Summary
En protokoll for å studere FcγRIIIa-drevne hendelser ved terapeutiske antistoffer i naturlige drapsceller er beskrevet her. Denne kunstige stimuleringsplattformen tillater avhør av nedstrøms effektorfunksjoner som degranulering, kjemokin/cytokinproduksjon og signalveier formidlet av FcγRIIIa- og Fc-delene av antistoffer involvert i binding.
Abstract
En virkningsmekanisme for klinisk effekt av terapeutiske antistoffer er fremme av immunrelaterte funksjoner, som cytokinsekresjon og cytotoksisitet, drevet av FcγRIIIa (CD16) uttrykt på naturlige morderceller (NK). Disse observasjonene har ført til forskning med fokus på metoder for å øke Fc reseptormediert hendelser, som inkluderer fjerning av en fucose moiety funnet på Fc delen av antistoffet. Videre studier har belyst de mekanistiske endringene i signalering, cellulære prosesser og cytotoksiske egenskaper som øker ADCC-aktiviteten med afukosylerte antistoffer. I tillegg har andre studier vist de potensielle fordelene ved disse antistoffene i kombinasjon med små molekylhemmere. Disse eksperimentene demonstrerte de molekylære og cellulære mekanismene som ligger til grunn for fordelene ved å bruke afukosylerte antistoffer i kombinasjonsinnstillinger. Mange av disse observasjonene var basert på en kunstig in vitro-aktiveringsanalyse der FcγRIIIa på humane NK-celler ble aktivert av terapeutiske antistoffer. Denne analysen ga fleksibiliteten til å studere nedstrøms effekteller NK-cellefunksjoner, for eksempel cytokinproduksjon og degranulering. I tillegg har denne analysen blitt brukt til å forhøre signalveier og identifisere molekyler som kan moduleres eller brukes som biomarkører. Til slutt har andre terapeutiske molekyler (dvs. små molekylhemmere) blitt lagt til systemet for å gi innsikt i kombinasjonen av disse terapeutiske med terapeutiske antistoffer, noe som er viktig i det nåværende kliniske rommet. Dette manuskriptet tar sikte på å gi et teknisk grunnlag for å utføre denne kunstige menneskelige NK-celleaktiveringsanalysen. Protokollen demonstrerer viktige trinn for celleaktivering samt potensielle nedstrømsprogrammer som spenner fra funksjonelle avlesninger til mer mekanistiske observasjoner.
Introduction
I løpet av de siste tiårene har det vært et enormt fokus på å utvikle målrettede kreftbehandlinger ved hjelp av antistoffer. Terapeutiske antistoffer, som trastuzumab og rituksimab, opererer gjennom flere mekanismer, inkludert forebygging av dimerisering av signalmolekyler og mobilisering av immunsystemet1,2. Sistnevnte oppnås gjennom antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), der lymfocytter kalt naturlige morderceller (NK) bringes til en målcelle av antistoffet1,2. Ved å plassere cellene i nærheten av hverandre, aktiveres NK-cellen og kan lyse en svulst / målcelle gjennom sekresjonen av effektormolekyler3.
På molekylært nivå binder Fab-delen av antistoffet sitt konjakkantigen uttrykt på tumorcellene, mens Fc-delen engasjerer FcγRIIIa uttrykt på NK-celler for å bringe de to cellene sammen1,2. Etter engasjement av FcγRIIIa, signaliserende veier (dvs. MAPK og PI3K veier) kjøre cytoskeletal omorganisering, cytokin produksjon, og cytotoksisitet4,5,6,7,8,9. Dermed er ADCC en FcγRIIIa-drevet hendelse formidlet av NK-celler og antistoffer.
Fordi ADCC ble antatt å være en virkningsmekanisme for disse terapeutiske antistoffene, søkte forskere etter metoder for å øke ADCC ved å modifisere antistoffet. En modifikasjon var fjerning av fucose på oligosakkaridkjeden festet til asparagin 297, noe som øker bindingsaffiniteten til Fc-delen av antistoffet til FcγRIIIa10,11,12. I dyrestudier viste mus som fikk afukosylerte antistoffer langsommere tumorvekst sammenlignet med mus behandlet med sin fucosylerte motpart13. Enda viktigere, obinutuzumab (f.eks. Gazyva, et godkjent afukosylert antistoff) viste bedre effekt i forhold til rituksimab (f.eks. Rituxan, dets fucosylerte motstykke) hos pasienter diagnostisert med kronisk lymfocytisk leukemi eller follikulær lymfom14,15.
