Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lineage Sporing og klonale analyse i udviklingen af hjernebark ved hjælp af mosaik analyse med dobbelt markører (MADM)

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61147
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Science and Technology Austria

Summary

En protokol til at udføre afstamning sporing og funktionel genetisk analyse af kandidat gener på et enkelt celleniveau ved hjælp af mosaik analyse med dobbelt markører (MADM) præsenteres. MADM klonale analyse giver en kvantitativ ramme til at måle proliferativ adfærd, cellulære output, og afstamning forholdet mellem de enkelte stamceller og deres datter celler.

Abstract

Begyndende fra en begrænset pulje af stamfader, pattedyr hjernebarken danner meget organiseret funktionelle neurale kredsløb. Men, de underliggende cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer afstamning overgange af neurale stamceller (NSCs) og eventuel produktion af neuroner og glia i udviklingslandene neuroepithelium er fortsat uklart. Metoder til at spore NSC division mønstre og kortlægge afstamning af klonalt relaterede celler har avancerede dramatisk. Men mange moderne afstamning sporing teknikker lider af manglen på cellulære opløsning af afkom celle skæbne, som er afgørende for dechifrering stamfader celledeling mønstre. Præsenteret er en protokol ved hjælp af mosaik analyse med dobbelt markører (MADM) til at udføre in vivo klonal analyse. MADM manipulerer samtidig individuelle stamceller og visualiserer præcise divisionsmønstre og afstamningsprogression ved hidtil uset enkeltcelleopløsning. MADM-baserede interkromonomiske rekombinationshændelser under G2-X-fasen af mitose giver sammen med tidsmæssigt inducerende CreERT2nøjagtige oplysninger om klonernes fødselsdatoer og deres divisionsmønstre. Madm lineage sporing giver således hidtil usete kvalitative og kvantitative optiske udlæsninger af spredningsmåden for stamcellesvindere på enkeltcelleniveau. MADM giver også mulighed for undersøgelse af mekanismer og funktionelle krav til kandidatgener i NSC lineage progression. Denne metode er unik i, at sammenlignende analyse af kontrol og mutante subkloner kan udføres i samme vævsmiljø in vivo. Her er protokollen beskrevet i detaljer, og eksperimentelle paradigmer til at ansætte MADM til klonal analyse og afstamning sporing i udviklingslandene hjernebarken er påvist. Vigtigere er det, kan denne protokol tilpasses til at udføre MADM klonal analyse i enhver murine stamcelle niche, så længe CreERT2 driveren er til stede.

Introduction

Hjernebarken er en meget organiseret struktur bestående af seks forskellige lag. Cortex indeholder en bred vifte af celletyper, herunder neuroner og glia, som interagerer til at danne funktionelle neurale kredsløb. De fleste, hvis ikke alle, kortikale excitatoriske projektion neuroner og glia er afledt af en fælles pulje af neurale stamceller (NSCs) kendt som radiale glia stamfædre (RGPs)1,2,3. RGPs selv er afledt af neuroepithelial stamceller (NESCs) komponere den tidlige embryonale neuroepithelium. Ved embryonal dag 9 (E9) i mus begynder NESC'er at skifte til RGPs4. RGP afstamning progression kræver præcis tidsmæssig og rumlig regulering, og når denne proces er hindret, alvorlige neurologiske lidelser såsom megalencephaly, microcephaly, lissencephaly, eller funktionsnedsættelser såsom skizofreni og autisme kan resultere5,6. På E10, de fleste RGPs gennemgå symmetriske proliferative divisioner, hvilket resulterer i en udvidelse af neurale stamfade pool4,7. RGPs i sidste ende begynder at opdele asymmetrisk, producerer kortikale projektion neuroner i en tidsmæssigt defineret måde. Gennem på hinanden følgende bølger af neurogenese, nyfødte neuroner migrere ind i kortikale plade danner kortikal laminae med tidlige født neuroner besætter dybe lag og senfødte neuroner bosat i de overfladiskelag 8,9,10. Fordi klonalt relaterede pyramideformede neuroner migrerer radialt ind i cortex med meget lidt tangential dispersion, datterceller tendens til at danne en kolonne eller kegle formet struktur benævnt en neuronal radial enhed4,11,12,13. Ved E17, embryonale neurogene ekspansion er komplet i mus14. RGPs kan også producere ependymale celler og nogle klasser af glia, herunder astrocytter og oligodendrocytes1,15,,16,17,18,19. RGI'ernes potentiale til at give anledning til både neuroner og astrocytter synes at være konsistent i alle kortikaleregioner 18, hvor ca. 1/6 af neurogene RGPs også producerer glia11.

I øjeblikket er de genetiske og epigenetiske faktorer, der regulerer tidsmæssig progression af en stamcelle langs dens afstamning, for det meste ukendte. Tidsmæssige mønstre for genekspression kan have betydelig indvirkning på lineage beslutninger i RGPs20,21,22,23,24. Hvordan dette tæt sammentømrede forhold mellem tidsmæssige og rumlige mønstre fører til den molekylære mangfoldighed af voksne neuronale typer på tværs af kortikale områder vides ikke. Ligeledes er, hvordan det individuelle stamcellepotentiale og dets cellulære output moduleres på celle- og molekylært niveau, et vigtigt ubesvaret spørgsmål. Fremtidige undersøgelser vil forhåbentlig behandle nogle af disse spørgsmål, i sidste ende at udvide vores forståelse af funktionelle kortikale kredsløb dannelse.

Udviklingsmæssige neurobiologi søger at forstå afstamning forholdet, at celler i hjernen deler med hinanden. I første omgang var der meget få forskningsværktøjer til rådighed til dette, og mange tidlige undersøgelser var baseret på visuelle observationer af division mønstre i gennemsigtige organismer såsom Caenorhabditis elegans25. I de seneste årtier er der i de seneste årtier været en dramatisk stigning i antallet og raffinementet af de tilgængeligeteknikker 13,26,27,28,29. Fremkomsten af CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet giver mulighed for syntetisk rekonstruktion af cellelinjerelationer ved at indføre dna-stregkoder, der udviklersig 27,30. To nylige eksempler på stregkodestrategier omfatter brugen af homing guide RNA, der dirigerer CRISPR-Cas9 til specifikke DNA-stregkode loci eller en cytidin deaminase fusioneret med nickase Cas9 at målrette endogene afbrudt gentage regioner31,32. Disse teknologier giver meget multiplekserede tilgange gennem indførelse af stregkoder, der gradvist og stabilt akkumulerer unikke mutationer over tid. Genom redigering tilgange er meget værdifulde, fordi de tillader tilbagevirkende analyse af forholdet mellem to celler baseret på den fælles arv af disse stregkoder. Men for at læse stregkoderne i de enkelte celler, væv normalt skal afbrydes, og derfor oplysninger om position, morfologi, og absolutte celletal fra en individuel stamfader er tabt.

Kombinationsmærkningsparadigme bevarer geografisk information og gør det i princippet også muligt at skelne mellem tæt lokaliserede eller endog overlappendekloner 33,34. For at en afstamningssporingsmetode kan være informativ, skal den mærke de enkelte stamfædre og deres afkom på en sparsom og uudslettelig måde. Især Brainbow35 og Confetti36,37 tilgange bruger stokastiske flerfarvede Cre rekombinering-baserede journalister, der udtrykker en kombination af fluorescerende proteiner fra en enkelt locus. Det omfattende antal samtidige farvekombinationer, der kan opnås in vivo, gør dette til et kraftfuldt værktøj, når du sporer kortikale RGP-kloner ogastrocytter 34. Der er også udviklet transpersoner , der giver stabil genomisk integration af transgenes, derkodner fluorescerende reportere40,og som gør det muligt at spore kortikale forfædre med afstamningaf38,39,kortikale forfædre.33 Transposon-baserede systemer har en ekstra fordel i, at journalisten konstruerer stabilt integrere i genomet, og dermed pålideligt mærke linjeligt relaterede datterceller. For at spore astrocyt slægter specifikt, en række metoder er blevet udviklet, der involverer elektroporation af piggyBac transposases herunder Star Track, som gør brug af en kombination af konstruktioner kodning forskellige fluorescerende proteiner40,42. En anden tilgang, MAGIC markører, introducerer Brainbow vektorer som transposable transgener. Dette er med succes blevet brugt til at spore embryonale neurale og astrocyt stamfader34,43. For nylig, mosaik analyse af dobbelt rekombineret-medieret kassette udveksling (MADR) blev fundet at stabilt mærke mutantceller udtrykker transgene elementer fra præcist definerede kromosomale loci44. Disse kraftfulde in vivo combinatorial mærkning teknikker har givet mange indsigter i afstamning dynamik af stamceller. Disse analyser udføres dog på fast væv, hvilket giver et øjebliksbillede af individuelle kloner på et defineret udviklingsstadiet. For at observere ændringer i enkelte kloners afstamningsdynamik over tid skal der anvendes kroniske in vivo-billeddannelsesmetoder svarende til dem, der udføres i den voksne dentategyrus.

