1: Representatieve stromingsprofielen van NK-celzuiverheid na isolatie van PBMC's. PBMC's werden geïsoleerd uit bloed van een gezonde donor, gevolgd door verrijking van NK-cellen met behulp van een negatieve selectiemethode voor menselijke NK-celisolatie(Tabel met materialen). Cellen werden gekleurd met CD56 en CD3 voor en na verrijking om de zuiverheid te bepalen. Representatieve dot plots van CD56 vs. CD3 voor en na isolatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: FcγRIIIa-geactiveerde NK-cellen vertonen gefosforyleerde signaalmoleculen. Cellen werden gedurende 2 minuten gestimuleerd met rituximab en cellysaten werden volgens het protocol gemaakt. Lysaten werden gescheiden op een gel van 4%-12%, gevolgd door overdracht op een PVDF-membraan. Het membraan werd onderzocht met antilichamen tegen pAKT, pPRAS40, pERK1/2 en actine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: FcγRIIIa-geactiveerde NK-cellen brengen chemokine- en cytokinegenen tot expressie. NK-cellen werden gestimuleerd met rituximab gedurende 0 uur, 0,5 uur en 1 uur. mRNA werd verzameld, omgekeerd getranscribeerd en onderworpen aan qPCR-analyse voor MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ en TNF-α (Tabel met materialen). (A) Relatieve expressie van MIP-1α, MIP-1β en RANTES op elk tijdstip. (B) Relatieve expressie van IFN-γ en TNF-α op elk tijdstip. Waarden werden genormaliseerd naar het actine-gen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: FcγRIIIa-geactiveerde NK-cellen vertonen cytoskeletale herschikking. NK-cellen werden gestimuleerd met rituximab gedurende 0 min, 5 min, 15 min en 30 min, gevolgd door beoordeling voor cytoskeletale herschikking door falloïdinekleuring en flowcytometrie. De verhouding van MFI op experimenteel tijdspunt tot de MFI op tijdstip 0 van NK-cellen gestimuleerd met rituximab (cirkel, vaste lijn) of secundair antilichaam alleen (vierkant, stippellijn). Balken vertegenwoordigen de SD van vier replicaties. Asterisken vertegenwoordigen statistische significantie op basis van een tweezijdige ongepaarde Student's t-test (*p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: FcγRIIIa-geactiveerde NK-cellen drukken CD107a uit. NK-cellen werden gestimuleerd met rituximab gedurende 4 uur, gevolgd door beoordeling voor degranulatie door CD107a en flowcytometrie. A)Percentage NK-cellen dat CD107a tot expressie brengt na stimulatie met rituximab (witte balken) of anti-humaan κ lichte ketenantilichaam (grijze balken) gedurende 0 uur en 4 uur. (B) CD107a MFI van NK-cellen gestimuleerd met rituximab (witte staven) of anti-menselijk κ lichte ketenantilichaam (grijze staven) na 0 uur en 4 uur behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: FcγRIIIa-geactiveerde NK-cellen scheiden chemokines en cytokines af. NK-cellen werden gedurende 0, 0,5, 1, 3 en 6 uur gestimuleerd met rituximab. Supernatant werd verzameld om de afgifte van MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ en TNF-α te meten door middel van een op stroom en kralen gebaseerde cytokinebeoordelingsmethode(Table of Materials). A) MIP-1α, MIP-1β en RANTES-productie op elk tijdstip. B) IFN-γ en TNF-α productie op elk tijdstip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit protocol beschrijft methoden voor het bestuderen van FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen in NK-cellen gemedieerd door antilichamen. Deze technieken maken de evaluatie mogelijk van potentiële werkingsmechanismen van therapeutische antilichamen, waarvan wordt gesuggereerd dat het ADCC1,2is. In het bijzonder bieden deze methoden flexibiliteit bij het bestuderen van onderliggende moleculaire signaalroutes en cellulaire processen die verantwoordelijk zijn voor ADCC. Ze maken ook observatie van andere effectorfuncties mogelijk, zoals chemokine en cytokineproductie. Bovendien maken deze methoden het mogelijk om potentiële biomarkers en moleculen te identificeren die kunnen worden gericht op het moduleren van ADCC.