Inntil nylig var mekanismene som lå til grunn for økt ADCC via afukosylerte antistoffer ukjente. Kombinert med det faktum at det er mange forskningsprogrammer som utvikler terapeutiske antistoffer for å bruke FcγRIIIa-drevne mekanismer for å målrette kreftceller, er det viktig å utvikle in vitro-analyser som undersøker de molekylære og cellulære aspektene som fremmes av disse antistoffene. Dette gir grunnleggende forståelse av virkningsmekanismer samt potensialet til å oppdage biomarkører. Som sådan ble en kunstig aktiveringsanalyse utviklet for å studere antistoffavhengige FcγRIIIa-medierte funksjoner i tillegg til signalering og cellulære egenskaper8. Gjennom disse studiene har mekanismene som ligger til grunn for økt effekt av afukosylerte antistoffer blitt belyst der forbedret bindende affinitet øker signalisering for å fremme cellulære egenskaper og cytotoksiske egenskaper8.
Den nåværende trenden i kliniske studier er bruk av en kombinasjon av terapeutiskemolekyler 16. En av de mest muterte banene er PI3K-banen, som har ført til enorm innsats i å utvikle små molekylhemmere som retter seg mot komponenter i denne banen17,18,19,20. Likevel er hvordan disse molekylene virker i kombinasjon med terapeutiske antistoffer relativt ukjent, spesielt i kombinasjoner der inhibitoren kan påvirke molekyler som krever PI3K-banen for å fungere, for eksempel de som drives av terapeutiske antistoffer.
For dette formål har in vitro-analysen som brukes til de afukosylerte antistoffstudiene også blitt brukt til å studere kombinasjonen av PI3K-hemmere og terapeutiske antistoffer. Disse studiene definerte de molekylære egenskapene til PI3K-hemming på terapeutisk antistoff PI3K-drevne hendelser og beskrev hvordan afukosylerte antistoffer kan kompensere for dette tapet av signalering9. Disse funnene er relevante da de gir potensiell veiledning for å designe kliniske studier. I tillegg førte denne serien av eksperimenter også til de første beskrevne observasjonene for kinetisk regulering av PI3K-signalveien for å modulere kjemokin/cytokintranskripsjon og produksjon, som kan fungere som potensielle biomarkører9.
Den kunstige in vitro-aktiveringsanalysen som brukes til å definere signal- og cellulære egenskaper beskrevet ovenfor, er designet for å studere FcγRIIIa-drevne hendelser i NK-celler mediert av antistoffer i fravær av målceller. Uten målceller i systemet kan alle de observerte signalhendelsene og funksjonene tilskrives direkte til NK-cellene. I den presenterte analysen tilsettes antistoff til rensede NK-celler, og da binder Fc-delen Fc-delen FcγRIIIa. Dette etterfølges av krysskobling av antistoffet ved hjelp av et antimenneskelig κ lyskjede antistoff for å kunstig stimulere cellene. Krysskobling av antistoffet etterligner binding av målantigenet for å generere en signalplattform som fremkaller nedstrømshendelser. Avhengig av lengden på stimulering, kan forskere vurdere signalering, cellulære prosesser, cytotoksiske egenskaper og effektorfunksjoner8,9. På samme måte gir denne analysen også fleksibilitet i å studere disse hendelsene når antistoffer kombineres med andremolekyler 9.
Sammen er dette en ideell in vitro-analyse for å studere terapeutiske antistoffer som fremkaller NK-celleresponser gjennom deres FcγRIIIa som en del av virkningsmekanismen. Denne protokollen beskriver ytelsen til denne in vitro-aktiveringsanalysen og gir innsikt i de ulike avlesningene som kan utføres.
Protocol
Følgende protokoll er i samsvar med retningslinjene i iQ Biosciences forskningsetiske komité for human forskning.
1. Isolering av PBMCer og berikelse/rensing av NK-celler
MERK: Andre metoder for isolering av perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer) og berikelse/rensing kan også utføres.
- Trekk 200 ml blod under regulerte forhold inn i et rør som inneholder heparin.
- Tilsett 15 ml av tetthetsgradientmediet i et 50 ml rør med en porøs barriere innlemmet. Snurr røret på 1000 x g i 30 s.
- Tilsett 12,5 ml blod i røret etterfulgt av ytterligere 12,5 ml PBS, og inverter forsiktig 3x. Snurr røret på 800 x g i 15 min ved romtemperatur (RT) uten pauser.
- Forbered et 50 ml konisk rør med 40 ml PBS for hvert rør med en porøs barriere mens cellene spinner.