Mosaikanalyse med dobbelte markører (MADM) er en kraftfuld metode til dobbelt farvemærkning , der muliggør in vivo-afstamningssporing af individuelle stamceller imus 46,47. To komponenter er nødvendige for, at MADM-mærkningshændelser kan forekomme: For det første skal MADM-kassetter målrettes mod identiske loci på homologe kromosomer. Kassetter består af to kimære fluorescerende reporter gener, eGFP (grøn, [G]) og tandem dimer Tomat (rød, tdT [T]). GT kassetten indeholder N-endestationen for eGFP og C-endestationen for tdT, adskilt af en intron, der indeholder et loxP-sted. TG kassetten er konstrueret omvendt, med N-endestation af tdT og C-endestation af eGFP. For det andet er det vigtigt at udtrykke Recombinase i den samme celle, der indeholder de målrettede MADM-kassetter. I mangel af Creudtrykker de kimære kassetter ikke funktionelle eGFP eller tdT, fordi deres kodningssekvenser afbrydes. LoxP-stederne tjener som mål for Cre-medieret interkromosom rekombination, hvilket resulterer i rekonstituering af begge udtrykskassetter samtidigt. Hvis der opstår rekombination i G2-fasen af cellecyklussen efterfulgt af X segregation (G2-X), vil de to datterceller hver udtrykke et af de to fluorescerende proteiner. Tidsmæssig regulering af CreERT2-aktiviteten ved hjælp af tamoxifen (TM) giver præcise oplysninger om fødselsdatoen for MADM-kloner og opdelingsmønstrene for deres afkom (figur 1A)29,46,47.

MADM kan potentielt systematisk mærke individuelle kloner med høj enkeltcelleopløsning i musehjernen svarende til traditionelle, men uspecifikke og besværlige metoder som Golgi farvning48 ellerfarvestoffyldning 49. Da det kun er promotoren, der driver CreERT2 , der bestemmer celletypes specificiteten af klonal MADM-mærkning , kan MADM i princippet anvendes til sporing af klonlinjen i alle murineorganer ogvæv 47,50,51,52. Undersøgelser har faktisk allerede anvendt MADM til at afsløre slægtsrelationer hos kloner, der stammer fraforskellige væv 47,50,51,52,53,54,5555,56,57,58,59. MADM eksperimentelle paradigmer er blevet anvendt til at studere afstamning i kortikale projektionsneurner, glia og postnatale stamceller i de udviklende neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM er også blevet anvendt til at studere celleslægte i den voksne dentate gyrus, thalamus, cerebellar granulatceller og interneurner på klonniveau (se tabel 1 for en komplet liste)47,53,54,56,57,66.

Et unikt træk ved MADM er evnen til at genetisk link mutationer distale til en MADM kassette, og dermed skabe en genetisk mosaik (Figur 1B og Figur 2). Dette resulterer i vilde type datter celler mærket med en fluorescerende markør (tdT i figur 1B) og homozygot mutant søskende med den anden (eGFP i figur 1B) i en ikke-mærket heterozygot miljø. MADM er unik i den sammenlignende analyse af kontrol og mutante subkloner kan udføres i samme vævsmiljø in vivo. Oprindeligt, MADM kassetter blev målrettet ind i Rosa26 locus47, men MADM analyse af genfunktion var begrænset til gener distalt for locus. For at overvinde (i hvert fald delvis) denne begrænsning og udvide mulighederne for MADM-baserede genanalyser blev MADM-kassetter slået ind tæt på centromere af Chr. 751, Chr. 1146og Chr. 1251. Målretning alle 19 mus autosomes med MADM kassetter er i gang, og vil give mulighed for stort set ethvert gen, der skal undersøges i fremtiden, hvilket giver en enestående platform for studiet af udviklingsmæssige afstamning relationer i kombination med funktionel genetisk analyse.

Protocol

Museprotokollerne blev gennemgået af den institutionelle prækliniske kernefacilitet (PCF) og det interne etiske udvalg i IST Austria. Alle avls- og forsøgsforsøg blev udført i henhold til en licens, der var godkendt af det østrigske forbundsministerium for videnskab og forskning i overensstemmelse med østrigsk og EU's dyrelovgivning.

1. Avl af eksperimentelle mus til MADM-klonal analyse

  1. Konfigurer tidsståede eksperimentelle MADM-parringer (>P56; CD-1) i den sene eftermiddag (05:00) og kontrollere for vaginal stik proceduren morgen (08:00). Om morgenen stikket er til stede tæller som dag 0,5. Se figur 2 for at få et overblik over den eksperimentelle opsætning af muse parring. Sørg for, at tidspunkter for TM-induktion af CreERT2-aktivitet og -analyse er egnede til at behandle eksperimentelle spørgsmål.
    BEMÆRK: For yderligere oplysninger henvises til figur 3 og repræsentative resultater nedenfor.
  2. Til postnatal prøveudtagning skal der oprettes avler til at generere plejemødre parallelt.
    BEMÆRK: Disse skal startes op til 1-2 dage før opsættelse af forsøgsavler.

2. TM induktion i MADM mus

  1. Forbered en 20 mg/ml TM arbejdsopløsning ved at opløse det i majsolie i en 15 ml eller 50 ml konisk centrifuge rør og placere den på en vuggende platform for ~ 4 timer ved stuetemperatur (RT), sikre TM er helt opløst. Opbevar arbejdsopløsningen ved 4 °C dækket med aluminiumsfolie og anvendes inden for 2 uger.
  2. For at fremkalde MADM-rekombinationshændelser skal du levere en enkelt injektion af TM intraperitonealt (IP) ved hjælp af en 1 ml tuberkulinsprøjte og en 25 G nål i en tidsindfriet drægtige dæmning. Afhængigt af den fase af kortikal neurogenese, injicere TM mellem E10−E15 med en dosis på 1−2 mg/gravid dæmning. Ved tidlige tidspunkter (dvs. E10) skal du bruge højst 1 mg/drægtig dæmning (25 mg/kg) for at undgå komplikationer under graviditet11. For tidspunkter mellem E11-E15 anvendes 2 mg/drægtige moderdyr (50 mg/kg)7.
    BEMÆRK: Alternativt kan TM administreres med en oral sonde til sene graviditeter.
  3. For MADM klonale analyse til postnatale timepoints, inddrive levende embryoner på E18−E19 gennem kejsersnit, og derefter hæve hvalpe med en plejemor.
    BEMÆRK: Afhængigt af den gravide kvindes helbredstilstand er det måske ikke nødvendigt at udføre en kejsersnit, men det er stadig nødvendigt at hæve hvalpe med en plejemor, fordi den oprindelige TM-behandlede mor kan have problemer med at ammende.
  4. For at genvinde levende embryoner ved kejsersnit eller for at hente embryonale tidspunkter til analyse, ofre den gravide dæmning ved livmoderhalskræft dislokation.
  5. Dyret sættes i liggende stilling og desinficeres pels med 70 % ethanol. Lav et lille snit i huden i underlivet over livmoderen ved hjælp af kirurgiske brystben og saks. Lav et andet snit gennem musklerne og bugen muskuløs væg til at afsløre bughinden.
  6. Fjern livmoderen ved at adskille fra det omgivende væv med en saks. Overfør intakt livmoder på en handske fyldt med varmt vand for at øge embryonens overlevelsesrate, indtil hver er fjernet fra amnionen individuelt.
  7. Brug fine spidse saks og fingre til omhyggeligt at åbne livmodervæggene til at frigive embryoner. Skær ikke navlestrengen for tæt på kroppen for at forhindre omfattende blodtab. Hvis embryoner skal anvendes til analyse, fortsættes til trin 3.9. Hvis hvalpene skal plejes, skal du fortsætte til trin 2.8.
  8. Hvis fremme er påkrævet, rense hvalpene, før du overfører dem til plejemoderen. Mens rengøring hvalpene, forsigtigt trykke på brystet fra tid til anden for at indlede vejrtrækning. Placer tilbage på en anden handske fyldt med varmt vand for at forbedre overlevelsesraten.
    BEMÆRK: Det er vigtigt forsigtigt at fjerne eventuelle resterende amnion og / eller moderkagen med en køkkenrulle.
  9. Før du overfører hvalpe til plejemoderen, skal du fjerne plejemoderen fra sit bur, fjerne de oprindelige hvalpe og erstatte de eksperimentelle hvalpe. Sæt plejemoderen tilbage i buret.
    BEMÆRK: Se diskussion for yderligere forslag til at forbedre fremme accept satser.
  10. Hvis genotypebestemmelse er påkrævet, indsamle tå eller hale biopsier mellem P6−P8.
    BEMÆRK: Udfør kun dette trin, hvis dyreforsøgslicenser godkender denne praksis.

3. Vævsforberedelse til MADM-kloner i hjernen

BEMÆRK: For forsøg, der omfatter postnatalt væv (≥P4), skal du fortsætte til trin 3.1. For embryonale tidspunkter og tidlige postnatale (P0−P3) fortsættes til trin 3.9.