De basis voor dit protocol is de kunstmatige stimulatie van NK-cellen via de FcγRIIIa met antilichamen in afwezigheid van doelcellen. Antilichaamgebonden doelcellen dienen meestal om de crosslinking van Fc-receptoren te bevorderen om een platform te vormen dat signalerings- en downstream-effecten aandrijft. In plaats daarvan wordt crosslinking bereikt met behulp van een anti-humaan κ lichtketenantilichaam in deze test, waarbij de noodzaak van doelcellen om de NK-cellen te stimuleren wordt omzeild. Zonder doelcellen kunnen de resultaten en waarnemingen direct aan de NK-cellen worden toegeschreven, ervan uitgaande dat het zuiveringsproces succesvol is.
Belangrijk is dat het gebruik van anti-humaan κ lichte ketenantilichaam om het antilichaam te crosslinken niet interfereert met de bindingsaffiniteit van het Fc-gedeelte voor de FcγRIIIa, een interactie die de sterkte van responsdicteert 10,11,12,13. Studies hebben inderdaad aangetoond dat afucosylated antilichamen ADCC verhogen vanwege hun verhoogde affiniteit voor de FcγRIIIa10,11,12,13. Latere studies toonden aan dat deze verhoogde affiniteit niet wordt beïnvloed door de anti-menselijke κ lichte keten secundaire antilichaamvervanger en kan worden gebruikt om de basis voor verhoogde ADCC8te bestuderen. Om ervoor te zorgen dat de NK-cel wordt gestimuleerd door crosslinking van het antilichaam, moeten twee negatieve controles worden opgenomen: 1) alleen therapeutisch antilichaam zonder het secundaire anti-menselijke κ lichte ketenantilichaam, en 2) het secundaire anti-menselijke κ lichte keten antilichaam alleen. In beide gevallen mag geen signalerings- of effectorfunctie worden gegenereerd.
Deze methode biedt ook flexibiliteit voor het bestuderen van de effecten van therapeutische antilichamen op kleine molecuulremmers. De remmer kan worden toegevoegd voordat deze wordt gekoppeld aan het secundaire antilichaam, zodat de remmer de tijd heeft om zijn doelwit te betrekken. Er moeten echter studies worden uitgevoerd om de optimale tijd van voorbehandeling van remmers te bepalen; de remmer heeft dus een maximaal effect op de stimulatie. Dat gezegd hebbende, kunnen onderzoekers er ook voor kiezen om de effecten van een remmer na stimulatie te bestuderen. In dit geval kan de remmer na crosslinking worden toegevoegd om te bestuderen hoe het signalen en processen beïnvloedt die al zijn gegenereerd. Samen biedt de hier beschreven methode maximale flexibiliteit bij het bestuderen van combinatorische effecten van verschillende kleine molecuulremmers met therapeutische antilichamen.
Zoals hierboven vermeld, kunnen verschillende uitleingen worden uitgevoerd na stimulatie. Western blotting kan worden uitgevoerd om signalering te bestuderen met behulp van SDS-PAGE en membraanoverdrachtssystemen van verschillende leveranciers. Evenzo kan genexpressie ook worden beoordeeld met behulp van verschillende RNA-extractiemethoden, reverse transcriptiereagentia en genexpressie-instrumenten. Ten slotte kan ook kleuring voor intracellulair of extracellulair eiwit worden uitgevoerd, waarbij monsters kunnen worden geanalyseerd met behulp van verschillende flowcytometers. Voor intracellulaire cytokine- en CD107a-kleuring (stap 3.4, die gelijktijdig kan worden beoordeeld), moeten monensine en/of brefeldine A worden toegevoegd om de signalen te maximaliseren. We hebben verschillende platforms gebruikt voor elk experimenteel doel en hebben nog steeds vergelijkbare resultaten waargenomen. Daarom kan de methode worden aangevuld met verschillende reagentia, platforms en instrumenten, afhankelijk van de studie.
De crosslinking tijd voor stimulatie zal afhangen van het doel van het onderzoek. Als signaleringsstudies gewenst zijn, ligt de typische crosslinking-stimulatietijd tussen 2 min en 10 min. pAKT, pPRAS40 en pERK1/2 accumulatie pieken op 2 min en verdwijnen na 10 min8,9. Voor functionele studies (d.w.z. die met chemokine / cytokineproductie) moeten cellen gedurende ten minste 30 minuten worden gestimuleerd, afhankelijk van de analyt9. Genexpressieanalyse vereist meestal ook 30 minutenstimulatie 9. Voorzichtigheid is geboden bij het gebruik van RANTES-genexpressie als uitlezing, omdat rantes-mRNA-productie onafhankelijk is van transcriptionele activering, omdat het al in cellen is opgeslagen voor snelle translatie en afgifte van eiwit bijstimulatie 25. Degranulatie vereist daarentegen minstens 3 uur stimulatie. Ondanks deze algemene observaties moeten onderzoekers kinetische studies uitvoeren om de optimale stimulatietijd voor de specifieke moleculen van belang te bepalen.