- Fjern rørene forsiktig og inspiser etter sentrifugering. Se etter et tynt, synlig hvitt lag med PBMCer over den porøse barrieren, mellom avgrensningene på 20 ml og 25 ml på 50 ml-røret.
- Fjern forsiktig så mye væske som mulig fra toppen ved hjelp av en pipette uten å forstyrre det tynne, hvite PBMC-laget.
- Med en ren 10 ml serologisk pipette fjerner du FORSIKTIG PBMC-laget i tillegg til det klare, gulaktige væskelaget ned til rørets filter.
- Utvis PBMCene og væsken inn i den koniske 50 ml som inneholder PBS utarbeidet i trinn 1.4. Spinnrør ved RT og 300 x g i 5 min.
- Aspirer PBS-vasken og tilsett ytterligere 40 ml PBS. Spinnrør ved RT og 300 x g i 5 min.
- Etter vask, tell cellene og resuspend dem i 40 μL av 2% BSA / PBS per 1 x 107 celler.
- Fortsett til isolering av NK-celler ved hjelp av valgmetoden. Valg inkluderer manuell eller automatisert magnetisk perlebasert sortering9,21. Fluorescensaktivert cellesortering kan også utføres22.
- Fjern en liten aliquot av celler for å bestemme renheten til NK-celler ved strømningscytometri. Gating strategi inkluderer følgende: gate på levende celler basert på fremover vs. side scatter profil, deretter vurdere renheten basert på NK markører (f.eks, CD3, CD56) i den spesifikke levende befolkningen. Typisk renhet er >95%.
- Etter at isolasjonen er fullført, spinner du celler ved RT og 300 x g i 5 minutter til pellets og aspirerer.
- Resuspend cellepellet til 1 x 107 celler / ml i RPMI 1640 med næringsstoffer, 10% varmeinaktivert FBS, 1 mM natriumpyruvat, 55 mM 2-ME og 10 mM HEPES (pH = 7,2).
2. Antistoffmediert aktivering av NK-celler via FcγRIIIa
- Sett en nedkjølt mikrosenter til 4 °C.
- Dispenser 1 x 106 (100 μL) resuspenderte NK-celler til 1,5 ml rør(er) og legg dem på is.
MERK: Celler kan dispenseres i en 96 brønn U-bunnplate hvis det er mange prøver. - Forbered 1 μL 100 μg/ml rituksimab (eller antistoff av interesse) per prøve og tilsett 1 μL til cellene for en endelig konsentrasjon på 1 μg/ml antistoff.
MERK: Andre molekyler kan legges til cellene på dette tidspunktet eller tidligere for vurdering av kombinasjonseffekter. Her ble ritixumab brukt til stimulering. I tidligere studier har små molekylhemmere blitt tilsatt stimuleringer9. - Inkuber prøven på is i 30 min. Under inkubasjon, forberede 50 μL av 50 μg / ml anti-menneskelig κ lyskjede antistoff per prøve i media og varm til 37 °C på en varmeblokk eller i et vannbad.
- Etter inkubasjon av celler på is, tilsett 1 ml iskalde medier og spinn på 135 x g i 5 min ved 4 °C. Vask igjen med 1 ml iskalde medier.
- Aspirer supernatanten etter siste vask og tilsett 50 μL av den antimenneskelige κ lyskjedeblandingen tilberedt i trinn 2.5.
- Inkuber straks prøver for sluttbrukeren bestemte tidspunkter ved 37 °C på en varmeblokk eller i et vannbad.
- Stopp stimuleringen ved å tilsette 1 ml iskalde medier og spinn umiddelbart prøver i en nedkjølt sentrifuge ved 135 x g i 5 minutter. Vask igjen med 1 ml iskalde medier.
3. Nedstrøms applikasjoner og avlesninger
- Avhør av signalmolekyler i FcγRIIIa-stimulerte NK-celler ved vestlig blotanalyse
MERK: Ulike proteinseparasjons- og membranoverføringsapparater kan brukes.- Etter siste vask med iskalde medier (trinn 2.8) blandes lyseceller med 20 μL RIPA-buffer som inneholder fosfatase- og proteasehemmere i 30 minutter på is.
- Spinn rør ved 2100 x g i 15 min ved 4 °C. Overfør lysatet til et rent 1,5 ml rør og legg til reagensene som kreves for proteinseparasjon.
- Separate proteiner på SDS-PAGE gel og overfør på en nitrocellulose eller PVDF membran etter standardprotokoller.