  1. Det eksperimentelle MADM-dyr kan aneres med en IP-injektion af en ketamin/xylazin/acepromazinopløsning (henholdsvis 65 mg, 13 mg og 2 mg/kg kropsvægt) og bekræfte, at musen ikke reagerer ved at klemme bagpoten.
    BEMÆRK: Både mandlige og kvindelige MADM-mus (CD-1-baggrund) anvendes til analyse. Hvis genotypebestemmelse er påkrævet, indsamle øre biopsier på dette punkt.
  2. Placer det anæstede dyr i liggende stilling på perfusion kirurgi bakken og desinficere pels med 70% ethanol. For at begynde operationen, omhyggeligt foretage et snit med saks og kirurgiske brystmuskter gennem det ydre lag af huden og derefter et andet snit gennem muskellaget. Løft spidsen af brystbenet og skære bindevæv på siderne, tage ekstra forsigtighed for at undgå at skære leveren. Brysthulen vil være synlig.
  3. Klip mellemgulvet og løft for at afsløre hjertet. Trim forsigtigt brystkassen og stiften til den kirurgiske bakke for at eksponere hjertet. For hvalpe, fjerne brystkassen helt.
  4. Sæt en nål med fosfat buffered saltvand (PBS) i nederste venstre ventrikel (lysere væv). Ved hjælp af små iris saks gøre et snit til den bageste ende af højre atrium (mørkerødt væv) for blodet at dræne.
  5. Perfusion udføres med PBS efterfulgt straks af frisklavet, iskold 4% paraformaldehyd (PFA) tilberedt i PBS. Til unger (P4−P10) skal der anvendes sprøjter til at udføre perfusion. Fyld en sprøjte med 10 ml PBS og en anden med 10 ml PFA. Sørg for, at alle luftbobler i sprøjterne er fjernet. For ældre dyr, bruge en peristaltisk pumpe.
  6. Persing med PBS (10 ml ved 2−4 ml/min. i hvalpe; 20 ml ved 4−6 ml/min. for voksne, der anvender en peristaltisk pumpe). Leveren bliver klar og lysegul, hvis nålen er placeret korrekt.
  7. Når nålen er færdig, fjernes nålen fra ungerne, og nålen, der indeholder PFA, i samme hul. For voksne skal den peristaltiske pumpe stoppes, før PBS-opløsningen udskiftes med iskold PFA, og undgå bobler i optagelsesslangen. Genoptag perfusing med PFA (10 ml ved 2−4 ml/min i hvalpe; 30 ml ved 4−6 ml/min. for voksne ved hjælp af en peristaltisk pumpe).
  8. Når perfusion er færdig, halshugge musen og fjerne hjernen gennem omhyggelig dissektion. Overfør hjernen til 4% PFA. Brug mindst 5 gange hjernens volumen (dvs. ~5−10 ml PFA i et 15 ml konisk centrifugerør) og inkuber natten over ved 4 °C for fiksering efter maksimalt samme for at sikre fuldstændig fiksering af væv. Fortsæt til trin 3.10.
  9. For embryonale væv og tidligt postnatalt væv (dvs. P0−P3), efter at have udført en kejsersnit, halshugge embryonerne med en saks. Hvis genotypebestemmelse er påkrævet, opsamles halen af embryonet på dette tidspunkt. Duker straks hjernen og overføres til en 12 brøndplade, der indeholder 2-3 ml 4% PFA/well. Inkuber natten over ved 4 °C for efterfiksering.
  10. Næste morgen udveksles PFA med 10 ml (voksen) eller 2−3 ml (embryo) PBS og gentages 3x i 15 min ved RT. Overfør væv til 30% saccharoseopløsning i fosfatbuffer (PB) og opbevar ved 4 °C på en gyngeplatform, indtil vævet synker i opløsningen.
  11. Indlejre hjernen i optimal skæretemperatur (OCT) sammensatte i en indlejring skimmel, passe på at orientere hjernen for enten koronale eller sagittal skæring. Frys ved at placere indlejringsformen på tøris, indtil OCT bliver helt uigennemsigtig (~10−15 min). Opbevar væv ved -80 °C indtil videre brug.

4. Forberedelse af MADM-væv til immunhistokemi

  1. Fastgør vævsblokken til prøvedisken i kryostaten ved at påføre disken en ring af OLT og placere blokken direkte i OLT, når den begynder at fryse. Sørg for, at blokken er korrekt orienteret til det ønskede skæreplan.
    BEMÆRK: Her er koronalsektion for at undersøge kortikale MADM-kloner beskrevet i detaljer.
  2. Bloktemperaturen indstilles til -21 °C i kryostaten til -20 °C og klingetemperaturen til -21 °C.
  3. Lad vævsblokken tilpasse sig kammertemperaturen ved at montere prøvedisken på prøveholderen og lad den være i kryostat i ~5 minutter, før sektionen påbegyndes.
  4. Trim blokken i tykke sektioner (45−60 μm), indtil det pågældende vævsområde er nået.
  5. Når kanten af cortex er klart synlig, stop sektionen og låse bladet. Sørg for, at klingen er afskærmet, før blokken trimmes.
  6. Trim overskydende OLT omkring vævet med en klinge, forlader ~ 1−2 mm OLT på alle sider af hjernen.
  7. Næste orienter blokken, så en af de laterale kanter af cortex er orienteret nedad og den anden opad (dvs. den mest rostral kant af cortex er pegede til højre).
  8. Sektionen påbegyndes med en tykkelse på 45 μm for voksne kloner og 30 μm for embryonale kloner. Udfør hver sektion individuelt og bruge en lille børste til at holde området under kniven ren for eventuelle rester tilbage, mens trimning blokken.
    BEMÆRK: Hvis dette ikke gøres, og en sektion falder, kan det være svært at bestemme den korrekte rækkefølge af udsnittene.
  9. Hvis sektionerne begynder at krølle, skal du trimme blokkens kanter og/eller forsigtigt justere glas antirollpladen.
  10. Til embryonal klonanalyse monteres sektioner direkte på et matteret dias. Der tørres på en varmeplade ved 37 °C, før du fortsætter direkte til trin 5.6.
    BEMÆRK: Flere sektioner kan føjes til ét dias, men sørg for, at rækkefølgen opretholdes.
  11. For at indsamle voksne kloner, forberede 24 godt plader, der indeholder 1 ml PBS / godt (typisk, 5−6 plader pr hjerne). Startende fra den første brønd, med kolde krafter indsamle individuelle serielle sektioner i PBS i rækkefølgen af sektionen.
    BEMÆRK: Den flydende sektion metode er vedtaget for voksenvæv for at sikre, at ingen sektioner er savnet, og at monterede sektioner indeholder ingen rynker.
  12. Stop sektionen, når slutningen af neocortex er nået.
  13. For voksne kloner, fortsæt til montering flydende sektioner.
    BEMÆRK: Sektioner kan opbevares i PBS ved 4 °C i op til 24 timer.

5. Montering af voksenvæv til billeddannelse

BEMÆRK: Følgende værktøjer er påkrævet: lille pensel, petriskål, PBS med 0,5% Tween (PBS-T), vedhæftning dias ( Tabel overmaterialer), montering medium (Tabel over materialer), coverslips, og pincet.

  1. Fyld en petriskål med PBS-T.
    BEMÆRK: Vaskemiddel bruges til at støtte i monteringsprocessen. Hvis farvning for yderligere antigener, der er følsomme over for rengøringsmidler (dvs. glycoproteiner) er nødvendig, er det bedst at springe tilsætningen af Tween.
  2. Ansæt et vedhæftningsglas i PBS-T,så det næsten er dækket op til etiketten.
  3. Overfør den første sektion til PBS-T.
  4. Ved hjælp af en lille pensel, manøvrere afsnittet på diaset og arrangere det for at bevare rækkefølgen af skæring. Fortsæt på samme måde med alle yderligere afsnit.
  5. Når alle sektioner er på plads, skal du placere sliden (~12-16 sektioner/dias) i et mørkt slidekammer. Løft låget en smule, så sektionerne kan tørre helt (~10−20 min), og sørg for, at de forbliver klæbende i de efterfølgende trin.
  6. Hvis der udføres immunhistokemi for yderligere antigener, skal du gå direkte til afsnit 6 eller 7.
    BEMÆRK: For embryonale tidspunkter er det nødvendigt at udføre immunsående trin i mindst gfp og tdt (afsnit 6). For voksne kloner er dette kun nødvendigt, hvis farvning for yderligere antigener parallelt (afsnit 6 og 7).
  7. Rehydreres og vaskes, og sektionerne 1x med 1x PBS i 5 min. fjernes for at fjerne resterende PBS-T. Påfør ~ 1 ml 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) fortyndet i 1x PBS (1 μg/ml) på diaset, sikre, at alle sektioner er dækket og inkubere i 15 min.
  8. Fjern forsigtigt DAPI'en og vask 1x med 1x PBS i 5 min. Fjern overskydende PBS og tør i ~1−2 min. før indlejring i 110 μL monteringsmedium. Forsegl med en 24 x 60 mm overtrækslip, og lad den tørre i mindst 3 timer før billeddannelse.

6. Immunstønde for gfp og tdt kun

BEMÆRK: Dette afsnit er nødvendigt for embryonale kloner.

  1. Anvend objektglas vandret i et befugtet glideskrænet kammer. Marker glidegrænser med en voksmarkør for at minimere den mængde buffer, der kræves.
  2. Rehydrere sektioner med 1x PBS. For at forbedre farvning kvalitet, arbejde med frisk sektionsdelt væv.
  3. Der tilsættes 250−400 μL blokerende buffer (0,5% Triton X-100, 2−3% normalt æselsserum i 1x PBS) pr. dias, hvilket sikrer, at alle sektioner er dækket. Inkubere i 1 time.
    BEMÆRK: Koncentrationen af vaskemiddel (Triton X-100 eller Tween-20) vil variere afhængigt af de yderligere primære antistoffer, der anvendes, fordi nogle antigener er mere følsomme over for rengøringsmidler end andre.
  4. Fjern blokeringsbufferen, og tilsæt primære antistoffer i blokeringsbufferen til diaset (300−400 μL/dias).
    BEMÆRK: Et eksempel på en primær standardantistofreaktion for anti-GFP/anti-tdT (MADM) kunne bruge kylling anti-GFP (1:500) og kanin anti-RFP (1:500).
  5. Inkuberes med primære antistoffer natten over ved 4 °C.
    BEMÆRK: Objektglassene skal inkuberes perfekt vandret med buffer, der dækker alle sektioner. Ellers kan ujævn eller dårlig farvning resultere.
  6. Kontroller næste morgen, at blokeringsbufferen med primære antistoffer stadig dækker alle sektioner på diaset. Hvis ikke, gentages inkubationstrinnet i 3−4 timer ved RT.
  7. Fjern primære antistoffer og vask 4x med 1x PBS i 10 min ved RT.
  8. Der tilsættes sekundære antistoffer, der fortyndes i blokerende buffer for at glide (300−400 μL/dias): Alexa Fluor 488 anti-chicken IgG (1:500) og Cy3 anti-rabbit IgG (1:500).
  9. Inkuberes ved RT i 2 timer. Hold objektglas dækket af lys for at forhindre blegning af fluorofores.
  10. Sekundærantistoffer fjernes og 2x vaskes med 1x PBS i 10 min.
  11. Inkuberes med DAPI fortyndet i PBS (1:5.000) i 15 min.
  12. Vask sektioner 1x med 1x PBS i 10 min.
  13. Fjern overskydende PBS og tør i ~1−2 min. før indlejring i 110 μL monteringsmedium.
  14. Tætning med 24 x 60 mm overtrækslip og lad tørre i mindst 3 timer før billeddannelse. Billedet glider inden for 1−2 uger efter immunhistokemi for at sikre optimalt signal.