Evenzo moeten onderzoekers het antilichaam van belang titreren om de optimale concentratie te bepalen, omdat antilichamen met verschillende specifieke kenmerken binden aan FcγRIIIa met verschillende affiniteiten, zelfs als ze van hetzelfde isotype zijn. Rituximab en trastuzumab zijn bijvoorbeeld beide een IgG1-isotype, maar trastuzumab bindt sterker aan het valinepolymorfisme van FcγRIIIa dan rituximab26,27. Dit verschil in affiniteit kan leiden tot functionele verschillen, zoals degranulatie, zoals waargenomen in gepubliceerde studies8.
Het bepalen van de optimale concentratie is ook belangrijk vanwege de lage affiniteit die het Fc-gedeelte van het antilichaam heeft voor de FcγRIIIa. Dit kan resulteren in het afwassen van het antilichaam, omdat het protocol wasstappen omvat na binding van het antilichaam aan de Fc-receptor. Dit kan dan leiden tot een gebrek aan gevoeligheid in de assays zoals gesuggereerd door het lage percentage CD107a-positieve cellen na stimulatie(figuur 5). Het bepalen van de optimale concentratie moet echter vertrouwen geven dat de resultaten niet te wijten zijn aan een gebrek aan gevoeligheid. Bovendien worden cellen duidelijk geactiveerd in de biochemische en functionele assays die bulkcellen gebruiken in tegenstelling tot uitleingen van één cel(figuur 2, figuur 3, figuur 6).
Het protocol is ook beperkt omdat het niet volledig nabootst wat er fysiologisch gebeurt. Het secundaire anti-humane K-antilichaam dat wordt gebruikt, is om de crosslinking te imiteren die wordt gegenereerd door doelantigeen dat op cellen tot expressie komt. Hier wordt een verzadigde hoeveelheid secundair antilichaam toegevoegd om de maximale respons te genereren. Verschillende doelcellen zullen echter verschillende niveaus van antigeen tot expressie brengen, wat van invloed is op crosslinking en respons. Momenteel is dit platform niet geoptimaliseerd om de effecten van verschillende antigeenexpressieniveaus na te bootsen.
Een andere factor om te overwegen bij het uitvoeren van deze experimenten is donor-tot-donor variabiliteit als gevolg van verschillende genetische achtergronden en immunologische geschiedenissen tussen individuen. Daarom moet voorzichtig worden omgegaan met het vergelijken van NK-celresponsen van verschillende donoren over dezelfde testen. Evenzo mogen alleen algemene conclusies worden getrokken wanneer verschillende donoren worden gebruikt.
Al met al is de beschreven methode een eenvoudig en flexibel stimulatieplatform om antilichaamgestuurde FcγRIIIa-gemedieerde gebeurtenissen in NK-cellen te bestuderen. Het is gebruikt om de basis voor de verhoogde ADCC en werkzaamheid waargenomen met afucosylated antilichamen beter te begrijpen8. Deze methode werd ook gebruikt in een studie die therapeutische antilichamen en PI3K-remmers met kleine moleculen combineerde9. Bovendien werd een voorheen onbekend mechanisme voor chemokine- en cytokineproductie gereguleerd door pS6 geïdentificeerd9. Daarom kunnen toekomstige studies met behulp van dit kunstmatige signaleringsplatform mechanismen van regulatie voor effectorfuncties die worden aangedreven door de FcγRIIIa verder ophelderen. Het kan ook mogelijk nieuwe moleculen identificeren die belangrijk zijn voor deze mechanismen, evenals nieuwe rollen voor bekende moleculen.
Disclosures
Alle auteurs zijn of zijn medewerkers of consultants geweest voor iQ Biosciences.
Acknowledgments
De auteurs bedanken James Lee en Christopher Ng voor het commentaar en de redactie van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
| AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
| B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
| CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
| Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
| FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
| Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
| IFN-? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
| Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
| MIP-1? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
| MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
| NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
| pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
| PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
| RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
| RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
| RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| TNF-? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
| TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
| Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
| β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |
References
- Hudis, C. A. Trastuzumab - Mechanism of Action and Use in Clinical Practice. New England Journal of Medicine. 357 (1), 39-51 (2007).