- Blokker og sonde membranen i henhold til produsentens dataark for det primære deteksjonsantistoffet (her ble pAKT, pPRAS 40 og pERK1/2 brukt).
- Tilsett HRP-konjugert sekundært antistoff og chemiluminescensreagens i henhold til produsentens anbefalinger på PVDF-membranen. Bruk røntgenfilm eller deteksjonsinstrument for å visualisere (her ble pAKT oppdaget ved 60 kDa, pPRAS40 ved 40 kDa og pERK1/2 ved 42 kDa og 44 kDa).
- Isolering av mRNA og fremstilling for genuttrykksanalyse av FcγRIIIa-stimulerte NK-celler (Materialfortegnelse)
- Etter at tidspunktet for stimulering er nådd (trinn 2.7), plasser røret på is og spinn umiddelbart i en nedkjølt sentrifuge ved 135 x g i 5 min (lik trinn 2.8).
- Fjern supernatanten og vask 2x med 1 ml iskald PBS.
- Lyse celler ved hjelp av guanidium isothiocyanate RNA ekstraksjon (Tabell over materialer). Bruk 1 μg mRNA til å utføre omvendt transkripsjon ved hjelp av tilfeldige heksamere med et kommersielt sett (Materialfortegnelse).
MERK: Enhver metode for RNA-ekstraksjon eller cDNA-syntese kan brukes9,23,24. - Frys cDNA ved -20 °C til genuttrykksanalysen.
- Cytoskeletal omorganiseringsvurdering i FcγRIIIa-stimulerte NK-celler
- Etter den siste vasken med iskalde medier (trinn 2.8), resuspend cellepellet med 50 μL av 3,7% paraformaldehyd i 10 min ved RT.
- Tilsett 1 ml PBS og spinn ved 135 x g i 5 min på RT. Gjenta denne vasken igjen.
- Tilsett 100 μL 0,1% Triton X-100/PBS i 5 min for å permeabilisere celler, og spinnceller på 135 x g i 5 minutter ved RT til pellets.
- Tilsett 100 μL 5 enheter/ml AF488-merket falloidin fortynnet i 1 % BSA/PBS og inkuber i 20 minutter ved RT.
- Tilsett 1 ml PBS og spinn ved 135 x g i 5 minutter ved RT for å vaske. Resuspend cellepellet i ønsket volum for strømningscytometrisk analyse.
- Vurdering av degranulering av FcγRIIIa-stimulerte NK-celler ved hjelp av CD107a overflatefarging
- Inkuber cellene med antistoffet av interesse på is som beskrevet i trinn 2.1-2.4. Under inkubasjon, lag 50 μL antistoffblanding per prøve. Forbered blandingen i cellemedier med en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml antimenneskelig κ lyskjedeantistoff og 1 μg/ml fluorokrom-merket CD107a.
- Etter inkubasjon av cellene på is, tilsett 1 ml iskalde medier. Spinn ved 135 x g i 5 min ved 4 °C, og vask deretter igjen med 1 ml iskaldt medium.
- Aspirer supernatanten etter siste vask, tilsett deretter 50 μL av den antimenneskelige κ lyskjedeblandingen og inkuber ved 37 °C for de ønskede tidspunktene.
- Ved de ønskede tidspunktene, tilsett 1 ml PBS og spinn ved 135 x g i 5 min ved RT. Aspireate supernatant og tilsett 100 μL 4% paraformaldehyd. Inkuber på RT i 10 min.
- Tilsett 1 ml PBS og spinn ved 135 x g i 5 minutter ved RT for å vaske. Resuspend cellepellet i ønsket volum for strømningscytometrisk analyse.
- Vurdering av kjemokin/cytokinproduksjon fra FcγRIIIa-stimulerte NK-celler
MERK: Ulike metoder og/eller sett kan brukes til vurdering av kjemokin- og cytokinproduksjon.- Etter at tidspunktet for stimulering er nådd (trinn 2.7), plasser straks røret på is og spinn i en nedkjølt sentrifuge ved 135 x g i 5 min ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et rent kar. Frys supernatanten til kjemokin- eller cytokinvurderingen ved hjelp av ønsket analyse.
MERK: Cellepellets kan nå vaskes med iskald PBS og bearbeides for signalering, genuttrykk og cytoskeletale omorganiseringsstudier.