7. Immunostaining for gfp, tdt og yderligere antigener

  1. Udfør trin 6.1−6.3.
  2. Fjern blokeringsbufferen, og tilsæt primære antistoffer i blokeringsbufferen til diaset (300−400 μL/dias).
    BEMÆRK: Når farvning for tre eller flere antigener (dvs. gfp, tdt og et protein af interesse) og antistoffet for det beskyttede protein blev rejst hos kaniner, anbefales det at bruge anti-tdT (ged) primært antistof ved en fortynding på 1:500. Et eksempel på en primær antistofreaktion for tre antigener med alternativ tdT farvning kunne bruge kylling anti-GFP (1:500), ged anti-tdT (1:500), og antistof mod protein af interesse (dvs. kanin).
  3. Udfør trin 6.5−6.7.
  4. Tilføj en sekundær antistofblanding fortyndet i blokerende buffer til at glide (300−400 μL/dias): Alexa Fluor 488 anti-kylling IgG (1:500), Cy3 anti-goat IgG (1:500), og Alexa Fluor 647 anti-kanin IgG (1:500).
  5. Udfør trin 6.9−6.14.

8. Confocal image erhvervelse og kvantificering af MADM kloner

  1. Identificer og dokumentere hjernesektioner, der indeholder kloner og deres placeringer i cortex.
    BEMÆRK: Antallet af sektioner en klon spænder vil variere afhængigt af hvornår klon blev induceret, CreERT2 driver, og tidspunktet for analysen. Dette trin kan udføres på enten et konfokalt mikroskop eller et epifluorescensmikroskop.
  2. Brug et omvendt konforossisk mikroskop, begynd med at vælge og konfigurere de korrekte laserlinjer og filtre. For MADM-hjerner vælges DAPI, GFP og tdT (excitation: henholdsvis 358 nm, 488 nm og 554 nm; peak emission: 461 nm, 507 nm og 581 nm). Sørg for, at pinhole er indstillet til 1 luftig enhed for optimal billedkvalitet.
  3. For konfolende specifikke indstillinger, billedkloner med en 20x målsætning og 1x zoom. For billeder, der skal bruges i kvantificeringer, skal du bruge en scanningshastighedspixeldyneværdi på 1,52−2,06 μs (værdier 7−8 i billederhvervelsessoftwaren) uden gennemsnit. Juster laserintensiteten, og få dem for hver kanal efter behov.
    BEMÆRK: Afhængigt af den nødvendige billedkvalitet kan indstillingerne for scanningshastighed og gennemsnit variere.
  4. Når klonen er tydeligt identificeret, arrangere billeddannelse fliser til at dække alle relevante sektioner i klon. Juster z-stakken, så alle MADM-mærkede celler i klonen registreres med et interval på 1,5 μm/z-staksnit. Juster fliseområdet, så hele cortex-bredden fanges, når klonen billeddannelse (dvs. fra pial overflade til corpus callosum).
  5. Billedpersonlige kloner, der spænder over flere sektioner fortløbende, og sikrer, at alle sektioner uden celler i en klon stadig afbildes med henblik på 3D-rekonstruktion og korrekt fortolkning af cellevisalige oplysninger.
  6. Analyser hvert afsnit, der indeholder celler i en MADM klon sekventielt fra rostral til den caudale ende af cortex. Skelne individuelle neuroner og glia baseret på deres morfologi og / eller markør farvning. Optag positionsoplysninger parallelt baseret på de respektive laggrænser, der er defineret ved nuklear farvning (DAPI).
    BEMÆRK: Se figur 4 for repræsentative resultater for embryonal analyse og figur 5 for repræsentative resultater for voksenanalyse.

9. Seriel 3D-rekonstruktion af kloner

BEMÆRK: 3D-rekonstruktionen af individuelle kloner afbildet over serielle hjernesektioner er nyttig til visuel visning samt analyse af 3D-kloniske arkitekturer og kan udføres i henhold til følgende trin.

  1. Stitch og sikring confocal flisebelagte billeder baseret på erhvervelse parametre ved hjælp af billede erhvervelse software. Åbn .czi-filen, og kør derefter metoden Stitching under fanen Behandling i ZEN-softwaren (Zeiss).
  2. Eksporter syede billedstakke som individuelle z-planer i TIFF-format. Åbn den syede .czi-fil, og kør derefter metoden Image Export under fanen Behandling. For multikanalbilleder skal du eksportere som rød/grøn/blå billeder til efterfølgende billedbehandling.
  3. Gentag trin 9.1 og 9.2 for hver seriel hjernesektion i en klon.
    BEMÆRK: For nøjagtig 3D-rekonstruktion skal alle hjernesektioner i en klon, herunder dem uden mærkede celler, også behandles.
  4. Sammenkæde individuelle billeder i en enkelt stak i rækkefølge fra den mest rostral til den mest caudal z-plan ved hjælp af open source billedbehandling software såsom ImageJ / Fiji67,68.
    BEMÆRK: Alle blanke billeder i kanterne af hver hjernesektion skal fjernes på dette tidspunkt.
  5. Hvis det er nødvendigt, skal du rette den billedstak, der er opnået fra trin 9.4, for forkert justering ved hjælp af et ImageJ-plugin kaldet "MultiStackReg" ved at følge trin 9.5.1−9.5.5. Hvis billedjustering ikke er påkrævet, skal du fortsætte til trin 9.6.
    BEMÆRK: Dette plugin udfører billedjustering af kanalen med højeste kontrast (normalt DAPI) og anvender derefter den registrerede transformation til de andre kanaler, hvilket giver mulighed for pålidelig billedjustering af multikanalstakke. Et ekstra plugin kaldet "TurboReg" skal forudinstalleres.
    1. I ImageJ skal du installerepluginsne " MultiStackReg" og "TurboReg".
    2. Åbn billedstakken af klonbilleder, der er hentet fra trin 9.4, og som skal justeres. Opdel kanaler i DAPI (blå), GfP (grøn) og tdT (rød) under indstillingen Farve under fanen Billede.
    3. Kør "MultiStackReg" plugin for at justere DAPI-kanalen med transformationen "Rigid Body" og gemme transformationsfilen.
    4. Anvend den gemte transformationsfil på de to andre kanaler ved hjælp af "MultiStackReg".
    5. Flet alle tre justerede kanaler, og gem justeret stak.
  6. For at orientere klonen i ImageJ rotere stak af klon billeder opnået fra trin 9.4 (eller trin 9.5.5 efter justering) i en lodret orientering med pial overflade på toppen og corpus callosum i bunden. Beskær i xy-planet, hvis det er nødvendigt.
  7. Ved både kvalitativ præsentation og kvantitativ analyse skal du generere et maksimalt z-projektionsbillede (trin 9.8) eller udføre 3D-gengivelse (trin 9.9) af klonen.
  8. Åbn billedstakken fra trin 9.6 i ImageJ, og vælg Z-projektion med projektionstypen Maks. Dette vil generere et billede af hele klonen projiceret på samme plan.
  9. Åbn billedstakken fra trin 9.6 i ImageJ, og vælg 3D Project z-funktion for at generere en 3D-visualisering af klonen, der kan roteres.
    BEMÆRK: Det er vigtigt i dette trin at indtaste det korrekte udsnitsinterval svarende til tykkelsen af de enkelte z-stakke under billederhvervelse. Interpolationsværktøjet skal bruges til at fjerne mellemrum mellem udsnit.

Representative Results

MADM resulterer i rekonstitution af funktionelle grønne og røde fluorescerende proteiner med to datterceller, der hver udtrykker et af de to fluorescerende proteiner ved G2-X-kromosomadskillelseshændelser (figur 1A). Da MADM-hændelser resulterer i permanent og tydelig mærkning af de to efterkommere, kan der foretages en kvantificerbar vurdering af grønne og røde dattercelleslæder (subklonner). Variabler, herunder divisionsmønster (f.eks. symmetrisk versus asymmetrisk) og potentiale (f.eks. antallet af afkom) i den oprindelige stamfader, kan bestemmes.  Kvantificering af hvert fluorescerende mærket subklon er informativt, når det med tilbagevirkende kraft afgøres, om den oprindelige stamcelle gennemgår symmetriske proliferative inddelinger eller asymmetriske, neurogene inddelinger på tidspunktet for TM-induktionen. Tidligere undersøgelser grupperede Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2 afledte excitatoriske projektionskloner i cortex i to bredeklasser 7,11,46. Den første, kaldet "symmetriske proliferative kloner", er sammensat i gennemsnit af et betydeligt antal neuroner, med både grønne og røde subkloner, der indeholder fire eller flere neuroner hver. Den anden gruppe, "asymmetriske kloner" definerer en klasse af kloner, hvor "mindretal" subklon indeholder færre end tre neuroner og "flertal" subklon, fire eller flere11. Disse definitioner er specifikke for kortikale RGPs og kan være nødvendigt at revidere for andre hjerneregioner og væv. For begge klasser af kortikale kloner, vil afkommet blive fordelt over de overfladiske og dybe lag.