- Weiner, G. J.
- Orange, J. S. Formation and function of the lytic NK-cell immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 8 (9), 713-725 (2008).
- Bonnema, J. D., Karnitz, L. M., Schoon, R. A., Abraham, R. T., Leibson, P. J. Fc receptor stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase in natural killer cells is associated with protein kinase C-independent granule release and cell-mediated cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1427-1435 (1994).
- Jiang, K., et al. Pivotal role of phosphoinositide-3 kinase in regulation of cytotoxicity in natural killer cells. Nature Immunology. 1 (5), 419-425 (2000).
- Kanakaraj, P., et al. Phosphatidylinositol-3 kinase activation induced upon Fc gamma RIIIA-ligand interaction. The Journal of Experimental Medicine. 179 (2), 551-558 (1994).
- Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 14151-14156 (2003).
- Liu, S. D., et al. Afucosylated Antibodies Increase Activation of FcγRIIIa-Dependent Signaling Components to Intensify Processes Promoting ADCC. Cancer Immunology Research. 3 (2), 173-183 (2015).
- Romeo, V., Gierke, S., Edgar, K. A., Liu, S. D. Effects of PI3K Inhibition on Afucosylated Antibody-Driven FcγRIIIa Events and Phospho-S6 Activity in NK Cells. The Journal of Immunology. 203 (1), 137-147 (2019).
- Mössner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Shields, R. L., et al. Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity. The Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
- Shinkawa, T., et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
- Junttila, T. T., et al. Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4481-4489 (2010).
- Goede, V., et al. Obinutuzumab (GA101) plus chlorambucil (Clb) or rituximab (R) plus Clb versus Clb alone in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and preexisting medical conditions (comorbidities): Final stage 1 results of the CLL11 (BO21004) phase III trial. Journal of Clinical Oncology. 31, 15_suppl 7004 (2013).
- Sehn, L. H., et al. Randomized Phase II Trial Comparing Obinutuzumab (GA101) With Rituximab in Patients with Relapsed CD20+ Indolent B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma: Final Analysis of the GAUSS Study. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3467-3474 (2015).
- Pons-Tostivint, E., Thibault, B., Guillermet-Guibert, J. Targeting PI3K Signaling in Combination Cancer Therapy. Trends in Cancer. 3 (6), 454-469 (2017).
- Engelman, J. A. Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nature Reviews. Cancer. 9 (8), 550-562 (2009).
- Fruman, D. A., Rommel, C. PI3K and cancer: lessons, challenges and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (2), 140-156 (2014).
- Janku, F., Yap, T. A., Meric-Bernstam, F. Targeting the PI3K pathway in cancer: are we making headway. Nature Reviews. Clinical Oncology. 15 (5), 273-291 (2018).
- Samuels, Y., et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 304 (5670), New York, N.Y. 554 (2004).
- Kanevskiy, L. M., Telford, W. G., Sapozhnikov, A. M., Kovalenko, E. I. Lipopolysaccharide induces IFN-γ production in human NK cells. Frontiers in Immunology. 4, (2013).
- Romagnani, C., et al. Activation of human NK cells by plasmacytoid dendritic cells and its modulation by CD4+ T helper cells and CD4+ CD25hi T regulatory cells. European Journal of Immunology. 35 (8), 2452-2458 (2005).
- Sivori, S., et al. CpG and double-stranded RNA trigger human NK cells by Toll-like receptors: Induction of cytokine release and cytotoxicity against tumors and dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10116-10121 (2004).
- Hanna, J., et al. Novel Insights on Human NK Cells' Immunological Modalities Revealed by Gene Expression Profiling. The Journal of Immunology. 173 (11), 6547-6563 (2004).
- Swanson, B. J., Murakami, M., Mitchell, T. C., Kappler, J., Marrack, P. RANTES production by memory phenotype T cells is controlled by a posttranscriptional, TCR-dependent process. Immunity. 17 (5), 605-615 (2002).
- Jo, M., Kwon, H. S., Lee, K. H., Lee, J. C., Jung, S. T. Engineered aglycosylated full-length IgG Fc variants exhibiting improved FcγRIIIa binding and tumor cell clearance. mAbs. 10 (2), 278-289 (2018).
- Isoda, Y., et al. Importance of the Side Chain at Position 296 of Antibody Fc in Interactions with FcγRIIIa and Other Fcγ Receptors. PLoS ONE. 10 (10), 0140120 (2015).