Representative Results
Det er viktig at NK celle renhet er høy fordi Fc delen av antistoffer kan binde FcγRIIIa uttrykt på andre celletyper, for eksempel monocytter. Med høy renhet kan observasjonene som gjøres tilskrives direkte til FcγRIIIa-drevne hendelser i NK-celler. Her hadde NK-celler mer enn 90 % renhet basert på CD56- og CD3-flekker (figur 1). I tillegg var levedyktigheten >95%. Forsiktighet bør utvises ved bruk av isolasjoner med lavere levedyktighet. For å sikre at hendelser ble drevet av FcγRIIIa, ble vestlige flekker for fosfo-AKT (pAKT), fosfo-PRAS40 (pPRAS40) og fosfo-ERK1/2 (pERK1/2) utført, der NK-celler ble aktivert i 1-5 min. Som vist ble det observert en opphopning av disse molekylene (figur 2). På samme måte uttrykte aktiverte NK-celler MIP-1α, MIP-1β, IFN-γ og TNF-α, som vist ved genuttrykksanalyse (Figur 3).
I tillegg ble det observert cytoskeletal omorganisering i aktiverte celler (figur 4). En prosentandel av NK-cellene som ble stimulert i 4 timer, uttrykte CD107a på celleoverflaten (Figur 5). I tillegg ble IFN-γ, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β og RANTES påvist i supernatanten etter 3 timers stimulering (figur 6). Disse avlesningene forventes basert på publiserte studier som aktiverte NK-celler vil ha disse fosforylaterte proteinene, samt genuttrykk og produksjon av nevnte kjemokiner og cytokiner8,9. I alle eksperimenter bør stimuleringsforholdene omfatte en antimenneskelig κ lyskjede bare kontroll og antistoff uten anti-menneskelig κ lys krysskoblingskontroll. Disse NK-cellene skal ikke vise fosfosignalering, deriangulering, kjemokin/cytokinproduksjon eller kjemokin/cytokingenuttrykk.
Figur 1: Representative strømningsprofiler for NK-cellerenhet etter isolasjon fra PBMCer. PBMCer ble isolert fra blod av en sunn donor, etterfulgt av berikelse av NK-celler ved hjelp av en negativ utvalgsmetode for human NK-celleisolasjon (Tabell over materialer). Celler ble farget med CD56 og CD3 før og etter berikelse for å bestemme renhet. Representative prikkplott av CD56 vs. CD3 før og etter isolasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: FcγRIIIa-aktiverte NK-celler viser fosforylaterte signalmolekyler. Celler ble stimulert med rituksimab i 2 min, og cellelysater ble laget i henhold til protokollen. Lysater ble separert på en 4%-12% gel, etterfulgt av overføring til en PVDF-membran. Membranen ble undersøkt med antistoffer mot pAKT, pPRAS40, pERK1/2 og aktin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: FcγRIIIa-aktiverte NK-celler uttrykker kjemokin- og cytokingener. NK-celler ble stimulert med rituksimab i 0 timer, 0,5 t og 1 t. mRNA ble samlet inn, omvendt transkribert og utsatt for qPCR-analyse for MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ og TNF-α (Materialliste). (A) Relativt uttrykk for MIP-1α, MIP-1β og RANTES ved hvert tidspunkt. (B) Relativt uttrykk for IFN-γ og TNF-α på hvert tidspunkt. Verdier ble normalisert til aktingenet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: FcγRIIIa-aktiverte NK-celler viser cytoskeletal omorganisering. NK-celler ble stimulert med rituksimab i 0 min, 5 min, 15 min og 30 min, etterfulgt av vurdering for cytoskeletal omorganisering ved falloidinfarging og strømningscytometri. Forholdet mellom MFI ved eksperimentelt tidspunkt og MFI på tidspunktet 0 av NK-celler stimulert med rituksimab (sirkel, fast linje) eller sekundært antistoff alene (firkantet, prikket linje). Stolper representerer SD for fire replikeringer. Stjerner representerer statistisk signifikans basert på en to-tailed uparret Student t-test (*p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: FcγRIIIa-aktiverte NK-celler uttrykker CD107a. NK-celler ble stimulert med rituksimab i 4 timer etterfulgt av vurdering for degranulering av CD107a og strømningscytometri. (A) Prosentandel av NK-celler som uttrykker CD107a etter stimulering med rituksimab (hvite stenger) eller antimenneskelig κ lyskjedeantistoff (gråstenger) i 0 t og 4 t. (B) CD107a MFI av NK-celler stimulert med rituksimab (hvite stenger) eller antimenneskelig κ lyskjede antistoff (grå stenger) etter 0 t og 4 t behandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: FcγRIIIa-aktiverte NK-celler skiller ut kjemokiner og cytokiner. NK-celler ble stimulert i 0, 0,5, 1, 3 og 6 timer med rituksimab. Supernatant ble samlet inn for å måle frigjøring av MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ og TNF-α ved en strømnings- og perlebasert cytokinvurderingsmetode (Materialliste). (A) MIP-1α, MIP-1β og RANTES produksjon på hvert tidspunkt. (B) IFN-γ og TNF-α produksjon på hvert tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen beskriver metoder for å studere FcγRIIIa-drevne hendelser i NK-celler mediert av antistoffer. Disse teknikkene tillater evaluering av potensielle virkningsmekanismer for terapeutiske antistoffer, som foreslås å være ADCC1,2. Spesielt gir disse metodene fleksibilitet i å studere underliggende molekylære signalveier og cellulære prosesser som er ansvarlige for ADCC. De tillater også observasjon av andre effektorfunksjoner, som kjemokin og cytokinproduksjon. I tillegg tillater disse metodene identifisering av potensielle biomarkører og molekyler som kan være målrettet mot modulering av ADCC.