Ved udformningen af MADM-klonale undersøgelser er der en række aspekter, der skal tages i betragtning. Det tidspunkt, hvor MADM-hændelser fremkaldes ved administration af TM, er en vigtig overvejelse (figur 3). For kortikale excitatoriske projektion neuron MADM kloner (dvs. ved hjælp af Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2) på E10, var næsten alle RGI'er stadig under symmetrisk division11. Derfor, induktion på E10 med TM fanget flere runder af proliferative RGP forstærkning og resulterede i kloner med høje neuron numre. Antallet af RGI'er på E10 var dog generelt lille, og dermed genererede TM-administrationen meget få MADM-hændelser (nogle gange mindre end én pr. hjerne). Størstedelen af RGI'erne skiftede fra symmetriske til asymmetriske neurogene divisioner omkring E12. At målrette strengt asymmetriske neurogene kloner, var det bedst at fremkalde på E12 eller senere (Figur 3). Tiden mellem TM induktion og observation AF MADM-rekombinationshændelser i cortex havde en tendens til at være mindre end 24 h. IP-injektioner var den foretrukne metode til administration af TM på embryonale stadier for denne metode, fordi det førte til større reproducerbarhed ved klonal induktion. Det er også vigtigt at holde TM dosis til et minimum af to grunde. For det første, hvis MADM rekombination sats stiger, sandsynligheden for at fremkalde flere, måske overlappende, kloner er højere. For det andet, hvis for meget TM er leveret, en øget sats af abort, embryo reabsorption, og mindre kuld størrelser kan observeres. Aborter i ca. halvdelen af alle drægtige moderdyr blev observeret, når TM injektioner blev leveret på E10. Denne frekvens faldt fra E11 og fremefter og faldt til ca. 1/3 af drægtige dæmninger, der aborterede. For en oversigt over TM doser, induktion gange, og CreERT2 drivere, der anvendes i tidligere MADM undersøgelser, henvises til tabel 1. Reporter aktivitet i mangel af TM blev observeret med nogle TM-inducerende CreERT2 drivere69. Ektopisk udtryk eller MADM rekombination begivenheder i mangel af TM blev ikke observeret med Emx1-CreERT2 af Nestin-CreERT2 drivere. Dette kan delvis skyldes, at TM-medieret kromosomale trans-rekombinationer forekommer på ca 1:1,000 til 1:10,000 lavere frekvens end cis-rekombinationer, hvilket reducerer sandsynligheden for ektopisk MADM mærkning.

En anden faktor, der skal overvejes, når der planlægges et MADM-analyseanalyseeksperiment, er undersøgelsens varighed. Hvis længden af tiden mellem TM-induktionen og det tidspunkt, hvor forsøget blev analyseret (A ( tidsvindue), varieres, viser stamcelledynamikken overtid 64. Korte embryonale tidsvinduer (dvs. TM/E11-A/E13; TM/E11−A/E16) fangede dynamikken i embryonal neurogenese (Figur 4). Sammenligning af kloner fra to eller flere tidsvinduer giver et kvantitativt indblik i antallet af producerede celler, og hvordan neuronfordelingen varierer på forskellige stadier af afstamningsprogression64. For at fange hele potentialet i de enkelte kloner er det nødvendigt at forlænge tidsvinduet, der analyseres til tidspunkter7,11,12. Eksempler på neokorte kloner, der fremkaldes i embryonet og analyseres hos voksne, er vist i figur 5. Bemærk, kortikal neurogenese er for det meste afsluttet og gliogenese stiger med E17. Ca. 1/6 neurogen RGP fortsætter også med at generere astrocytter og/eller oligodendrocytes11.

Symmetriske kloner opstår , når RSP'er gennemgår en eller flere runder af proliferativ division11. RGP-kloner fremkaldt mellem E10−E12 var i gennemsnit større og gav mere rumlige træk ved den endelige neuronfordeling (figur 4A-C). Kloner med neuroner relativt ligeligt fordelt i dybe og overfladiske lag tog på en "cylinder" form, mens kloner med neuroner mere spredt i overfladiske lag end dybere lag udviklet en "kegle" form11. For fuldt ud at fange de rumlige og morfologiske oplysninger om en klon, var det nødvendigt at beregningsmæssigt rekonstruere hver klon ved hjælp af sekventielle billeder. For at måle klonlig dispersion blev den maksimale laterale dispersion (målt i alle dimensioner) i overfladiske lag (LII−VI) af en klon sammenlignet med neuron dispersion i dybe lag (LV/LIV). Dette forhold (fordeling øvre:fordeling lavere) gav en kvantificerbar udlæsning af den samlede klon form.

Asymmetriske kloner, hvor mindretallets underklude var tre eller mindre, gav indsigt i den neuronale produktion af en enkelt RGP (Figur 4D-F og Figur 5A-F)7,11,12. Størstedelen af populationen (store subklon) kunne mærkes enten i rødt eller grønt med et gennemsnit på ca. syv excitatoriske projektionsneurner pr. klon , når de fremkaldes ved hjælp af en Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2(figur 5G)7,11,12. Det samlede antal celler i en MADM-klon kan dissekeres yderligere ved at analysere fordelingen af neuroner i den store underklon på tværs af overfladiske og dybe lag. Minoritetspopulationen (lille underklon) var mærket med den gensidige farve og var i gennemsnit 1-2 celler pr. klon (figur 5H). Den samlede "enhedsstørrelse", som i gennemsnit var 8−9 neuroner, kunne beregnes ved at lægge de små og store subkloner sammen (figur 5I)7,11,12. Det er vigtigt at bemærke, at mens den neuronale produktion af RGI'er var meget forudsigelig, var der en grad af klonal heterogenitet12,70.

Indførelse af en mutation distalt til MADM kassetten gør det muligt at generation af genetiske mosaikker, hvilket giver en unik metode til at dissekere de molekylære regulatorer af stamcellelinage progression. Som sådan, MADM giver en enestående eksperimentel platform til at studere celle-autonome funktion af et gen (f.eks dens tilknytning til microcephaly eller macrocephaly). Ved at sammenligne kloner induceret i en MADM genetisk mosaik til kloner induceret i en kontrol MADM, en yderst kvantitativ udlæsning af ændringer i neuron numre og fordeling kan genereres. Tidligere MADM-baserede undersøgelser kvantificerede otx1's celle autonome funktion ved mikrocephalydannelse på klonniveau (se figur 6A-E for et repræsentativt eksempel)11. I en anden undersøgelse, MADM klonale analyse viste, at NDEl1 ikke celle-autonomt regulere projektion neuron numre, men i stedet evne til nyfødte neuroner til at komme ind eller migrere inden for kortikale plade, som senere danner den voksne cortex46. Disse undersøgelser viste den meget kvantitative karakter af MADM klonale analyse i at studere de celle-autonome funktioner af gener, der regulerer kortikal udvikling. Der er i øjeblikket ingen eksempler i litteraturen ved hjælp af MADM til at studere gener impliceret i makrocephaly på klonale niveau. Men i fremtidige undersøgelser kan analyse af gener, der er relevante for kontrollen af kortikal størrelse i almindelighed, give meget ønskværdig indsigt på molekylært og cellulært niveau.