Grunnlaget for denne protokollen er kunstig stimulering av NK-celler gjennom FcγRIIIa med antistoffer i fravær av målceller. Antistoffbundne målceller tjener vanligvis til å fremme krysskoblingen av Fc-reseptorer for å danne en plattform som driver signalisering og nedstrømseffekter. I stedet oppnås krysskobling ved hjelp av et antimenneskelig κ lyskjedeantistoff i denne analysen, og omgår behovet for målceller for å stimulere NK-cellene. Uten målceller kan resultatene og observasjonene tilskrives direkte til NK-cellene, forutsatt at renseprosessen er vellykket.
Det er viktig at bruk av anti-menneskelig κ lyskjede antistoff for å krysslinke antistoffet ikke forstyrrer bindingsaffiniteten til Fc-delen for FcγRIIIa, en interaksjon som dikterer styrken av respons10,11,12,13. Faktisk har studier vist at afukosylerte antistoffer øker ADCC på grunn av deres økte affinitet for FcγRIIIa10,11,12,13. Påfølgende studier viste at denne økte affiniteten ikke påvirkes av den antimenneskelige κ lyskjede sekundære antistofferstatningen og kan brukes til å studere grunnlaget for økt ADCC8. For å sikre at NK-cellen stimuleres gjennom krysskobling av antistoffet, bør to negative kontroller bare inkluderes: 1) terapeutisk antistoff bare uten sekundært antimenneskets κ lyskjedeantistoff, og 2) bare det sekundære antimennesket κ lyskjedeantistoff. I begge tilfeller bør ingen signal- eller effektorfunksjon genereres.
Denne metoden gir også fleksibilitet til å studere effekten av terapeutiske antistoffer på små molekylhemmere. Inhibitoren kan tilsettes før krysskobling med det sekundære antistoffet slik at inhibitoren har tid til å engasjere sitt mål. Studier bør imidlertid utføres for å bestemme den optimale tiden for forbehandling av inhibitor; Dermed har inhibitoren en maksimal effekt på stimulering. Når det er sagt, kan forskere også velge å studere effekten av en inhibitor etter stimulering. I dette tilfellet kan inhibitoren legges til etter krysskobling for å studere hvordan den påvirker signaler og prosesser som allerede er generert. Sammen gir metoden beskrevet her maksimal fleksibilitet i å studere kombinatoriske effekter av forskjellige små molekylhemmere med terapeutiske antistoffer.
Som nevnt ovenfor kan en rekke avlesninger utføres etter stimulering. Vestlig blotting kan utføres for å studere signalering ved hjelp av SDS-PAGE og membranoverføringssystemer fra ulike leverandører. På samme måte kan genuttrykk også vurderes ved hjelp av ulike RNA-ekstraksjonsmetoder, reverstranskripsjonsreagenser og genuttrykksinstrumenter. Til slutt kan farging for intracellulært eller ekstracellulært protein også utføres der prøver kan analyseres ved hjelp av forskjellige strømningscytometere. For intracellulær cytokin- og CD107a-farging (trinn 3.4, som kan vurderes samtidig), bør monensin og/eller brefeldin A legges til for å maksimere signaler. Vi har brukt forskjellige plattformer for hvert eksperimentelt mål og fortsatt observert lignende resultater. Derfor kan metoden suppleres med ulike reagenser, plattformer og instrumenter, avhengig av studien.