Figure 1
Figur 1: MADM-princippet for afstamningssporing og klonanalyse på enkeltstamcelleniveau. (A) For at udføre afstamningssporing og klonal analyse med MADM, skal der være to komponenter til stede. For det første skal MADM kassetter målrettes til identiske loci på homologe kromosomer. Kassetter består af to kimære fluorescerende reporter gener, eGFP (grøn, [G]) og tandem dimer Tomat (rød, tdT [T]). GT kassetten indeholder N-endestationen for eGFP og C-endestationen for tdT, adskilt af en intron, der indeholder et loxP-sted. TG kassetten er konstrueret omvendt, med N-endestation af tdT og C-endestation af eGFP. For det andet skal udtrykket cre rekombiner forekomme i den celle, der indeholder de målrettede MADM-kassetter. LoxP-stederne fungerer som et mål for Cre-medieret interkromotermisk rekombination, hvilket resulterer i rekonstituering af begge udtrykskassetter samtidigt. Hvis der forekommer rekombination i G2-fasen efterfulgt af X segregation (G2-X), vil de to datterceller udtrykke et af de to fluorescerende proteiner. B)MADM-princippet for genetisk mosaikanalyse på et enkelt klonniveau. Mutant alleler (punktmutationer, sletninger, indsættelser, loxP-flankerede betingede alleler som vist i figur 1Bosv.) kan indføres distale for TG-MADM kassetten via meiotisk rekombination (se figur 2 og Hippenmeyer et al.46 for nærmere oplysninger om, hvordan alle mutanter indføres i MADM-systemet). Hvis der forekommer en G2-X Cre recombinase-medieret interkromomal trans-rekombination mellem MADM kassetter, resulterer det i en GFP+ homozygot mutantcelle (GeneX-/-) for det pågældende gen og en tdT+ homozygous wild type celle (GeneX+/+) i et ikke-mærket heterozygotmiljø46,47,71. Alternative mærkningsresultater , der ikke er anvendt i klonanalysen (dvs. gule celler), er tidligere beskrevet i detaljer11,46,47. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Avlsordninger for generering af eksperimentelle MADM-mus til opsporing af afstamning. Avlsplan for generering af kontrol MADM (A) og Gene X MADM (B) eksperimentelle MADM-mus til klonal analyse. Yderligere oplysninger om MADM-avlsparadigme se Beattie et al.7 og Hippenmeyer et al.7,46. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Tidsforløbsparadiger til MADM-baseret klonal afstamningsanalyse. Skematisk af de eksperimentelle design tidsvinduer. For langsgående prøvetagning paradigmer, timepoint af klon induktion forblev konstant og længden af tid før analysen varierede. Ved progressiv intervalprøvetagning forblev analysetidspunktet konstant, men induktionstiden varierede. En kombination af en eller begge tilgange kan anvendes afhængigt af de stillede spørgsmål. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: MADM klonal analyse i udviklingslandene og voksne neocortex. TM-medieret MADM klon induktion i symmetrisk proliferative (TM ved E10) (A-C) og asymmetrisk neurogen (TM på E12) (D-F) dividere RGPs. Afbildet er individuelle MADM kloner in vivo i udviklingslandene (TM/E10−A/E16 og TM/E12−A/E16) (B,E) og voksne (TM/E10−A/P21 og TM/E12−A/P21) (C,F) i MADM-11GT/TG; Nestin-CreERT2+/- (B,E) og MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- (C,F). Neuronproduktionen var uafhængig af subklonfarver , og subkloner med grønt flertal/mindretal kunne sammenlignes med subkloner med rødt flertal/mindretal underkontrolbetingelserne 7,11. Ca. 1/6 af voksne kloner indeholdt også astrocytter og/eller oligodendrocytter, angivet med hvide stjerner. Paneler B og F er gengivet med tilladelse fra Hippenmeyer et al.46 og Rulands og Simons72, hhv. CP = Kortikal plade. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: MADM klonal analyse for at kvantificere RGP-medieret neuron output. Analyse af excitatorisk neuron (enhed) produktion af individuelle neurogene RGPs på klonniveau ved hjælp af MADM7,11. (A) Eksperimentel paradigme for at fremkalde det meste asymmetriske MADM kloner i udviklingslandene cortex. ( B) Mulige asymmetriske klonresultater med størstedelen af underkluden mærket i enten grønne eller røde (C) Repræsentative fortløbende sektioner, der spænder over en enkelt neurogen asymmetrisk klon (D,E) 3D-rekonstruktionsbilleder af repræsentative asymmetriske G2-X MADM-kloner med en majoritetspopulation i rødt (D) eller grønt (E) i MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- med TM induktion ved E12 og analyse på P21. Bemærk både grønne og røde mærkede celler er vilde type. (F) Skematisk angivelse af de to mulige eksperimentelle MADM klon resultater. (G) Kvantificering af størrelsen af størstedelens befolkning som følge af fornyelse af 1GPs i MADM-11-kloner. H)Kvantificering af mindretallets størrelse som følge af fornyelse af RGPs i MADM-11-kloner. (I) Kvantificering af den asymmetriske neurogene MADM-11-kloners enhedsstørrelse. Hypotetiske værdier kan repræsentere middel ± SEM. Skalabar = 100 μm (D og E). TM = Tamoxifen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: MADM klonal analyse for at studere gener, der fører til microcephaly og macrocephaly. Hypotetiske MADM klonale analyse resultater, når de udfører funktionel genetisk dissektion af kandidat gener, der fører til microcephaly eller macrocephaly. For at dissekere de celle autonome funktioner i et gen af interesse (Gene X) på neuron output, MADM kræver mutant alleler, der skal indføres distale til MADM kassetter via meiotisk rekombination (for detaljer hvordan man kan indføre mutant alleler i MADM systemet se også Figur 2, Hippenmeyer et al.46, og Laukoter et al.46,73). (A,B) Skematisk indikerer eksperimentelle MADM paradigme for funktionel analyse af klonale RGP enheder. Den mutante subclone kan enten danne minoritetspopulationen (A) eller majoritet (B). (C-E) Hypotetiske MADM klonale analyse resultater ved kvantificering kontrol MADM (hvide bjælker), Gene-X MADM microcephaly (grå bjælker) og Gene-X MADM makrocephaly sorte bjælker) asymmetriske kloner. CC) Kvantificering af flertallets størrelse. DD) Kvantificering af mindretallets størrelse. (E) Kvantificering af den fælles størrelse af asymmetriske neurogene kloner. Hypotetiske værdier kan repræsentere middel ± SEM. S = Hypotetisk scenario, hvor forskel i underkloncellenummer kan opnå betydning i forhold til kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: MADM-klonale undersøgelser i litteraturen. Sammenfatning af undersøgelser i litteraturen, der indeholder MADM-klonale afstamningsforsøg, herunder CreERT2-driver, der blev anvendt, TM-dosis og injektionstid. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).

Discussion

En metode til at bruge MADM til at spore celle afstamning af de enkelte RGI'er in vivo i udviklingslandene neocortex er beskrevet. Når madm-hændelser kombineres med TM-inducerelige CreERT2,kan de være præcist timede, hvilket giver en meget kvalitativ og kvantitativ visuel udlæsning af stamcelledelingsmønstre på enkeltcelleniveau. Ved at titrere den leverede dosis TM kan der i en ideel situation opnås et gennemsnit på mindre end én klon pr. kortikale halvkugle, hvilket giver tilstrækkelig rumlig adskillelse til entydigt at skelne mellem individuelle kloner. Ved at opretholde vævsintegritet, denne metode også indfanger væsentlige oplysninger om position, morfologi, og absolutte cellenumre. MADM kassetter på Chr. 117,11,12,46,56,57, på Chr. 751, og den oprindelige MADM på Rosa2647,53,59 er blevet anvendt i MADM klonale analyseundersøgelser.56 De enkelte cellers høje opløsning giver et hidtil uset indblik i både morfologi og dattercellernes klonale forhold og muliggør levende billeddannelse af prolifererende stamceller og nye kloner46,52.

Kejsersnit og fremme af hvalpe til analyse af kloner på postnatale tidspunkter er et nødvendigt og kritisk skridt i protokollen. Afhængigt af sundhedstilstanden af DEN TM-behandlede drægtige dæmning, kan det ikke være nødvendigt at udføre en kejsersnit. Men, hæve hvalpene med en plejemor er stadig påkrævet, fordi TM-behandlede mor kan have problemer med at ammende. Der er ikke konstateret forskelle i behovet for at fremme med forskellige CreERT2-chauffører. Både MADM linjer og plejemødre opretholdes på en outbred CD-1 baggrund. Hvis kejsersnit ikke er nødvendigt, kan den TM-behandlede drægtige moderdyr, der anvendes til at generere forsøgshvaler, genbruges til yderligere forsøgsavler i overensstemmelse med principperne i 3R (bemærk, at dette kun kan ske, hvis dyreforsøgslicenser godkender denne praksis). Foster mødre kan bruges til at fremme hvalpe inden for 2 dage efter fødslen, men højere succesrater er blevet observeret, når plejemødre føder på samme dag som de eksperimentelle mus, der skal fremmes. Derfor er det vigtigt at oprette tidsfornemmte parringer for plejemødre parallelt med forsøgs parret i trin 1.1. Fastholdelse af en lignende kuld nummer som den oprindelige plejemors kuld kan forbedre overlevelsesraten for plejet unger, og derfor fjernelse af nogle til alle de oprindelige kuld kan være nødvendigt. Yderligere trin, der kan forbedre fremme omfatter gnide eksperimentatorens handsker med strøelse og mad (for at fjerne duften af handsker); gnide hvalpene forsigtigt efter kejsersnit med fragmenter af plejemoderens snavsede kuld og rede; og placering af ungerne i tæt kontakt med pleje moderens unger forud for deres placering i plejemus buret.

Som i andre reporter-baserede afstamning sporing metoder, skal nøje overvejes, når du vælger den optimale CreERT2 driver til MADM klonale eksperimenter. For det første skal den anvendte promotor udtrykke rekombinen både tidsmæssigt og rumligt i den interesse forkomspopulation. Det kan være en udfordring at finde denne initiativtager, fordi nogle initiativtagere kan ændre udtryksmønstre eller blive bragt til tavshed på forskellige udviklingsstades. For at forbedre celletypespecikiteten er der blevet anvendt flere stedspecifikke rekombiner, der hver især drives af separate initiativtagere. Når den ene eller begge rekombiner udtrykkes i samme celle , mærker denne cellen og dens afkom med en fluorescerende reporter74,75,76,77. Sammenfattende er det vigtigt at vælge en CreERT2 driver, der er specifik for befolkningen af stamfødder bliver analyseret.

Det mest kritiske trin i denne metode er identifikationen af en klon, fordi alle celler skal udledes utvetydigt af en enkelt rekombinationshændelse (trin 8.1). Titrering af TM-koncentration sikrer mindre end én klynge af røde/grønne celler pr7,. Kloner bør kasseres, hvis tilstødende klynger af celler forekommer inden for 500 μm fra klonen af interesse. Derfor er det vigtigt at undersøge flere afsnit før og efter fremkomsten af en klon for at sikre, at der ikke er yderligere rekombinationshændelser i nærheden. På grund af svagere signal fra fluorophorerne er det nødvendigt at udføre immunhistokemi for eGFP og tdT i embryonale kloner (se afsnit 6). Dette anbefales kun til voksne kloner, hvis yderligere antigener vil blive kolmærket. Når billedkreptiske kloner, er det vigtigt at fange hele bredden af cortex, hvor klonen er placeret (dvs. fra pial overflade til corpus callosum; se trin 8.4) for ikke at gå glip af nogen celler. Dette letter også billedjusteringen under billedbehandling (afsnit 9). Afsnit 8 i protokollen kræver et omvendt konforosset mikroskop, men kan tilpasses afhængigt af det tilgængelige mikroskopopsætning. Epifluorescensmikroskopi kan anvendes, men konfokal mikroskopi anbefales, fordi dette fører til et fald i lysforurening udefra fokusplanet. Det er også vigtigt, at laserintensiteten og forstærkningen justeres, så grønne, røde og gule celler entydigt kan identificeres. Uanset opsætningen anbefales det at bruge et mål på mindst 20x for at sikre fuld rumlig adskillelse af tæt placerede celler. Ud over at registrere den kortikale dybde af alle celler (trin 8.6) skal kortikale områder, hvor klonerne er placeret, identificeres ved hjælp af et hjerneatlas som Allen Brain atlas eller andre stereotaxiske koordinatkort. En fil navngivning paradigme bør også vedtages for at sikre klon billeder er let identificerbare. Følgende oplysninger kunne indgå i navnet på filen: unikt billed-id, dato billede blev taget, genotype af dyr, alder induktion, alder af analyse, billednummer i forhold til resten af billederne fra samme klon.