Krysskoblingstiden for stimulering vil avhenge av målet med studien. Hvis signalstudier ønskes, er typisk krysskoblingstimuleringstid mellom 2 min og 10 min. pAKT, pPRAS40 og pERK1/2 akkumuleringsstopper på 2 min og forsvinner etter 10 min8,9. For funksjonelle studier (dvs. de som involverer kjemokin/cytokinproduksjon), må celler stimuleres i minst 30 min, avhengig av analytten9. Genuttrykksanalyse krever også vanligvis 30 min stimulering9. Forsiktighet bør utvises ved bruk av RANTES-genuttrykk som avlesning, da RANTES mRNA-produksjon er uavhengig av transkripsjonell aktivering siden den allerede er lagret i celler for rask oversettelse og frigjøring av protein ved stimulering25. Deriangulering krever derimot minst 3 timers stimulering. Til tross for disse generelle observasjonene, bør forskere utføre kinetiske studier for å bestemme den optimale stimuleringstiden for de spesielle molekylene av interesse.
På samme måte bør forskere titrate antistoffet av interesse for å bestemme den optimale konsentrasjonen fordi antistoffer med forskjellige spesifisiteter binder seg til FcγRIIIa med forskjellige affiniteter, selv om de er av samme isotype. For eksempel er rituksimab og trastuzumab begge en IgG1-isotype, men trastuzumab binder seg sterkere til valinpolymorfismen til FcγRIIIa enn rituksimab26,27. Denne forskjellen i affinitet kan føre til funksjonelle forskjeller, for eksempel degranulering, som observert i publiserte studier8.
Å bestemme den optimale konsentrasjonen er også viktig på grunn av den lave affiniteten Fc-delen av antistoffet har for FcγRIIIa. Dette kan føre til vasking av antistoffet siden protokollen inkluderer vasketrinn etter binding av antistoffet til Fc-reseptoren. Dette kan da føre til manglende følsomhet i analysene som antydet av den lave prosentandelen av CD107a positive celler etter stimulering (Figur 5). Bestemmelse av den optimale konsentrasjonen bør imidlertid gi tillit til at resultatene ikke skyldes mangel på følsomhet. I tillegg aktiveres celler tydelig i de biokjemiske og funksjonelle analysene som bruker bulkcelle i motsetning til enkeltcelleavlesninger (Figur 2, Figur 3, Figur 6).
Protokollen er også begrenset siden den ikke helt etterligner det som skjer fysiologisk. Det sekundære anti-menneskelige K-antistoffet som brukes er å etterligne krysskoblingen generert av målantigen uttrykt på celler. Her legges en mettende mengde sekundært antistoff for å generere maksimal respons. Imidlertid vil distinkte målceller uttrykke forskjellige nivåer av antigen, noe som vil påvirke krysskobling og respons. For tiden er denne plattformen ikke optimalisert for å etterligne effekten av forskjellige antigenuttrykksnivåer.
En annen faktor å vurdere når du utfører disse eksperimentene er donor-til-donor variasjon på grunn av ulike genetiske bakgrunner og immunologiske historier blant enkeltpersoner. Derfor må det utvises forsiktighet ved sammenligning av NK-celleresponser fra ulike givere på tvers av de samme analysene. På samme måte bør det bare gjøres generelle konklusjoner når forskjellige givere brukes.
Til sammen er den beskrevne metoden en enkel og fleksibel stimuleringsplattform for å studere antistoffdrevne FcγRIIIa-medierte hendelser i NK-celler. Det har blitt brukt til å bedre forstå grunnlaget for økt ADCC og effekt observert med afukosylerte antistoffer8. Denne metoden ble også brukt i en studie som kombinerer terapeutiske antistoffer og PI3K små molekylhemmere9. I tillegg ble en tidligere ukjent mekanisme for kjemokin og cytokinproduksjon regulert av pS6 identifisert9. Derfor kan fremtidige studier som bruker denne kunstige signalplattformen ytterligere belyse reguleringsmekanismer for effektorfunksjoner drevet av FcγRIIIa. Det kan også potensielt identifisere nye molekyler som er viktige for disse mekanismene, samt nye roller for kjente molekyler.
Disclosures
Alle forfattere er eller har vært ansatte eller konsulenter for iQ Biosciences.
Acknowledgments
Forfatterne takker James Lee og Christopher Ng for kommentarer og redigering av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
| AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
| B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
| CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
| Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
| FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
| Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
| IFN-? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
| Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
| MIP-1? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
| MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
| NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
| pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
| PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
| RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
| RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
| RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| TNF-? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
| TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
| Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
| β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |
References
- Hudis, C. A. Trastuzumab - Mechanism of Action and Use in Clinical Practice. New England Journal of Medicine. 357 (1), 39-51 (2007).
- Weiner, G. J. Rituximab: mechanism of action. Seminars inHhematology. 47 (2), 115-123 (2010).
- Orange, J. S. Formation and function of the lytic NK-cell immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 8 (9), 713-725 (2008).
- Bonnema, J. D., Karnitz, L. M., Schoon, R. A., Abraham, R. T., Leibson, P. J. Fc receptor stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase in natural killer cells is associated with protein kinase C-independent granule release and cell-mediated cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1427-1435 (1994).
- Jiang, K., et al. Pivotal role of phosphoinositide-3 kinase in regulation of cytotoxicity in natural killer cells. Nature Immunology. 1 (5), 419-425 (2000).
- Kanakaraj, P., et al. Phosphatidylinositol-3 kinase activation induced upon Fc gamma RIIIA-ligand interaction. The Journal of Experimental Medicine. 179 (2), 551-558 (1994).
- Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 14151-14156 (2003).
- Liu, S. D., et al. Afucosylated Antibodies Increase Activation of FcγRIIIa-Dependent Signaling Components to Intensify Processes Promoting ADCC. Cancer Immunology Research. 3 (2), 173-183 (2015).
- Romeo, V., Gierke, S., Edgar, K. A., Liu, S. D. Effects of PI3K Inhibition on Afucosylated Antibody-Driven FcγRIIIa Events and Phospho-S6 Activity in NK Cells. The Journal of Immunology. 203 (1), 137-147 (2019).
- Mössner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Shields, R. L., et al. Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity. The Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
- Shinkawa, T., et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
- Junttila, T. T., et al. Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4481-4489 (2010).
- Goede, V., et al. Obinutuzumab (GA101) plus chlorambucil (Clb) or rituximab (R) plus Clb versus Clb alone in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and preexisting medical conditions (comorbidities): Final stage 1 results of the CLL11 (BO21004) phase III trial. Journal of Clinical Oncology. 31, 15_suppl 7004 (2013).
- Sehn, L. H., et al. Randomized Phase II Trial Comparing Obinutuzumab (GA101) With Rituximab in Patients with Relapsed CD20+ Indolent B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma: Final Analysis of the GAUSS Study. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3467-3474 (2015).
- Pons-Tostivint, E., Thibault, B., Guillermet-Guibert, J. Targeting PI3K Signaling in Combination Cancer Therapy. Trends in Cancer. 3 (6), 454-469 (2017).
- Engelman, J. A. Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nature Reviews. Cancer. 9 (8), 550-562 (2009).
- Fruman, D. A., Rommel, C. PI3K and cancer: lessons, challenges and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (2), 140-156 (2014).
- Janku, F., Yap, T. A., Meric-Bernstam, F. Targeting the PI3K pathway in cancer: are we making headway. Nature Reviews. Clinical Oncology. 15 (5), 273-291 (2018).
- Samuels, Y., et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 304 (5670), New York, N.Y. 554 (2004).
- Kanevskiy, L. M., Telford, W. G., Sapozhnikov, A. M., Kovalenko, E. I. Lipopolysaccharide induces IFN-γ production in human NK cells. Frontiers in Immunology. 4, (2013).
- Romagnani, C., et al. Activation of human NK cells by plasmacytoid dendritic cells and its modulation by CD4+ T helper cells and CD4+ CD25hi T regulatory cells. European Journal of Immunology. 35 (8), 2452-2458 (2005).
- Sivori, S., et al. CpG and double-stranded RNA trigger human NK cells by Toll-like receptors: Induction of cytokine release and cytotoxicity against tumors and dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10116-10121 (2004).
- Hanna, J., et al. Novel Insights on Human NK Cells' Immunological Modalities Revealed by Gene Expression Profiling. The Journal of Immunology. 173 (11), 6547-6563 (2004).
- Swanson, B. J., Murakami, M., Mitchell, T. C., Kappler, J., Marrack, P. RANTES production by memory phenotype T cells is controlled by a posttranscriptional, TCR-dependent process. Immunity. 17 (5), 605-615 (2002).
- Jo, M., Kwon, H. S., Lee, K. H., Lee, J. C., Jung, S. T. Engineered aglycosylated full-length IgG Fc variants exhibiting improved FcγRIIIa binding and tumor cell clearance. mAbs. 10 (2), 278-289 (2018).
- Isoda, Y., et al. Importance of the Side Chain at Position 296 of Antibody Fc in Interactions with FcγRIIIa and Other Fcγ Receptors. PLoS ONE. 10 (10), 0140120 (2015).