Indførelse af en mutation distalt til en MADM kassette karakteristisk tillader generering af genetiske mosaikker71 og tillader dissektion af molekylære regulatorer af afstamning og celletype mangfoldighed på klonaleniveau 7,11,46,62. For at generere en genetisk mosaik med MADM skal MADM-kassetterne være meiotisk forbundet med det samme kromosom som det interessenske gen (se figur 2 for avlsordningen). Dette begrænser den nuværende klonale analyse med MADM til gener placeret på Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251og Chr. 6 distal til Rosa26 locus47. Fremtidige undersøgelser vil bruge MADM kassetter målrettet til ethvert kromosom, tillader mosaik analyse af stort set alle gener af musen genom på klonale niveau.

Endelig er MADM ikke begrænset til analyse af stamceller i den udviklende neocortex. Undersøgelsen af mange stamcellenicher kunne drage fordel af evnen til at løse spatiotemporal arrangementer af klonalt beslægtede celler. Ved at anvende MADM på andre områder af hjernen, sygdomssygdomme (f.eks. kræft) eller i andrevæv 47,,50, 51,51,52, 53,54,55,55,56,57,58,59, undersøgelser afslørede afstamningsrelationer hos kloner, der stammer fra forskellige klasser af stam- og stamceller (se tabel 1 for den aktuelle liste over madm-kloningsundersøgelser). En anden interessant fremtidig anvendelse af MADM er at kombinere det med yderligere funktionelle eller subcellulære journalister, hvilket ville øge graden af information, der kan erhverves fra kloner.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle medlemmer af Hippenmeyer-laboratoriet for diskussion, Bioimaging Facility, Life Science Facility og Pre-Clinical Facility hos IST Austria for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af IST Austrias institutionelle fonde. R.B. modtog støtte fra Den Østrigske Videnskabsfond (FWF) Lise-Meitner-programmet (M 2416); N.A modtog støtte fra Den Østrigske Videnskabsfond (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC modtog støtte fra Den Europæiske Unions forsknings- og innovationsprogram horisont 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. A.H. modtog støtte fra en ÖAW DOC (ph.d.-stipendiat ved det østrigske videnskabsakademi). Denne undersøgelse blev også støttet af Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under Den Europæiske Unions forsknings- og innovationsprogram Horisont 2020 (tilskudsaftale nr. 725780 LinPro) til S.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock) Braun 9204512N
1,4-diazabicyclooctane (DABCO) Roth 0718.2
10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock) Braun 8508429N
15 mL conical centrifuge Sarstedt 65.554.502
24 multi-well dishes Roth/Greiner Bio-one CE56.1
27- gauge x 3/4 needle (Sterican) Braun 16010256E
Corn oil Sigma C8267-500ML
Coverslips (24 x 60 mm #1) Thermo Fisher Scientific (Menzel) 15747592
Cryostat Cryostar NX70 Thermo Fisher Scientific 957000H
Dako Pen (Wax marker) Agilent S200230-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
Disposable microtome blade (MX35 Ultra) Thermo Fisher Scientific 705830
Fine Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools (FST) 11254-20
Glass anti-roll plate Histocom M 449980
Glycerol Sigma G5516
LSM 800 Confocal Zeiss
Mounting medium 25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)
Mowiol 4-88 Roth 0713.2
Normal donkey serum Innovative Research IGDNSER100ML
Paraformaldehyde Sigma 441244-1KG
Peristaltic pump 323E/D 400RPM Watson-Marlow 036.3124.00A
Sucrose Sigma S8501-5KG
Superfrost plus glass slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNT
Tamoxifen Sigma T5648
Tissue Embedding mold T-12 (22mm square) Polysciences Inc. 18986-1
Tissue-Tek O.C.T Sakura 4583
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Trizma hydrochloride Sigma 93363
Tween-20 Sigma P9416-100ML
Software and Plugins:
Fiji 1.52p Fiji
MultiStackReg 1.45 Download link
TurboReg EPFL Bioimaging
Zen Blue 2.6 Zeiss
Experimental Models: Organisms/Strains:
Mouse: Emx1-CreER The Jackson Laboratory JAX:027784
Mouse: MADM-11-GT The Jackson Laboratory JAX:013749
Mouse: MADM-11-TG The Jackson Laboratory JAX:013751
Primary antibodies:
Chicken anti-GFP 1:500 Aves Labs GFP-1020
Goat anti-tdTomato 1:500 Sicgen Antibodies AB8181-200
Rabbit anti-RFP 1:500 MBL PM005
Secondary antibodies:
Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500 Jackson Immuno Research 715-475-150
Donkey Anti-Goat Cy3 1:500 Jackson Immuno Research 705-165-147
Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500 Jackson Immuno Research 711-165-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malatesta, P., et al. Neuronal or glial progeny: regional differences in radial glia fate. Neuron. 37 (5), 751-764 (2003).
  2. Miyata, T., Kawaguchi, A., Okano, H., Ogawa, M. Asymmetric inheritance of radial glial fibers by cortical neurons. Neuron. 31 (5), 727-741 (2001).
  3. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  4. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).
  5. Desikan, R. S., Barkovich, A. J. Malformations of cortical development. Annals of Neurology. 80 (6), 797-810 (2016).
  6. Gao, R., Penzes, P. Common mechanisms of excitatory and inhibitory imbalance in schizophrenia and autism spectrum disorders. Current Molecular Medicine. 15 (2), 146-167 (2015).
  7. Beattie, R., et al. Mosaic Analysis with Double Markers Reveals Distinct Sequential Functions of Lgl1 in Neural Stem Cells. Neuron. 94 (3), 517-533 (2017).
  8. Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 800, 1-24 (2014).
  9. Lodato, S., Arlotta, P. Generating neuronal diversity in the mammalian cerebral cortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 699-720 (2015).
  10. Hansen, A. H., Duellberg, C., Mieck, C., Loose, M., Hippenmeyer, S. Cell Polarity in Cerebral Cortex Development-Cellular Architecture Shaped by Biochemical Networks. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 176 (2017).
  11. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  12. Llorca, A., et al. A stochastic framework of neurogenesis underlies the assembly of neocortical cytoarchitecture. eLife. 8, e51381 (2019).
  13. Ma, J., Shen, Z., Yu, Y. C., Shi, S. H. Neural lineage tracing in the mammalian brain. Current Opinion in Neurobiology. 50, 7-16 (2018).
  14. Caviness, V., Takahashi, T., Nowakowski, R. Numbers, time and neocortical neuronogenesis: a general developmental and evolutionary model. Trends in Neurosciences. 18 (9), 379-383 (1995).
  15. Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anatomy and Embryology. 156 (2), 115-152 (1979).
  16. Kessaris, N., et al. Competing waves of oligodendrocytes in the forebrain and postnatal elimination of an embryonic lineage. Nature Neuroscience. 9 (2), 173-179 (2006).
  17. Magavi, S., Friedmann, D., Banks, G., Stolfi, A., Lois, C. Coincident generation of pyramidal neurons and protoplasmic astrocytes in neocortical columns. The Journal of Neuroscience. 32 (14), 4762-4772 (2012).
  18. Anthony, T. E., Klein, C., Fishell, G., Heintz, N. Radial glia serve as neuronal progenitors in all regions of the central nervous system. Neuron. 41 (6), 881-890 (2004).
  19. Voigt, T. Development of glial cells in the cerebral wall of ferrets: direct tracing of their transformation from radial glia into astrocytes. The Journal of Comparative Neurology. 289 (1), 74-88 (1989).
  20. Amberg, N., Laukoter, S., Hippenmeyer, S. Epigenetic cues modulating the generation of cell-type diversity in the cerebral cortex. Journal of Neurochemistry. 149 (1), 12-26 (2019).
  21. Beattie, R., Hippenmeyer, S. Mechanisms of Radial Glia Progenitor Cell Lineage Progression. FEBS letters. 591 (24), 3993-4008 (2017).
  22. Telley, L., et al. Temporal patterning of apical progenitors and their daughter neurons in the developing neocortex. Science. 364 (6440), eaav2522 (2019).
  23. Oberst, P., et al. Temporal plasticity of apical progenitors in the developing mouse neocortex. Nature. 573 (7774), 370-374 (2019).
  24. Telley, L., et al. Sequential transcriptional waves direct the differentiation of newborn neurons in the mouse neocortex. Science. 351 (6280), 1443 (2016).
  25. Deppe, U., et al. Cell lineages of the embryo of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (1), 376-380 (1978).
  26. Woodworth, M. B., Girskis, K. M., Walsh, C. A. Building a lineage from single cells: genetic techniques for cell lineage tracking. Nature Reviews Genetics. 18 (4), 230-244 (2017).
  27. Masuyama, N., Mori, H., Yachie, N. DNA barcodes evolve for high-resolution cell lineage tracing. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 63-71 (2019).
  28. Legue, E., Joyner, A. L. Chapter Ten-Genetic Fate Mapping Using Site-Specific Recombinases. Methods in Enzymology. 477, 153-181 (2010).
  29. Postiglione, M. P., Hippenmeyer, S. Monitoring neurogenesis in the cerebral cortex: an update. Future Neurology. 9 (3), 323-340 (2014).
  30. Espinosa-Medina, I., Garcia-Marques, J., Cepko, C., Lee, T. High-throughput dense reconstruction of cell lineages. Open Biology. 9 (12), 190229 (2019).
  31. Hwang, B., et al. Lineage tracing using a Cas9-deaminase barcoding system targeting endogenous L1 elements. Nature Communications. 10 (1), 1234 (2019).
  32. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
  33. García-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnár, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. 141 (7), 1589-1598 (2014).
  34. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  35. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  36. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  37. Amitai-Lange, A., et al. A method for lineage tracing of corneal cells using multi-color fluorescent reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
  38. Vasistha, N. A., et al. Cortical and Clonal Contribution of Tbr2 Expressing Progenitors in the Developing Mouse Brain. Cerebral Cortex. 25 (10), 3290-3302 (2015).
  39. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  40. Siddiqi, F., et al. Fate mapping by piggyBac transposase reveals that neocortical GLAST+ progenitors generate more astrocytes than Nestin+ progenitors in rat neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
  41. Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  42. García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
  43. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  44. Kim, G. B., et al. Rapid Generation of Somatic Mouse Mosaics with Locus-Specific, Stably Integrated Transgenic Elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
  45. Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658 (2018).
  46. Hippenmeyer, S., et al. Genetic Mosaic Dissection of Lis1 and Ndel1 in Neuronal Migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  47. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  48. Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'homme et des vertébrés. , Maloine. Paris, France. (1911).
  49. Cowan, W. M. The emergence of modern neuroanatomy and developmental neurobiology. Neuron. 20 (3), 413-426 (1998).
  50. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  51. Hippenmeyer, S., Johnson, R. L., Luo, L. Mosaic analysis with double markers reveals cell-type-specific paternal growth dominance. Cell Reports. 3 (3), 960-967 (2013).
  52. Riccio, P., Cebrian, C., Zong, H., Hippenmeyer, S., Costantini, F. Ret and Etv4 promote directed movements of progenitor cells during renal branching morphogenesis. PLoS Biology. 14 (2), e1002382 (2016).
  53. Bonaguidi, M. A., et al. In vivo clonal analysis reveals self-renewing and multipotent adult neural stem cell characteristics. Cell. 145 (7), 1142-1155 (2011).
  54. Mayer, C., et al. Clonally Related Forebrain Interneurons Disperse Broadly across Both Functional Areas and Structural Boundaries. Neuron. 87 (5), 989-998 (2015).
  55. Muzumdar, M. D., et al. Clonal dynamics following p53 loss of heterozygosity in Kras-driven cancers. Nature Communications. 7, 12685 (2016).
  56. Shi, W., et al. Ontogenetic establishment of order-specific nuclear organization in the mammalian thalamus. Nature Neuroscience. 20, 516 (2017).
  57. Wong, S. Z. H., et al. In vivo clonal analysis reveals spatiotemporal regulation of thalamic nucleogenesis. PLoS Biology. 16 (4), e2005211 (2018).
  58. Xu, H. T., et al. Distinct Lineage-Dependent Structural and Functional Organization of the Hippocampus. Cell. 157 (7), 1552-1564 (2014).
  59. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All β Cells Contribute Equally to Islet Growth and Maintenance. PLoS Biology. 5 (7), e163 (2007).
  60. Ortiz-Alvarez, G., et al. Adult neural stem cells and multiciliated ependymal cells share a common lineage regulated by the geminin family members. Neuron. 102 (1), 159-172 (2019).
  61. Kaplan, E. S., Ramos-Laguna, K. A., Mihalas, A. B., Daza, R. A. M., Hevner, R. F. Neocortical Sox9+ radial glia generate glutamatergic neurons for all layers, but lack discernible evidence of early laminar fate restriction. Neural Development. 12 (1), 14 (2017).
  62. Lv, X., et al. TBR2 coordinates neurogenesis expansion and precise microcircuit organization via Protocadherin 19 in the mammalian cortex. Nature Communications. 10 (1), 3946 (2019).
  63. Mihalas, A. B., Hevner, R. F. Clonal analysis reveals laminar fate multipotency and daughter cell apoptosis of mouse cortical intermediate progenitors. Development. 145 (17), dev164335 (2018).
  64. Picco, N., et al. A mathematical insight into cell labelling experiments for clonal analysis. Journal of Anatomy. 235 (3), 687-696 (2019).
  65. Johnson, C. A., Ghashghaei, H. T. Sp2 regulates late neurogenic but not early expansive divisions of neural stem cells underlying population growth in the mouse cortex. Development. , (2020).
  66. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing Neurogenesis and Differentiation: Insights from Quantitative Clonal Analyses of Cerebellar Granule Cells. The Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301 (2008).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  69. Liu, Y., et al. Tamoxifen-independent recombination in the RIP-CreER mouse. PLoS One. 5 (10), e13533 (2010).
  70. Klingler, E., Jabaudon, D. Do progenitors play dice? eLife. 9, e54042 (2020).
  71. Hippenmeyer, S. Dissection of gene function at clonal level using mosaic analysis with double markers. Frontiers in Biology. 8 (6), 557-568 (2013).
  72. Rulands, S., Simons, B. D. Tracing cellular dynamics in tissue development, maintenance and disease. Current Opinion in Cell Biology. 43, 38-45 (2016).
  73. Laukoter, S., et al. Imprinted Cdkn1c genomic locus cell-autonomously promotes cell survival in cerebral cortex development. Nature Communications. 11 (1), 195 (2020).
  74. Daigle, T. L., et al. A Suite of Transgenic Driver and Reporter Mouse Lines with Enhanced Brain-Cell-Type Targeting and Functionality. Cell. 174 (2), 465-480 (2018).
  75. He, M., et al. Strategies and Tools for Combinatorial Targeting of GABAergic Neurons in Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 91 (6), 1228-1243 (2016).
  76. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  77. Plummer, N. W., et al. Expanding the power of recombinase-based labeling to uncover cellular diversity. Development. 142 (24), 4385 (2015).
  78. Imayoshi, I., Ohtsuka, T., Metzger, D., Chambon, P., Kageyama, R. Temporal regulation of Cre recombinase activity in neural stem cells. Genesis. 44 (5), 233-238 (2006).
  79. Sasaki, S., et al. Complete loss of Ndel1 results in neuronal migration defects and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7812-7827 (2005).
  80. Acampora, D., et al. Epilepsy and brain abnormalities in mice lacking the Otx1 gene. Nature Genetics. 14 (2), 218-222 (1996).
  81. Soeda, T., et al. Sox9-expressing precursors are the cellular origin of the cruciate ligament of the knee joint and the limb tendons. Genesis. 48 (11), 635-644 (2010).
  82. Klezovitch, O., Fernandez, T. E., Tapscott, S. J., Vasioukhin, V. Loss of cell polarity causes severe brain dysplasia in Lgl1 knockout mice. Genes & Development. 18 (5), 559-571 (2004).
  83. Pimeisl, I. M., et al. Generation and characterization of a tamoxifen-inducible EomesCreER mouse line. Genesis. 51 (10), 725-733 (2013).
  84. Nakagawa, N., et al. Memo1-Mediated Tiling of Radial Glial Cells Facilitates Cerebral Cortical Development. Neuron. 103 (5), 836-852 (2019).
  85. Nowotschin, S., et al. The T-box transcription factor Eomesodermin is essential for AVE induction in the mouse embryo. Genes & Development. 27 (9), 997-1002 (2013).
  86. Balordi, F., Fishell, G. Mosaic removal of hedgehog signaling in the adult SVZ reveals that the residual wild-type stem cells have a limited capacity for self-renewal. Journal of Neuroscience. 27 (52), 14248-14259 (2007).
  87. Liang, H., et al. Neural development is dependent on the function of specificity protein 2 in cell cycle progression. Development. 140 (3), 552-561 (2013).
  88. Guo, C., Yang, W., Lobe, C. G. A Cre recombinase transgene with mosaic, widespread tamoxifen-inducible action. Genesis. 32 (1), 8-18 (2002).
  89. Ahn, S., Joyner, A. L. In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog. Nature. 437 (7060), 894-897 (2005).
  90. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136 (2), 295-305 (2009).
  91. Koundakjian, E. J., Appler, J. L., Goodrich, L. V. Auditory neurons make stereotyped wiring decisions before maturation of their targets. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14078-14088 (2007).
  92. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic β-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  93. Sohal, D. S., et al. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circulation Research. 89 (1), 20-25 (2001).
  94. Ventura, A., et al. Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature. 445 (7128), 661-665 (2007).
  95. Johnson, L., et al. Somatic activation of the K-ras oncogene causes early onset lung cancer in mice. Nature. 410 (6832), 1111-1116 (2001).
  96. Tasic, B., et al. Extensions of MADM (mosaic analysis with double markers) in mice. PLoS One. 7 (3), e33332 (2012).
  97. Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129 (22), 5301-5312 (2002).
  98. Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
  99. Schuchardt, A., D'Agati, V., Larsson-Blomberg, L., Costantini, F., Pachnis, V. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret. Nature. 367 (6461), 380-383 (1994).
  100. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 877-892 (2002).
  101. Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. eLife. 4, e10036 (2015).
  102. Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454 (7200), 104-108 (2008).
  103. Lasrado, R., et al. Lineage-dependent spatial and functional organization of the mammalian enteric nervous system. Science. 356 (6339), 722-726 (2017).
  104. Matsuoka, T., et al. Neural crest origins of the neck and shoulder. Nature. 436 (7049), 347-355 (2005).

Tags

Biologi mosaik analyse med dobbelt markører (MADM) klonal analyse afstamning analyse stamceller hjernebark radial glia stamfade (RGP) neurogenese neurovidenskab neuroudvikling
Lineage Sporing og klonale analyse i udviklingen af hjernebark ved hjælp af mosaik analyse med dobbelt markører (MADM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beattie, R., Streicher, C., Amberg,… More

Beattie, R., Streicher, C., Amberg, N., Cheung, G., Contreras, X., Hansen, A. H., Hippenmeyer, S. Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM). J. Vis. Exp. (159), e61147, doi:10.3791/61147 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter