Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Härstamning spårning och klonal analys i utvecklingen av hjärnbarken med mosaik analys med dubbla markörer (MADM)

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61147
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Science and Technology Austria

Summary

Ett protokoll för att utföra härstamning spårning och funktionell genetisk analys av kandidat gener på en enda cell nivå med mosaik analys med dubbla markörer (MADM) presenteras. MADM klonal analys ger en kvantitativ ram för att mäta proliferative beteende, cellulära produktion, och härstamning förhållandet mellan enskilda förfäder och deras dotter celler.

Abstract

Från en begränsad pool av förfäder bildar däggdjursnahbarken mycket organiserade funktionella neurala kretsar. De underliggande cellulära och molekylära mekanismerna som reglerar härstamningsövergångar av neurala stamceller (NSCs) och eventuell produktion av nervceller och glia i det utvecklande neuropithelium är dock fortfarande oklart. Metoder för att spåra NSC-indelningsmönster och kartlägga härstamningen av klonalt relaterade celler har utvecklats dramatiskt. Men många samtida härstamning spårningsteknik lider av bristen på cellulär upplösning av avkomma cell öde, vilket är viktigt för att dechiffrera defader celldelning mönster. Presenteras är ett protokoll som använder mosaik analys med dubbla markörer (MADM) för att utföra in vivo klonal analys. MADM manipulerar samtidigt enskilda stamcellsceller och visualiserar exakta indelningsmönster och härstamningsprogression vid oöverträffad single cell-upplösning. MADM-baserade interchromosomal rekombination händelser under G2-X fasen av mitos, tillsammans med tidsmässigt inducible CreERT2, ge exakt information om födelsedatum kloner och deras division mönster. Madm-härstamningsspårning ger således oöverträffade kvalitativa och kvantitativa avläsningar av spridningssättet för stamceller på encellig nivå. MADM möjliggör också undersökning av mekanismerna och funktionskraven hos kandidatgener i NSC-härstamningsprogression. Denna metod är unik genom att jämförande analys av kontroll och mutanta subkloner kan utföras i samma vävnadsmiljö in vivo. Här beskrivs protokollet i detalj, och experimentella paradigm att använda MADM för klonal analys och härstamning spårning i den växande hjärnbarken demonstreras. Viktigt, detta protokoll kan anpassas för att utföra MADM klonal analys i någon murine stamceller nisch, så länge CreERT2 föraren är närvarande.

Introduction

Hjärnbarken är en mycket organiserad struktur som består av sex distinkta lager. Cortex innehåller ett varierat utbud av celltyper inklusive nervceller och glia, som interagerar för att bilda funktionella neurala kretsar. De flesta, om inte alla, när excitatoriska projektion nervceller och glia härrör från en gemensam pool av neurala stamceller (NSCs) kallas radiella glia (RGPs)1,2,3. RGPs själva härrör från neuroepithelial stamceller (NESCs) komponera tidiga embryonala neuropithelium. Vid embryonal dag 9 (E9) hos möss börjar NESC att övergå till RGPs4. RGP härstamning progression kräver exakt tidsmässiga och rumsliga reglering, och när denna process hindras, allvarliga neurologiska sjukdomar såsom megalencephaly, mikrocefali, lissencephaly, eller nedskrivningar såsom schizofreni och autism kan resultera5,6. Vid E10, de flesta RGPs genomgår symmetriska proliferative divisioner, vilket resulterar i en expansion av neurala stamfaderpoolen4,7. RGPs börjar så småningom att dela asymmetriskt, producerar när projektion nervceller på ett tidsmässigt definierade sätt. Genom på varandra följande vågor av neurogenes, nyfödda nervceller migrera in i när plattan bildar när laminae med tidiga födda nervceller ockuperar djupa lager och sena födda nervceller som bor i de ytliga skikten8,9,10. Eftersom clonally relaterade pyramidala nervceller migrera radiellt i hjärnbarken med mycket lite tangentiell spridning, dotterceller tenderar att bilda en kolumn eller konformad struktur som kallas en neuronal radial enhet4,11,12,13. Genom E17 är embryonal neurogen expansion klar hos möss14. RGPs kan också producera ependymala celler och vissa klasser av glia, inklusive astrocyter och oligodendrocyter1,15,16,17,18,19. Potentialen för RGPs att ge upphov till både nervceller och astrocyter verkar vara konsekvent i alla när regioner18, med cirka 1/6 av neurogena RGPs också producerar glia11.

För närvarande är de genetiska och epigenetiska faktorer som reglerar tidsmässiga progression av en stamceller längs dess härstamning mestadels okända. Tidsmässiga mönster av genuttryck kan ha betydande inverkan på härstamningsbeslut i RGPs20,,21,22,,23,24. Hur detta tätt stickade förhållandet mellan tidsmässiga och rumsliga mönster leder till den molekylära mångfalden av vuxna neuronala typer över när områden är inte känt. På samma sätt är hur den enskilda stamcellspotentialen och dess cellulära utgång moduleras på cell- och molekylär nivå en viktig obesvarad fråga. Framtida studier kommer förhoppningsvis att ta upp några av dessa frågor, i slutändan utöka vår förståelse av funktionella när kretsbildning.

Utvecklingsneurobiologi syftar till att förstå den härstamning relation som celler i hjärnan delar med varandra. Inledningsvis var mycket få forskningsverktyg tillgängliga för detta, och många tidiga studier förlitade sig på visuella observationer av division mönster i transparenta organismer som Caenorhabditis elegans25. De senaste decennierna har sett en dramatisk ökning av antalet och förfining av tekniker tillgängliga13,26,27,28,29. Framväxten av CRISPR-Cas9 genomredigeringssystem möjliggör syntetisk rekonstruktion av cellhärstamning relationer genom att införa utvecklas DNA streckkoder27,30. Två aktuella exempel på barcoding strategier är användningen av homing guide RNA som leder CRISPR-Cas9 till specifika DNA-streckkod lokus eller en cytidin deaminase smält med nickase Cas9 att rikta endogena varvas upprepade regioner31,32. Dessa tekniker ger mycket multiplexerade metoder genom införandet av streckkoder som successivt och stabilt ackumulera unika mutationer över tiden. Genomredigeringsmetoder är mycket värdefulla eftersom de tillåter retroaktiv analys av förhållandet mellan två celler baserat på det delade arvet av dessa streckkoder. Men för att läsa streckkoderna i enskilda celler måste vävnaden vanligtvis störas, och därför går information om position, morfologi och absoluta cellnummer från en enskild stamfader förlorad.

Kombinatoriska märkningsparadigmer bevarar rumslig information och möjliggör i princip också skillnaden mellan nära lokaliserade eller till och med överlappande kloner33,34. För att en härstamningsspårningsmetod skall vara informativ skall den märka enskilda stamfader och deras avkomma på ett glest och outplånligt sätt. Noterbart är att Brainbow35 och Confetti36,37 metoder använder stokastiska multicolor Cre recombinase-baserade reportrar som uttrycker en kombination av fluorescerande proteiner från en enda locus. Det omfattande antalet samtidiga färgkombinationer som kan uppnås in vivo gör detta till ett kraftfullt verktyg när man spårar när RGP-kloner och astrocyter34. Transposon-baserade system som ger stabil genomisk integration av transgener kodning fluorescerande reportrar och tillåter härstamning spårning av när defagenitorer har också utvecklats33,,38,,39,40,41. Transposon-baserade system har en extra fördel i att reportern konstruerar stabilt integrera i genomet, och därmed tillförlitligt etikett lineally relaterade dotterceller. För att spåra astrocyt härstamningar specifikt, ett antal metoder har utvecklats som innebär elektroporation av piggyBac transposaser inklusive Star Track, som använder sig av en kombination av konstruktioner kodning olika fluorescerande proteiner40,42. Ett annat tillvägagångssätt, MAGIC markörer, introducerar Brainbow vektorer som transponerbara transgener. Detta har framgångsrikt använts för att spåra embryonala neurala och astrocytprogenitors34,,43. Nyligen, mosaik analys av dubbla recombinase-medierad kassett utbyte (MADR) befanns stabilt märka mutanta celler uttrycker transgena element från exakt definierade kromosomal loci44. Dessa kraftfulla in vivo kombinatoriska märkning tekniker har gett många insikter i härstamning dynamiken i stamcellsceller. Dessa analyser utförs dock på fast vävnad, vilket ger en ögonblicksbild av enskilda kloner i ett definierat utvecklingsstadium. För att observera förändringar i härstamningsdynamiken hos enstaka kloner över tiden måste kroniska in vivo-avbildningsmetoder som liknar dem som utförs i den vuxna dentatentategiken appliceras45.

Mosaikanalys med dubbla markörer (MADM) är en kraftfull dubbel färgmärkningsmetod som möjliggör in vivo-härstamningsspårning av enskilda stamcellsceller hos möss46,47. Två komponenter är nödvändiga för madm-märkningshändelser: För det första måste MADM-kassetter riktas mot identiska loci på homologa kromosomer. Kassetter består av två chimärlyssiga reportergener, eGFP (grön, [G]) och tandemdimmer Tomat (röd, tdT[T]). GT-kassetten innehåller N-ändstationen för eGFP och C-ändstationen för tdT, åtskilda av en intron som innehåller en loxP-plats. GT TG-kassetten är konstruerad omvänt, med N-ändstationen av tdT och C-ändstationen för eGFP. För det andra är uttrycket av Cre recombinase i samma cell som innehåller riktade MADM kassetter viktigt. I avsaknad av Cre,chimerkassetter inte uttrycka funktionella eGFP eller TDT eftersom deras kodning sekvenser störs. LoxP-platserna fungerar som mål för Cre-medierad interchromosomal rekombination, vilket resulterar i rekonstituering av båda uttryckskassetter samtidigt. Om rekombination inträffar under G2-fasen av cellcykeln följt av X-segregering (G2-X), kommer de två dottercellerna att uttrycka var och en av de två fluorescerande proteinerna. Temporal reglering av CreERT2 verksamhet med tamoxifen (TM) ger exakt information om födelsedatum MADM kloner och division mönster av deras avkomma(Figur 1A)29,46,47.

MADM kan potentiellt systematiskt märka enskilda kloner med hög encellig upplösning i mushjärna som liknar traditionella men ospecificerade och mödosamma metoder som Golgi färgning48 eller färgfyllning49. Eftersom endast promotorn kör CreERT2 bestämmer celltyp specificitet klonala MADM märkning, MADM kan i princip tillämpas för klonala härstamning spårning i alla murine organ och vävnad47,50,51,52. I själva verket har studier redan använt MADM för att avslöja härstamning relationer i kloner som härrör från olika vävnader47,50,,51,52,53,54,55,56,57,58,59. MADM experimentella paradigm har tillämpats för att studera härstamning i när projektion nervceller, glia, och postnatala stamceller i utvecklingen neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM har också använts för att studera cell härstamning i den vuxna dentate gyrus, thalamus, cerebellar granulat celler och interneurons på klonal nivå (se tabell 1 för en komplett lista)47,53,,54,,56,,57,66.

Ett unikt inslag i MADM är förmågan att genetiskt länka mutationer distala till en MADM kassett, vilket skapar en genetisk mosaik (figur 1B och figur 2). Detta resulterar i vilda dotterceller märkta med en fluorescerande markör (tdT i figur 1B) och homozygous mutant syskon med den andra (eGFP i figur 1B) i en omärkt heterozygous miljö. MADM är unikt genom att jämförande analys av kontroll och mutanta subkloner kan utföras i samma vävnadsmiljö in vivo. Ursprungligen var MADM kassetter riktade i Rosa26 locus47, men MADM analys av genfunktion var begränsad till gener distala till locus. För att övervinna (åtminstone delvis) denna begränsning och utöka möjligheterna för MADM-baserade genanalyser, MADM kassetter slogs i nära centromeres av Chr. 751, Chr. 1146, och Chr. 1251. Inriktning alla 19 mus autosomes med MADM kassetter pågår och kommer att möjliggöra praktiskt taget alla gener som skall studeras i framtiden, vilket ger en oöverträffad plattform för studier av utvecklingsmässiga härstamning relationer i kombination med funktionell genetisk analys.

Protocol

Musprotokoll granskades av den institutionella prekliniska kärnanläggningen (PCF) och den interna etiska kommittén vid IST Austria. All avel och alla försök utfördes under en licens som godkänts av det österrikiska federala ministeriet för vetenskap och forskning i enlighet med den österrikiska och EU-djurlagstiftningen.

1. Avel av experimentella möss för MADM klonal analys

  1. Ställ in tidsinställda experimentella MADM-parningar (>P56; CD-1) sent på eftermiddagen (5:00) och kontrollera vaginala pluggar förfarandet morgonen (8:00). Morgonen kontakten är närvarande räknas som dag 0,5. Se figur 2 för en översikt över den experimentella musparningsinställningen. Se till att tidspunkter för TM-induktion av CreERT2-aktivitet och analys är lämpliga för att hantera experimentella frågor.
    OBS: För mer information se figur 3 och representativa resultat nedan.
  2. För postnatal provtagning, inrätta avel för att generera fostermödrar parallellt.
    OBS: Dessa bör startas upp till 1−2 dagar innan experimentella avel.

2. TM induktion i MADM möss

  1. Förbered en 20 mg/mL TM arbetslösning genom att lösa upp den i majsolja i en 15 ml eller 50 ml konisk centrifugrör och placera den på en gungplattform för ~ 4 h vid rumstemperatur (RT), vilket säkerställer TM är helt upplöst. Förvara arbetslösningen vid 4 °C täckt med aluminiumfolie och använd inom 2 veckor.
  2. För att inducera MADM-rekombinationshändelser, leverera en enda injektion av TM intraperitoneally (IP) med en 1 ml tuberkulinspruta och en 25 G nål i en tidsinförd gravid damm. Beroende på stadium av kortikal neurogenes, injicera TM mellan E10−E15 vid en dos av 1−2 mg/gravid damm. För tidiga tidspunkter (dvs. E10) använd högst 1 mg/gravid moder (25 mg/kg) för att förhindra komplikationer under graviditet11. För tidspunkter mellan E11-E15 använd 2 mg/gravid moder (50 mg/kg)7.
    OBS: Alternativt kan TM administreras med en oral sondmatning för sena graviditeter.
  3. För MADM klonal analys till postnatala tidspunkter, återvinna levande embryon på E18-E19 genom kejsarsnitt, och sedan höja valpar med en fostermor.
    OBS: Beroende på hälsotillståndet hos den gravida honan, kan det inte vara nödvändigt att utföra en kejsarsnitt men höja valpar med en fostermor krävs fortfarande eftersom den ursprungliga TM-behandlade mamman kan ha problem ammande.
  4. Att återvinna levande embryon genom kejsarsnitt eller att hämta embryonala tidspunkter för analys, offra den gravida dammen genom livmoderhalscancer störning.
  5. Placera djuret i ryggläge och desinficera pälsen med 70 % etanol. Gör ett litet snitt i huden i nedre delen av buken ovanför livmodern med kirurgiska pincett och sax. Gör ett andra snitt genom musklerna och buken muskulös väggen för att avslöja bukhinnan.
  6. Ta bort livmodern genom att separera från de omgivande vävnaderna med sax. Överför intakt livmoder på en handske fylld med varmt vatten för att öka embryots överlevnad tills var och en avlägsnas från amnionen individuellt.
  7. Använd finspetsade sax och fingrar för att försiktigt öppna livmoderväggarna för att frigöra embryon. Skär inte navelsträngen för nära kroppen för att förhindra omfattande blodförlust. Om embryon ska användas för analys, gå vidare till steg 3.9. Om pups er till vara främjat, gå till steg 2.8.
  8. Om fosterhem krävs, rengör valparna innan du överför dem till fostermodern. Medan rengöring av valparna, tryck försiktigt bröstet då och då för att inleda andning. Placera tillbaka på en andra handske fylld med varmt vatten för att förbättra överlevnaden.
    OBS: Det är viktigt att försiktigt ta bort eventuella återstående amnion och / eller moderkakan med en pappershandduk.
  9. Innan du överför pups till utveckla moder, flytta den utveckla moder från henne bur, flytta den original pups, och byta ut med den experimentell pups. Lämna tillbaka fostermodern till hennes bur.
    Se diskussion för ytterligare förslag för att förbättra acceptansfrekvensen.
  10. Om genotypning krävs, samla tå- eller svansbiopsier mellan P6−P8.
    Obs: Gör det här steget endast om djurförsökslicenser godkänner den här metoden.

3. Vävnadspreparat för MADM-kloner i hjärnan

OBS: För experiment som inkluderar postnatal vävnad (≥P4), fortsätt till steg 3.1. För embryonala tidspoäng och tidiga postnatala (P0−P3), fortsätt till steg 3.9.

  1. Bedöva det experimentella MADM-djuret med en IP-injektion av en ketamin/xyazin/acepromazinlösning (65 mg, 13 mg respektive 2 mg/kg kroppsvikt) och bekräfta att musen inte svarar genom att nypa baktassen.
    OBS: Både madm-möss (CD-1-bakgrund) används för analys. Om genotypning krävs, samla öronbiopsier på denna punkt.
  2. Placera det sövda djuret i ryggläge på perfusionskirurgebrickan och desinficera pälsen med 70 % etanol. För att börja operationen, försiktigt göra ett snitt med sax och kirurgiska pincett genom det yttre lagret av huden och sedan ett andra snitt genom muskelskiktet. Lyft bröstbenets spets och skär bindväv på sidorna, med extra försiktighet för att undvika att skära levern. Brösthålan kommer att synas.
  3. Klipp membranet och lyft för att avslöja hjärtat. Trimma försiktigt bröstkorgen och stiftet till operationsbrickan för att exponera hjärtat. För valpar, ta bort bröstkorgen helt.
  4. För in en nål med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i den nedre vänstra ventrikeln (blekare vävnad). Med hjälp av små iris sax göra ett snitt till den bakre änden av den högra atrium (mörkröd vävnad) för blodet att rinna.
  5. Utför perfusion med PBS följt omedelbart av nygjord, iskall 4% paraformaldehyd (PFA) beredd i PBS. För ungar (P4−P10) använd sprutor för att utföra perfusion. Fyll en spruta med 10 ml PBS och en annan med 10 ml 4% PFA. Se till att alla luftbubblor i sprutorna har avlägsnats. För äldre djur, använd en peristaltisk pump.
  6. Börja perfusera med PBS (10 ml vid 2−4 ml/min hos ungar; 20 ml vid 4−6 ml/min för vuxna som använder en peristaltisk pump). Levern blir klar och blekgul om nålen är korrekt placerad.
  7. När du är klar, ta bort nålen från valparna och sätt in nålen som innehåller PFA i samma hål. För vuxna, stoppa den peristaltiska pumpen innan du byter PBS-lösningen mot iskall PFA, se till att undvika bubblor i upptagsslangen. Återuppta perfusing med PFA (10 ml vid 2−4 ml/min hos ungar; 30 ml vid 4−6 ml/min för vuxna som använder en peristaltisk pump).
  8. När perfusion är klar, halshugga musen och ta bort hjärnan genom noggrann dissekering. Överför hjärnan till 4% PFA. Använd minst 5x hjärnvolymerna (dvs. ~5−10 ml PFA i ett koniskt centrifugrör på 15 ml) och inkubera över natten vid 4 °C för fastsättning efter fusion för att säkerställa fullständig fixering av vävnad. Fortsätt till steg 3.10.
  9. För embryonal vävnad och tidig postnatal vävnad (dvs P0−P3), efter att ha utfört en kejsarsnitt, halshugga embryona med sax. Om genotypning krävs, samla embryots svans på denna punkt. Omedelbart dissekera ut hjärnan och överför till en 12 brunnsplatta som innehåller 2−3 ml 4% PFA/well. Inkubera över natten vid 4 °C för postfixation.
  10. Nästa morgon utbyte PFA med 10 ml (vuxen) eller 2−3 ml (embryo) av PBS och upprepa tvätta 3x i 15 min vid RT. Överför vävnad till 30% sackaros lösning i fosfat buffert (PB) och lagra på 4 ° C på en gungplattform tills vävnaden sjunker i lösningen.
  11. Bädda in hjärnan i optimal skärtemperatur (OCT) förening i en inbäddning mögel, var noga med att orientera hjärnan för antingen koronal eller sagittal snittning. Frys genom att placera inbäddningsformen på torris tills OCT blir helt ogenomskinligt (~10−15 min). Förvara vävnaden vid -80 °C tills vidare användning.

4. Beredning av MADM-vävnad för immunhistokemi

  1. Fäst vävnadsblocket på provskivan i kryostaten genom att applicera en ring av OCT på disken och placera blocket direkt i OCT när det börjar frysa. Se till att blocket är korrekt riktat för önskat skärplan.
    OBS: Här beskrivs koronal snittning för att undersöka när MADM kloner i detalj.
  2. Ställ in blocktemperaturen i kryostaten på -20 °C och klingtemperaturen till -21 °C.
  3. Låt vävnadsblocket anpassa sig till kammartemperaturen genom att montera provskivan på provhållaren och låt i cryostat i ~5 min innan snittningen påbörjas.
  4. Trimma block i tjocka sektioner (45−60 μm) tills vävnadsområdet av intresse har uppnåtts.
  5. När kanten av cortex är väl synlig, stoppa snittning och låsa bladet. Se till att bladet är avskärmat innan du trimmar blocket.
  6. Trimma överflödigt OKT som omger vävnaden med ett blad och lämna ~1−2 mm OKT på alla sidor av hjärnan.
  7. Nästa orientera blocket så att en av de laterala kanterna av cortex är riktad nedåt och den andra uppåt (dvs. den mest rostrala kanten av cortex är spetsig rätt).
  8. Börja snitta med en tjocklek på 45 μm för kloner för vuxna och 30 μm för embryonala kloner. Utför varje sektion individuellt och använd en liten borste för att hålla området under kniven ren från skräp kvar medan trimma blocket.
    Obs: Om detta inte görs och ett avsnitt faller, kan det vara svårt att bestämma rätt ordning på skivorna.
  9. Om sektionerna börjar krypa, trimma kanterna på blocket och /eller försiktigt justera glas antiroll plattan.
  10. För embryonal klonanalys, montera sektioner direkt till en frostad bild. Torka på en värmeplatta vid 37 °C innan du går direkt till steg 5.6.
    Flera avsnitt kan läggas till i en bild, men se till att den sekventiella ordningen bibehålls.
  11. För att samla vuxna kloner, förbereda 24 brunnsplattor som innehåller 1 ml PBS/brunn (vanligtvis 5−6 plattor per hjärna). Från och med den första brunnen, med kalla pincett samla enskilda seriella sektioner i PBS i ordningen för snittning.
    OBS: Den flytande sektionsmetoden används för vuxen vävnad för att säkerställa att inga sektioner missas och att monterade sektioner inte innehåller några rynkor.
  12. Sluta snitta när slutet av neocortex nås.
  13. För kloner för vuxna, fortsätt till montering av flytande sektioner.
    OBS: Sektioner kan förvaras i PBS vid 4 °C i upp till 24 timmar.

5. Montering av vuxen vävnad för bildbehandling

OBS: Följande verktyg krävs: liten pensel, petriskål, PBS med 0,5% Tween (PBS-T), vidhäftningsglas (Tabell över material),monteringsmedium (Tabell över material),täcklappar och pincett.

  1. Fyll en petriskål med PBS-T.
    OBS: Tvättmedel används för att underlätta monteringsprocessen. Om färgning för ytterligare antigener som är känsliga för rengöringsmedel (dvs. glykoproteiner) är nödvändig, är det bäst att hoppa över tillsats av Tween.
  2. Placera en vidhäftningsbild i PBS-T så att den nästan är täckt upp till etiketten.
  3. Överför det första avsnittet till PBS-T.
  4. Med hjälp av en liten pensel, manövrera avsnittet på bilden och ordna det för att bevara ordningen på skärning. Fortsätt på samma sätt med alla ytterligare sektioner.
  5. När alla sektioner är på plats placerar du bilden (~12−16 sektioner/bild) i en mörk glidkammare. Lyft upp locket något så att sektionerna torkar helt (~10−20 min), så att de förblir vidhäftade i efterföljande steg.
  6. Om du utför immunhistokemi för ytterligare antigener, fortsätt direkt till avsnitt 6 eller 7.
    OBS: För embryonala tidspunkter är det nödvändigt att utföra immunostainingsteg för minst GFP och tdT (avsnitt 6). För kloner för vuxna krävs detta endast om färgning för ytterligare antigener parallellt (avsnitten 6 och 7).
  7. Rehydrera och tvätta sektioner 1x med 1x PBS i 5 min för att avlägsna resterande PBS-T. Applicera ~1 ml 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) utspätt i 1x PBS (1 μg/ml) på bilden, se till att alla sektioner är täckta och inkubera i 15 min.
  8. Ta försiktigt bort DAPI och tvätta 1x med 1x PBS i 5 min. Ta bort överflödig PBS och torka i ~1−2 min innan du bäddar in 110 μl monteringsmedium. Täta med ett 24 x 60 mm täckslip och låt torka i minst 3 timmar före avbildning.

6. Immunberäkning endast för GFP och tdT

OBS: Detta avsnitt är nödvändigt för embryonala kloner.

  1. Placera rutschbanor horisontellt i en fuktad inkubationskammare. Markera glidgränser med en vaxmarkör för att minimera mängden buffert som krävs.
  2. Rehydrera sektioner med 1x PBS. För att förbättra färgning kvalitet, arbeta med nybryggt snittad vävnad.
  3. Tillsätt 250−400 μl blockerande buffert (0,5 % Triton X-100, 2−3% normalt åsnaserum i 1x PBS) per bild, så att alla sektioner är täckta. Inkubera i 1 h.
    OBS: Koncentrationen av tvättmedel (Triton X-100 eller Tween-20) varierar beroende på de ytterligare primära antikroppar som används eftersom vissa antigener är känsligare för tvätt- och rengöringsmedel än andra.
  4. Ta bort blockeringsbufferten och tillsätt primära antikroppar i blockeringsbufferten till bilden (300−400 μL/bild).
    OBS: Ett exempel på en primär antikroppsreaktion av standard antikroppar mot anti-GFP/anti-tdT (MADM) kan använda kycklinganti-GFP (1:500) och kaninanti-RFP (1:500).
  5. Inkubera med primära antikroppar över natten vid 4 °C.
    OBS: Bilderna måste inkuberas helt horisontellt med buffert som täcker alla sektioner. Annars kan ojämn eller dålig färgning uppstå.
  6. Bekräfta nästa morgon att blockeringsbufferten med primära antikroppar fortfarande täcker alla avsnitt på bilden. Om inte, upprepa inkubationssteget i 3−4 timmar vid RT.
  7. Avlägsna primära antikroppar och tvätta 4x med 1x PBS i 10 min vid RT.
  8. Tillsätt sekundära antikroppar utspädda i blockeringsbufferten för att glida (300−400 μL/bild): Alexa Fluor 488 anti-kyckling IgG (1:500) och Cy3 anti-kanin IgG (1:500).
  9. Inkubera vid RT i 2 h. Håll bilderna täckta från ljus för att förhindra blekning av fluorofores.
  10. Avlägsna sekundära antikroppar och tvätta 2x med 1x PBS i 10 min.
  11. Inkubera med DAPI utspätt i PBS (1:5 000) i 15 min.
  12. Tvätta sektioner 1x med 1x PBS i 10 min.
  13. Ta bort överflödig PBS och torka i ~1−2 min innan du bäddar in 110 μl monteringsmedium.
  14. Täta med 24 x 60 mm täckslip och låt torka i minst 3 timmar före avbildning. Bildbilder inom 1−2 veckor efter att ha utfört immunhistokemi för att säkerställa optimal signal.

7. Immunberäkning för GFP, tdT och ytterligare antigener

  1. Utför steg 6.1−6.3.
  2. Ta bort blockeringsbufferten och tillsätt primära antikroppar i blockeringsbufferten till bilden (300−400 μL/bild).
    OBS: Vid färgning för tre eller flera antigener (dvs. GFP, tdT och ett protein av intresse) och antikroppen för det protein som är av intresse höjdes hos kanin, rekommenderas att den primära anti-tdT(get) primärantikroppen används vid en spädning på 1:500. Ett exempel på en primär antikroppsreaktion för tre antigener med alternativ tdT-färgning kan använda kyckling anti-GFP (1:500), get anti-tdT (1:500) och antikroppar mot det protein av intresse (dvs. kanin).
  3. Utför steg 6.5−6.7.
  4. Tillsätt en sekundär antikroppsblandning utspädd i blockeringsbufferten för att glida (300−400 μL/bild): Alexa Fluor 488 anti-kyckling IgG (1:500), Cy3 anti-get IgG (1:500) och Alexa Fluor 647 anti-kanin IgG (1:500).
  5. Utför steg 6.9−6.14.

8. Konfiktal bild förvärv och kvantifiering av MADM kloner

  1. Identifiera och dokumentera hjärnsektioner som innehåller kloner och deras platser i hjärnbarken.
    OBS: Antalet sektioner en klon spänner varierar beroende på när klonen var inducerad, CreERT2 föraren, och tidpunkten för analysen. Detta steg kan utföras på antingen ett konfokalmikroskop eller ett epifluorescensmikroskop.
  2. Med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop börjar du med att välja och konfigurera rätt laserlinjer och filter. För MADM hjärnor väljer du DAPI, GFP och tdT (excitering: 358 nm, 488 nm och 554 nm, respektive; topputsläpp: 461 nm, 507 nm och 581 nm). Se till att hålet är inställt på 1 luftig enhet för optimal bildkvalitet.
  3. För konfokala specifika inställningar, bild kloner med en 20x mål och 1x zoom. För bilder som ska användas i kvantifieringar använder du ett skanningshastighetspixelindavärde på 1,52−2,06 μs (värden 7−8 i bildinhämtningsprogrammet) utan genomsnitt. Justera laserintensiteten och få inställningarna för varje kanal efter behov.
    Beroende på vilken bildkvalitet som krävs kan inställningarna för skanningshastighet och medelvärde variera.
  4. När klonen är tydligt identifierad, ordna bildpaneler för att täcka alla relevanta avsnitt i klonen. Justera z-stacken så att alla MADM-märkta celler i klonen fångas med ett intervall på 1,5 μm/z-stackskiva. Justera det kaklade området så att hela bredden på cortex fångas upp vid avbildning av klonen (dvs. från pial yta till corpus callosum).
  5. Bild enskilda kloner som spänner över flera avsnitt i följd, vilket säkerställer att alla avsnitt utan celler i en klon fortfarande avbildas i syfte att 3D-rekonstruktion och korrekt tolkning av cellens rumslig information.
  6. Analysera varje avsnitt som innehåller celler i en MADM klon sekventiellt från rostral till caudal slutet av cortex. Skilja enskilda nervceller och glia baserat på deras morfologi och / eller markör färgning. Registrera positionsinformation parallellt baserat på respektive lagergränser som definieras av kärnfärgning (DAPI).
    OBS: Se figur 4 för representativa resultat för embryonal analys och figur 5 för representativa resultat för vuxenanalys.

9. Seriell 3D-rekonstruktion av kloner

OBS: 3D-rekonstruktionen av enskilda kloner som avbildas över seriella hjärnsektioner är användbar för visuell visning samt analys av 3D klonala arkitekturer och kan utföras enligt följande steg.

  1. Sy och säkring confocal kaklade bilder baserat på förvärv parametrar med hjälp av bild förvärv programvara. Öppna .czi-filen och kör sedan stitching-metoden under fliken Bearbetning i ZEN-programvaran (Zeiss).
  2. Exportera sydda bildstaplar som enskilda z-plan i TIFF-format. Öppna den sydda Czi-filen och kör sedan metoden Bildexport under fliken Bearbetning. För flerkanalsbilder exporterar du som röd/grön/blå bilder för efterföljande bildbehandling.
  3. Upprepa steg 9.1 och 9.2 för varje seriell hjärndel av en klon.
    OBS: För noggrann 3D-rekonstruktion måste även alla hjärnsektioner i en klon, inklusive de utan märkta celler, bearbetas.
  4. Sammanfoga enskilda bilder till en enda stapel för att börja från de mest rostral till de mest caudal z-plan med öppen källkod bildbehandling programvara såsom ImageJ / Fiji67,68.
    Obs: Alla tomma bilder i kanterna på varje hjärnsektion bör tas bort vid denna tidpunkt.
  5. Om det behövs korrigerar du bildstacken som hämtats från steg 9.4 för feljustering med hjälp av en ImageJ-plugin som kallas "MultiStackReg" genom att följa steg 9.5.1−9.5.5. Om bildjustering inte krävs går du vidare till steg 9.6.
    OBS: Denna plugin utför bildjustering av kanalen med högsta kontrast (vanligtvis DAPI) och sedan tillämpar den inspelade omvandlingen till andra kanaler, vilket möjliggör tillförlitlig bildjustering av flerkanaliga stackar. En extra plugin som kallas "TurboReg" måste förinstalleras.
    1. I ImageJ installerar du pluginsna "MultiStackReg" och "TurboReg".
    2. Öppna bildstacken med klonbilder som erhållits från steg 9.4 för att justeras. Dela kanaler i DAPI (blå), GFP (grön) och tdT (röd) inom Alternativet Färg under Fliken Bild.
    3. Kör "MultiStackReg" plugin för att justera DAPI-kanal genom "Rigid Body" transformation och spara omvandlingsfilen.
    4. Använd den sparade omvandlingsfilen på de andra två kanalerna med "MultiStackReg".
    5. Slå samman alla tre justerade kanaler och spara justerad stack.
  6. För att orientera klonen i ImageJ rotera högen av klonbilder som erhållits från steg 9.4 (eller steg 9.5.5 efter justering) i vertikal riktning med pialytan på toppen och corpus callosum längst ner. Beskär i xy planet om det behövs.
  7. För både kvalitativ presentation och kvantitativ analys, generera en maximal z-projektionsbild (steg 9.8) eller utföra 3D-rendering (steg 9.9) av klonen.
  8. Öppna bildstacken från steg 9.6 i ImageJ och välj Z-projektionsalternativ med projektionstyp Max intensitet. Detta kommer att generera en bild av hela klonen projiceras på samma plan.
  9. I ImageJ öppnar du bildstacken från steg 9.6 och väljer 3D Project z-funktion för att generera en 3D-visualisering av klonen som kan roteras.
    OBS: Det är viktigt i detta steg att mata in rätt segmentintervall motsvarande tjockleken på enskilda z-stackar under bildinsamling. Interpolationsverktyget bör användas för att ta bort mellanrum mellan segment.

Representative Results

MADM resulterar i rekonstituering av funktionella gröna och röda fluorescerande proteiner med två dotterceller som var och en uttrycker ett av de två fluorescerande proteinerna vid G2 X-kromosomsegregationshändelser (figur 1A). Eftersom MADM-händelser resulterar i permanent och distinkt märkning av de två ättlingslinjen kan kvantifierbar bedömning av gröna och röda dottercellsinstamningar (subkloner) utföras. Variabler inklusive delningsmönster (t.ex. symmetrisk kontra asymmetrisk) och potential (t.ex. antalet avkomman) hos den ursprungliga stamfadern kan bestämmas.  Kvantifiering av varje fluorescerande märkt subklon är informativ när retroaktivt avgöra om den ursprungliga stamcellen genomgår symmetriska proliferative divisioner, eller asymmetriska, neurogena divisioner vid tidpunkten för TM induktion. Tidigare studier grupperade Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2 härledde excitatoriska projektionkloner i cortex i två breda klasser7,11,46. Den första, kallas "symmetriska proliferative kloner", består i genomsnitt av ett stort antal nervceller, med både gröna och röda subkloner som innehåller fyra eller fler nervceller vardera. Den andra gruppen, "asymmetriska kloner" definierar en klass av kloner där "minoritet" subclone innehåller färre än tre nervceller och "majoritet" subclone, fyra eller fler11. Dessa definitioner är specifika för när RGPs och kan behöva ses över för andra regioner och vävnader i hjärnan. För båda klasserna av närkloner kommer avkomman att fördelas över de ytliga och djupa skikten.

Vid utformningen av MADM klonala studier finns det ett antal aspekter som måste beaktas. Den tid då MADM-händelser induceras genom administrering av TM är en viktig faktor (figur 3). För kortikala excitatoriska projektion neuron MADM kloner (dvs. med Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2) på E10, nästan alla RGPs fortfarande genomgår symmetriska divisioner11. Därför induktion på E10 med TM fångade flera rundor av proliferative RGP förstärkning och resulterade i kloner med höga neuron nummer. Emellertid, antalet RGPs på E10 var i allmänhet små och därmed TM administration genererade mycket få MADM händelser (ibland mindre än en per hjärna). Majoriteten av RGPs bytte från symmetriska till asymmetriska neurogena divisioner på runt E12. För att rikta strikt asymmetriska neurogena kloner var det bäst att inducera vid E12 eller senare (figur 3). Tiden mellan TM induktion och observera MADM rekombination händelser i cortex tenderade att vara mindre än 24 h. IP injektioner var den föredragna metoden för att administrera TM på embryonala stadier för denna metod eftersom det ledde till större reproducerbarhet i klonala induktion. Det är också viktigt att hålla TM dosen till ett minimum av två skäl. För det första, om MADM rekombinationshastigheten ökar, är sannolikheten för att inducera flera, kanske överlappande, kloner högre. För det andra, om för mycket TM levereras, kan en ökad abortfrekvens, embryoreabsorption och mindre skräpstorlekar observeras. Aborter i ungefär hälften av alla dräktiga dammar observerades när TM injektioner levererades vid E10. Denna frekvens minskade från E11 och framåt och minskade till cirka 1/3 av gravida dammar avbryta. För en sammanfattning av TM doser, induktionstider, och CreERT2 drivrutiner som används i tidigare MADM studier, se tabell 1. Reporter aktivitet i avsaknad av TM observerades med några TM-inducible CreERT2 drivrutiner69. Ectopic uttryck eller MADM rekombination händelser i avsaknad av TM observerades inte med Emx1-CreERT2 av Nestin-CreERT2 drivrutiner. Detta kan delvis bero på det faktum att TM-medierad kromosomal trans-rekombinationer inträffar vid cirka 1:1,000 till 1:10,000 lägre frekvens än cis-recombinations, vilket minskar sannolikheten för utomkvedshavandeskap MADM märkning.

En annan faktor att tänka på när man planerar en MADM klonala analys experiment är varaktigheten av studien. Varierande tidslängd mellan TM induktion och när experimentet analyserades (A) (tidsfönster) visar stamcellsdynamik över tid64. Korta embryonala tidsfönster (dvs. TM/E11−A/E13; TM/E11−A/E16) fångade dynamiken i embryonal neurogenes (figur 4). Om du jämför kloner från två eller fler tidsfönster får du kvantitativ inblick i antalet celler som produceras och hur neuronfördelningen varierar i olika stadier av härstamningsprogression64. För att fånga hela potentialen för enskilda kloner, är det nödvändigt att förlänga tidsfönstret analyseras till postnatala eller vuxna tidpunkter7,11,12. Exempel på neokortikala kloner som inducerats i embryot och analyseras hos den vuxna visas i figur 5. Observera, när neurogenes är mestadels klar och gliogenes ökar med E17. Cirka 1/6 neurogen RGP fortsätter också att generera astrocyter och/eller oligodendrocyter11.

Symmetriska kloner uppstår när RGPs genomgår en eller flera rundor av proliferative division11. RGP kloner inducerade mellan E10−E12 var i genomsnitt större i storlek och gav mer rumsliga funktioner i den slutliga neuron distribution (figur 4A-C). Kloner med nervceller relativt jämnt fördelade över djupa och ytliga lager tog på en "cylinder" form medan kloner med nervceller mer spridda i ytliga lager än djupare lager utvecklat en "kon" form11. För att helt fånga den rumsliga och morfologiska informationen om en klon var det nödvändigt att beräkningsmässigt rekonstruera varje klon med hjälp av sekventiella bilder. För att mäta klonisk dispersion jämfördes den maximala laterala spridningen (mätt i alla dimensioner) i ytliga lager (LII−VI) av en klon med neuronspridning i djupa lager (LV/LIV). Detta förhållande (fördelning övre:distribution lägre) gav en kvantifierbar avläsning av den övergripande klonformen.

Asymmetriska kloner, där minoritetsubklonen var tre eller mindre, gav insikt i neuronala produktionen av en enda RGP (figur 4D-F och figur 5A-F)7,11,12. Majoriteten (stora subclone) kan märkas antingen i rött eller grönt, med ett genomsnitt på cirka sju excitatoriska projektion nervceller per klon när de induceras med hjälp av en Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2(Figur 5G)7,11,12. Det totala antalet celler i en MADM klon kan ytterligare dissekeras genom att analysera fördelningen av nervceller i den stora subklon över ytliga och djupa lager. Minoritetspopulationen (liten subklon) var märkt med den ömsesidiga färgen och var i genomsnitt 1−2 celler per klon (figur 5H). Den totala "enhetsstorleken", som var i genomsnitt 8−9 nervceller, kunde beräknas genom att lägga till små och stora subkloner tillsammans (figur 5I)7,,11,12. Det är viktigt att notera att medan neuronala produktionen av RGPs var mycket förutsägbar, det fanns en grad av klonisk heterogenitet12,70.

Införandet av en mutation distala till MADM kassetten möjliggör generering av genetiska mosaiker, vilket ger en unik metod för att dissekera de molekylära regulatorerna av stamcells härstamning progression. Som sådan ger MADM en oöverträffad experimentell plattform för att studera en gens cellautonoma funktion (t.ex. dess koppling till mikrocefali eller makrocefali). Genom att jämföra kloner induceras i en MADM genetisk mosaik till kloner inducerad i en kontroll MADM, en mycket kvantitativ avläsning av förändringar i neuron nummer och distribution kan genereras. Tidigare MADM-baserade studier kvantifierade den cellautonoma funktionen av Otx1 vid mikrocefalibildning på klonnalnivå (se figur 6A-E för ett representativt exempel)11. I en annan studie, MADM klonal analys visat att Ndel1 inte cell-autonomt reglera projektion neuron nummer, utan i stället förmågan hos nyfödda nervceller att komma in eller migrera inom den när plattan, som senare bildar den vuxna cortex46. Dessa studier visade den mycket kvantitativa karaktären av MADM klonal analys i att studera cell-autonoma funktioner gener som reglerar kortikal utveckling. Det finns för närvarande inga exempel i litteraturen med MADM att studera gener inblandade i makrocefali på klonal nivå. Men i framtida studier analys av gener som är relevanta för kontroll av kortikal storlek i allmänhet kan ge mycket önskvärda insikter på molekylär och cellulär nivå.

Figure 1
Figur 1: MADM-principen för härstamningsspårning och klonal analys på enstamcellsnivå. (A)För att utföra härstamningsspårning och klonal analys med MADM skall det finnas två komponenter. Först måste MADM kassetter riktas till identiska lokus på homologa kromosomer. Kassetter består av två chimärlyssiga reportergener, eGFP (grön, [G]) och tandemdimmer Tomat (röd, tdT[T]). GT-kassetten innehåller N-ändstationen för eGFP och C-ändstationen för tdT, åtskilda av en intron som innehåller en loxP-plats. GT TG-kassetten är konstruerad omvänt, med N-ändstationen av tdT och C-ändstationen för eGFP. För det andra måste uttrycket av Cre recombinase förekomma i cellen som innehåller riktade MADM kassetter. Den loxP platser fungera som ett mål för Cre-medierad interchromosomal rekombination, vilket resulterar i rekonstituering av båda uttryck kassetter samtidigt. Om rekombination inträffar under G2-fasen av cellcykeln följt av X-segregering (G2-X), kommer de två dottercellerna att uttrycka ett av de två fluorescerande proteinerna. b)MADM-principen för genetisk mosaikanalys på en enda klonnivå. Mutanta alleler (punktmutationer, borttagningar, infogningar, loxP-flankerade villkorliga alleler som avbildas i figur 1B, etc.) kan introduceras distala till TG-MADM-kassetten via meiotisk rekombination (se figur 2 och Hippenmeyer et al.46 för detaljer om hur man inför mutanta alleler i MADM-systemet). Om en G2-X Cre recombinase-medierad interchromosomal trans-rekombination inträffar mellan MADM kassetter det resulterar i en GFP + homozygous mutant cell (GeneX-/- )för genen av intresse och en tdT + homozygous vilda typ cell (GeneX+/+) i en omärkt heterozygous miljö46,47,71. Alternativa märkningsresultat som inte används i klonalanalysen (dvs. gula blodkroppar) har tidigare beskrivits i detalj11,,46,47. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Avelssystem för generering av experimentella MADM-möss för härstamningsspårning. Avelssystem för generering av kontroll MADM(A) och Gene X MADM (B)experimentella MADM möss för klonal analys. För mer information om MADM avel paradigm se Beattie et al.7 och Hippenmeyer et al.7,46. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Tidsloppsparadigm för MADM-baserad klonal härstamningsanalys. Schematisk av den experimentella designtidsfönster. För longitudinella samplingsparadigmet förblev tidspunkten för kloninduktion konstant och tiden innan analysen varierade. Vid progressiv intervallprovtagning förblev tidspunkten för analys konstant, men induktionstiden varierade. En kombination av en eller båda metoderna kan användas beroende på vilka frågor som tas upp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: MADM klonal analys i utveckling och vuxen neocortex. TM-medierad MADM klon induktion i symmetriskt proliferative (TM vid E10) (A-C) och asymmetriskt neurogena (TM vid E12) (D-F)dela RGPs. Avbildade är individuella MADM-kloner in vivo i utvecklingen (TM/E10−A/E16 och TM/E12−A/E16) (B,E) och vuxna (TM/E10−A/P21 och TM/E12−A/P21) (C,F) i MADM-11GT/TG; Nestin-CreERT2+/- (B,E) och MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- (C,F). Neuron produktionen var oberoende av subclone färg och grön majoritet / minoritet subkloner kan jämföras med röd majoritet / minoritet subkloner under kontroll villkor7,11. Ungefärligt 1/6 av vuxen- kloner innehöll också astrocyter och/eller oligodendrocyter som indikeras av vita asterisker. Panelerna B och F reproduceras med tillstånd från Hippenmeyer et al.46 och Rulands och Simons72, respektive. CP = Kortikal platta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: MADM klonal analys för att kvantifiera RGP-medierad neuron utgång. Analys av excitatorisk neuron (enhet) produktion av enskilda neurogena RGPs på klonal nivå med MADM7,11. (A)Experimentellt paradigm för att inducera mestadels asymmetriska MADM kloner i utvecklingsbarken. b)Möjliga asymmetriska klonresultat med de flesta subklon märkta i antingen grönt eller rött(C)Representativa på varandra följande sektioner som spänner över en enda neurogen asymmetrisk klon(D,E)3D-rekonstruktionsbilder av representativa asymmetriska G2-X MADM-kloner med majoritetspopulation i rött(D)eller grönt(E)i MADM-11GT/TG. Emx1-CreERT2+/- med TM induktion på E12 och analys vid P21. Observera att både gröna och röda celler är vilda typer. (F)Schematisk som anger de två möjliga experimentella MADM klon resultat. G)Kvantifiering av storleken på den majoritetspopulation som härrör från förnyelse av rgps i MADM-11 kloner. H)Kvantifiering av minoritetspopulationens storlek till följd av förnyande av regionala kostnader för MADM-11-kloner. I)Kvantifiering av den enhetliga storleken på asymmetriska neurogena MADM-11 kloner. Hypotetiska värden kan representera medelvärdet ± SEM. Skalstång = 100 μm (D och E). TM = Tamoxifen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: MADM klonal analys för att studera gener som leder till mikrocefali och makrocefali. Hypotetiska MADM klonala analysresultat när de utför funktionella genetiska dissekering av kandidat gener som leder till mikrocefali eller makrocefali. För att dissekera de cellautonoma funktionerna hos en gen av intresse (Gene X) på neuron utgång, kräver MADM mutanta alleler som skall införas distala till MADM kassetter via meiotic rekombination (för detaljer hur man inför mutanta alleler i MADM-systemet se även figur 2, Hippenmeyer et al.46, och Laukoter et al.46,73). (A,B) Schematisk indikerar experimentella MADM paradigm för funktionell analys av klonala RGP-enheter. Den muterade subklonen kan antingen bilda minoriteten (A) eller majoritet (B) populationen. (C-E) Hypotetiska MADM klonala analysresultat vid kvantifiering kontroll MADM (vita barer), Gene-X MADM mikrocefali (grå barer) och Gene-X MADM makrocefali svarta barer) asymmetriska kloner. CCKvantifiering av storleken på majoritetspopulationen. D)Kvantifiering av minoritetsbefolkningens storlek. E)Kvantifiering av den enhetliga storleken på asymmetriska neurogena kloner. Hypotetiska värden kan representera medelvärdet ± SEM. S = Hypotetiskt scenario där skillnaden i subklocellnummer kan komma i betydelse i förhållande till kontrollen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: MADM klonala studier i litteraturen. Sammanfattning av studier i litteraturen som innehåller MADM klonala härstamningsexperiment, inklusive CreERT2-förare som används, TM-dos och injektionstid. Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).

Discussion

En metod för att använda MADM för att spåra cell härstamning av enskilda RGPs in vivo i utvecklingen neocortex beskrivs. I kombination med TM-inducible CreERT2kan MADM-händelser tidsinställas exakt, vilket ger en mycket kvalitativ och kvantitativ visuell avläsning av stamcellsdelningsmönster på cellnivå. Genom att titrera dosen av levererad TM kan i en idealisk situation erhållas i genomsnitt mindre än en klon per kortikal halvklot, vilket ger tillräcklig rumslig separation för att entydigt skilja enskilda kloner. Genom att upprätthålla vävnadsintegritet fångar denna metod också viktig information om position, morfologi och absoluta cellnummer. MADM kassetter på Chr. 117,11,12,46,56,57, på Chr. 751, och den ursprungliga MADM på Rosa2647,53,59 har använts i MADM klonala analysstudier. Den högupplösta enskilda celler ger oöverträffad inblick i både morfologi och klonala förhållandet mellan dotterceller och tillåter levande bildbehandling av växande stamceller och nya kloner46,52.

Kejsarsnitt och främjande av valpar för analys av kloner vid postnatala tidspunkter är ett nödvändigt och kritiskt steg i protokollet. Beroende på hälsotillståndet för den TM-behandlade gravida dammen, det kanske inte är nödvändigt att utföra ett kejsarsnitt. Hur ... än, höja den pups med en utveckla moder är stilla krevad, emydslig den TM- behandlat moder Maj har oroa ammande. Inga skillnader har observerats i behovet av att främja med olika CreERT2 förare. Både MADM linjer och fostermödrar upprätthålls på en outbred CD-1 bakgrund. Om kejsarsnitt inte är nödvändigt kan den TM-behandlade dräktiga dammen som används för att generera experimentella ungar återanvändas för ytterligare experimentella avel i enlighet med principerna i 3R (observera att detta endast kan göras om djurförsökslicenser godkänner denna praxis). Fostermödrar kan användas för att främja ungar inom 2 dagar efter att de föder, men högre framgång har observerats när fostermödrar föder samma dag som de experimentella möss som måste främjas. Därför är det viktigt att ställa in tidsinställda parningar för fostermödrar parallellt med experimentella parningar i steg 1.1. Upprätthållande en lik skräp antal så den original utveckla moder' skräp kanna förbättra överlevnaden hastigheten av främjat pups, och därför flyttanden något till all om original skräp Maj bli nödvändig. Ytterligare åtgärder som kan förbättra fosterhem inkluderar gnugga experimentörens handskar med skräp och mat (för att ta bort doften av handskarna); gnugga ungarna försiktigt efter kejsarsnittet med fragment av fostermoderns smutsiga kull och bo; och placering av valparna i nära kontakt med fostermoderns valpar innan de placering i fostermusburen.

Liksom i andra reporter-baserade härstamning spårningsmetoder, måste noggrann hänsyn tas när man väljer den optimala CreERT2 föraren för MADM klonala experiment. För det första måste den promotor som används uttrycka rekombinationen både tidsmässigt och rumsligt i föregångaren av intresse. Att hitta denna promotor kan vara en utmaning, eftersom vissa initiativtagare kan ändra uttrycksmönster eller tystas i olika utvecklingsstadier. För att förbättra celltyps specificitet har flera platsspecifika rekombinationer, som var och en drivs av separata promotorer, använts. När en eller båda rekombiner uttrycks i samma cell, detta etiketter cellen och dess avkomma med en fluorescerande reporter74,75,76,77. Sammanfattningsvis är det viktigt att välja en CreERT2-förare som är specifik för populationen av stamfader som analyseras.

Det mest kritiska steget i den här metoden är identifieringen av en klon, eftersom alla celler måste härledas entydigt från en enda rekombinationshändelse (steg 8.1). Titrering av TM-koncentration säkerställer mindre än ett kluster av röda/gröna celler per hjärnhalvklot och maximerar sannolikheten för att analysera en enda klon (steg 2.2)7,11. Kloner bör kasseras om angränsande cellkluster förekommer inom 500 μm från klonen av intresse. Därför är det viktigt att undersöka flera avsnitt före och efter utseendet på en klon för att säkerställa att det inte finns några ytterligare rekombination händelser i närheten. På grund av svagare signal av fluorofores, är det nödvändigt att utföra immunohistochemistry för eGFP och tdT i embryonala kloner (se avsnitt 6). Detta rekommenderas endast i vuxna kloner om ytterligare antigener kommer att kollidera. Vid bildframställning kloner, är det viktigt att fånga hela bredden av cortex där klonen är belägen (dvs. från pial yta till corpus callosum; se steg 8.4) för att inte missa några celler. Detta underlättar också bildjustering under bildbehandling (avsnitt 9). Avsnitt 8 i protokollet kräver ett inverterat konfokalmikroskop men kan anpassas beroende på vilken mikroskopinställning som finns tillgänglig. Epifluorescensmikroskopi kan användas, men konfokalmikroskopi rekommenderas eftersom detta leder till en minskning av ljuskontaminering från utanför fokusplanet. Det är också viktigt att laserintensiteten och förstärkningen justeras så att gröna, röda och gula celler otvetydigt kan identifieras. Oavsett inställning rekommenderas att använda ett mål på minst 20x för att säkerställa fullständig rumslig separation av nära placerade celler. Förutom att registrera det kortikala djupet av alla celler (steg 8.6) måste när regioner där klonerna finns identifieras med hjälp av en hjärnatlas som Allen Brain atlas eller andra stereotaxiska koordinatkartor. En fil namngivning paradigm bör också antas för att se klon bilder är lätta att identifiera. Följande information kan ingå i filnamngivningen: unikt bild-ID, datumbild togs, genotyp av djur, induktionsåldern, analysålder, bildnummer i förhållande till resten av bilderna från samma klon.

Införandet av en mutation distala till en MADM kassett distinkt tillåter generering av genetiska mosaiker71 och tillåter dissekering av molekylära regulatorer av härstamning och cell typ mångfald på klonal nivå7,11,46,62. För att skapa en genetisk mosaik med MADM måste MADM-kassetterna vara meiotiskt kopplade till samma kromosom som den gen av intresse (se figur 2 för avelsprogram). Detta begränsar den aktuella kloniska analysen med MADM till gener som finns på Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251, och Chr. 6 distala till Rosa26 locus47. Framtida studier kommer att använda MADM kassetter riktade till alla kromosomer, vilket möjliggör mosaik analys av praktiskt taget alla gener av musgenomet på klonal nivå.

Slutligen är MADM inte begränsat till analys av stamcellsceller i den utvecklande neocortexen. Studien av många stamceller nischer skulle kunna dra nytta av förmågan att lösa spatiotemporal arrangemang av clonally relaterade celler. Genom att tillämpa MADM på andra regioner i hjärnan, sjukdomstillstånd (t.ex. cancer) eller i andra vävnader47,,50,,51,,52,,53,54,,55,,56,57,58,59, visade studier härstamningsförhållanden hos kloner som härrör från olika klasser av progenitor och stamceller (se tabell 1 för aktuell lista över MADM-klonala studier). En annan intressant framtida tillämpning av MADM är att kombinera det med ytterligare funktionella eller subcellulära reportrar, vilket skulle öka graden av information som kan förvärvas från kloner.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar alla medlemmar i Hippenmeyer laboratoriet för diskussion, Bioimaging Facility, Life Science Facility, och prekliniska Anläggningen vid IST Österrike för teknisk support. Detta arbete stöddes av IST Austria institutionella fonder; R.B. fick stöd från Austrian Science Fund (FWF) Lise-Meitner-programmet (M 2416); N.A fick stöd från Österrikiska vetenskapsfonden (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC fick stöd från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för bidragsavtalet marie skłodowska-curie som beviljas av ISTplus som postdoktor. A.H. fick stöd från en ÖAW DOC (Doktorandstipendium vid Den österrikiska vetenskapsakademin). Denna studie stöddes också av Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 725780 LinPro) till S.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock) Braun 9204512N
1,4-diazabicyclooctane (DABCO) Roth 0718.2
10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock) Braun 8508429N
15 mL conical centrifuge Sarstedt 65.554.502
24 multi-well dishes Roth/Greiner Bio-one CE56.1
27- gauge x 3/4 needle (Sterican) Braun 16010256E
Corn oil Sigma C8267-500ML
Coverslips (24 x 60 mm #1) Thermo Fisher Scientific (Menzel) 15747592
Cryostat Cryostar NX70 Thermo Fisher Scientific 957000H
Dako Pen (Wax marker) Agilent S200230-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
Disposable microtome blade (MX35 Ultra) Thermo Fisher Scientific 705830
Fine Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools (FST) 11254-20
Glass anti-roll plate Histocom M 449980
Glycerol Sigma G5516
LSM 800 Confocal Zeiss
Mounting medium 25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)
Mowiol 4-88 Roth 0713.2
Normal donkey serum Innovative Research IGDNSER100ML
Paraformaldehyde Sigma 441244-1KG
Peristaltic pump 323E/D 400RPM Watson-Marlow 036.3124.00A
Sucrose Sigma S8501-5KG
Superfrost plus glass slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNT
Tamoxifen Sigma T5648
Tissue Embedding mold T-12 (22mm square) Polysciences Inc. 18986-1
Tissue-Tek O.C.T Sakura 4583
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Trizma hydrochloride Sigma 93363
Tween-20 Sigma P9416-100ML
Software and Plugins:
Fiji 1.52p Fiji
MultiStackReg 1.45 Download link
TurboReg EPFL Bioimaging
Zen Blue 2.6 Zeiss
Experimental Models: Organisms/Strains:
Mouse: Emx1-CreER The Jackson Laboratory JAX:027784
Mouse: MADM-11-GT The Jackson Laboratory JAX:013749
Mouse: MADM-11-TG The Jackson Laboratory JAX:013751
Primary antibodies:
Chicken anti-GFP 1:500 Aves Labs GFP-1020
Goat anti-tdTomato 1:500 Sicgen Antibodies AB8181-200
Rabbit anti-RFP 1:500 MBL PM005
Secondary antibodies:
Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500 Jackson Immuno Research 715-475-150
Donkey Anti-Goat Cy3 1:500 Jackson Immuno Research 705-165-147
Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500 Jackson Immuno Research 711-165-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malatesta, P., et al. Neuronal or glial progeny: regional differences in radial glia fate. Neuron. 37 (5), 751-764 (2003).
  2. Miyata, T., Kawaguchi, A., Okano, H., Ogawa, M. Asymmetric inheritance of radial glial fibers by cortical neurons. Neuron. 31 (5), 727-741 (2001).
  3. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  4. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).
  5. Desikan, R. S., Barkovich, A. J. Malformations of cortical development. Annals of Neurology. 80 (6), 797-810 (2016).
  6. Gao, R., Penzes, P. Common mechanisms of excitatory and inhibitory imbalance in schizophrenia and autism spectrum disorders. Current Molecular Medicine. 15 (2), 146-167 (2015).
  7. Beattie, R., et al. Mosaic Analysis with Double Markers Reveals Distinct Sequential Functions of Lgl1 in Neural Stem Cells. Neuron. 94 (3), 517-533 (2017).
  8. Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 800, 1-24 (2014).
  9. Lodato, S., Arlotta, P. Generating neuronal diversity in the mammalian cerebral cortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 699-720 (2015).
  10. Hansen, A. H., Duellberg, C., Mieck, C., Loose, M., Hippenmeyer, S. Cell Polarity in Cerebral Cortex Development-Cellular Architecture Shaped by Biochemical Networks. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 176 (2017).
  11. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  12. Llorca, A., et al. A stochastic framework of neurogenesis underlies the assembly of neocortical cytoarchitecture. eLife. 8, e51381 (2019).
  13. Ma, J., Shen, Z., Yu, Y. C., Shi, S. H. Neural lineage tracing in the mammalian brain. Current Opinion in Neurobiology. 50, 7-16 (2018).
  14. Caviness, V., Takahashi, T., Nowakowski, R. Numbers, time and neocortical neuronogenesis: a general developmental and evolutionary model. Trends in Neurosciences. 18 (9), 379-383 (1995).
  15. Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anatomy and Embryology. 156 (2), 115-152 (1979).
  16. Kessaris, N., et al. Competing waves of oligodendrocytes in the forebrain and postnatal elimination of an embryonic lineage. Nature Neuroscience. 9 (2), 173-179 (2006).
  17. Magavi, S., Friedmann, D., Banks, G., Stolfi, A., Lois, C. Coincident generation of pyramidal neurons and protoplasmic astrocytes in neocortical columns. The Journal of Neuroscience. 32 (14), 4762-4772 (2012).
  18. Anthony, T. E., Klein, C., Fishell, G., Heintz, N. Radial glia serve as neuronal progenitors in all regions of the central nervous system. Neuron. 41 (6), 881-890 (2004).
  19. Voigt, T. Development of glial cells in the cerebral wall of ferrets: direct tracing of their transformation from radial glia into astrocytes. The Journal of Comparative Neurology. 289 (1), 74-88 (1989).
  20. Amberg, N., Laukoter, S., Hippenmeyer, S. Epigenetic cues modulating the generation of cell-type diversity in the cerebral cortex. Journal of Neurochemistry. 149 (1), 12-26 (2019).
  21. Beattie, R., Hippenmeyer, S. Mechanisms of Radial Glia Progenitor Cell Lineage Progression. FEBS letters. 591 (24), 3993-4008 (2017).
  22. Telley, L., et al. Temporal patterning of apical progenitors and their daughter neurons in the developing neocortex. Science. 364 (6440), eaav2522 (2019).
  23. Oberst, P., et al. Temporal plasticity of apical progenitors in the developing mouse neocortex. Nature. 573 (7774), 370-374 (2019).
  24. Telley, L., et al. Sequential transcriptional waves direct the differentiation of newborn neurons in the mouse neocortex. Science. 351 (6280), 1443 (2016).
  25. Deppe, U., et al. Cell lineages of the embryo of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (1), 376-380 (1978).
  26. Woodworth, M. B., Girskis, K. M., Walsh, C. A. Building a lineage from single cells: genetic techniques for cell lineage tracking. Nature Reviews Genetics. 18 (4), 230-244 (2017).
  27. Masuyama, N., Mori, H., Yachie, N. DNA barcodes evolve for high-resolution cell lineage tracing. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 63-71 (2019).
  28. Legue, E., Joyner, A. L. Chapter Ten-Genetic Fate Mapping Using Site-Specific Recombinases. Methods in Enzymology. 477, 153-181 (2010).
  29. Postiglione, M. P., Hippenmeyer, S. Monitoring neurogenesis in the cerebral cortex: an update. Future Neurology. 9 (3), 323-340 (2014).
  30. Espinosa-Medina, I., Garcia-Marques, J., Cepko, C., Lee, T. High-throughput dense reconstruction of cell lineages. Open Biology. 9 (12), 190229 (2019).
  31. Hwang, B., et al. Lineage tracing using a Cas9-deaminase barcoding system targeting endogenous L1 elements. Nature Communications. 10 (1), 1234 (2019).
  32. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
  33. García-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnár, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. 141 (7), 1589-1598 (2014).
  34. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  35. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  36. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  37. Amitai-Lange, A., et al. A method for lineage tracing of corneal cells using multi-color fluorescent reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
  38. Vasistha, N. A., et al. Cortical and Clonal Contribution of Tbr2 Expressing Progenitors in the Developing Mouse Brain. Cerebral Cortex. 25 (10), 3290-3302 (2015).
  39. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  40. Siddiqi, F., et al. Fate mapping by piggyBac transposase reveals that neocortical GLAST+ progenitors generate more astrocytes than Nestin+ progenitors in rat neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
  41. Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  42. García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
  43. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  44. Kim, G. B., et al. Rapid Generation of Somatic Mouse Mosaics with Locus-Specific, Stably Integrated Transgenic Elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
  45. Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658 (2018).
  46. Hippenmeyer, S., et al. Genetic Mosaic Dissection of Lis1 and Ndel1 in Neuronal Migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  47. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  48. Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'homme et des vertébrés. , Maloine. Paris, France. (1911).
  49. Cowan, W. M. The emergence of modern neuroanatomy and developmental neurobiology. Neuron. 20 (3), 413-426 (1998).
  50. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  51. Hippenmeyer, S., Johnson, R. L., Luo, L. Mosaic analysis with double markers reveals cell-type-specific paternal growth dominance. Cell Reports. 3 (3), 960-967 (2013).
  52. Riccio, P., Cebrian, C., Zong, H., Hippenmeyer, S., Costantini, F. Ret and Etv4 promote directed movements of progenitor cells during renal branching morphogenesis. PLoS Biology. 14 (2), e1002382 (2016).
  53. Bonaguidi, M. A., et al. In vivo clonal analysis reveals self-renewing and multipotent adult neural stem cell characteristics. Cell. 145 (7), 1142-1155 (2011).
  54. Mayer, C., et al. Clonally Related Forebrain Interneurons Disperse Broadly across Both Functional Areas and Structural Boundaries. Neuron. 87 (5), 989-998 (2015).
  55. Muzumdar, M. D., et al. Clonal dynamics following p53 loss of heterozygosity in Kras-driven cancers. Nature Communications. 7, 12685 (2016).
  56. Shi, W., et al. Ontogenetic establishment of order-specific nuclear organization in the mammalian thalamus. Nature Neuroscience. 20, 516 (2017).
  57. Wong, S. Z. H., et al. In vivo clonal analysis reveals spatiotemporal regulation of thalamic nucleogenesis. PLoS Biology. 16 (4), e2005211 (2018).
  58. Xu, H. T., et al. Distinct Lineage-Dependent Structural and Functional Organization of the Hippocampus. Cell. 157 (7), 1552-1564 (2014).
  59. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All β Cells Contribute Equally to Islet Growth and Maintenance. PLoS Biology. 5 (7), e163 (2007).
  60. Ortiz-Alvarez, G., et al. Adult neural stem cells and multiciliated ependymal cells share a common lineage regulated by the geminin family members. Neuron. 102 (1), 159-172 (2019).
  61. Kaplan, E. S., Ramos-Laguna, K. A., Mihalas, A. B., Daza, R. A. M., Hevner, R. F. Neocortical Sox9+ radial glia generate glutamatergic neurons for all layers, but lack discernible evidence of early laminar fate restriction. Neural Development. 12 (1), 14 (2017).
  62. Lv, X., et al. TBR2 coordinates neurogenesis expansion and precise microcircuit organization via Protocadherin 19 in the mammalian cortex. Nature Communications. 10 (1), 3946 (2019).
  63. Mihalas, A. B., Hevner, R. F. Clonal analysis reveals laminar fate multipotency and daughter cell apoptosis of mouse cortical intermediate progenitors. Development. 145 (17), dev164335 (2018).
  64. Picco, N., et al. A mathematical insight into cell labelling experiments for clonal analysis. Journal of Anatomy. 235 (3), 687-696 (2019).
  65. Johnson, C. A., Ghashghaei, H. T. Sp2 regulates late neurogenic but not early expansive divisions of neural stem cells underlying population growth in the mouse cortex. Development. , (2020).
  66. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing Neurogenesis and Differentiation: Insights from Quantitative Clonal Analyses of Cerebellar Granule Cells. The Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301 (2008).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  69. Liu, Y., et al. Tamoxifen-independent recombination in the RIP-CreER mouse. PLoS One. 5 (10), e13533 (2010).
  70. Klingler, E., Jabaudon, D. Do progenitors play dice? eLife. 9, e54042 (2020).
  71. Hippenmeyer, S. Dissection of gene function at clonal level using mosaic analysis with double markers. Frontiers in Biology. 8 (6), 557-568 (2013).
  72. Rulands, S., Simons, B. D. Tracing cellular dynamics in tissue development, maintenance and disease. Current Opinion in Cell Biology. 43, 38-45 (2016).
  73. Laukoter, S., et al. Imprinted Cdkn1c genomic locus cell-autonomously promotes cell survival in cerebral cortex development. Nature Communications. 11 (1), 195 (2020).
  74. Daigle, T. L., et al. A Suite of Transgenic Driver and Reporter Mouse Lines with Enhanced Brain-Cell-Type Targeting and Functionality. Cell. 174 (2), 465-480 (2018).
  75. He, M., et al. Strategies and Tools for Combinatorial Targeting of GABAergic Neurons in Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 91 (6), 1228-1243 (2016).
  76. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  77. Plummer, N. W., et al. Expanding the power of recombinase-based labeling to uncover cellular diversity. Development. 142 (24), 4385 (2015).
  78. Imayoshi, I., Ohtsuka, T., Metzger, D., Chambon, P., Kageyama, R. Temporal regulation of Cre recombinase activity in neural stem cells. Genesis. 44 (5), 233-238 (2006).
  79. Sasaki, S., et al. Complete loss of Ndel1 results in neuronal migration defects and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7812-7827 (2005).
  80. Acampora, D., et al. Epilepsy and brain abnormalities in mice lacking the Otx1 gene. Nature Genetics. 14 (2), 218-222 (1996).
  81. Soeda, T., et al. Sox9-expressing precursors are the cellular origin of the cruciate ligament of the knee joint and the limb tendons. Genesis. 48 (11), 635-644 (2010).
  82. Klezovitch, O., Fernandez, T. E., Tapscott, S. J., Vasioukhin, V. Loss of cell polarity causes severe brain dysplasia in Lgl1 knockout mice. Genes & Development. 18 (5), 559-571 (2004).
  83. Pimeisl, I. M., et al. Generation and characterization of a tamoxifen-inducible EomesCreER mouse line. Genesis. 51 (10), 725-733 (2013).
  84. Nakagawa, N., et al. Memo1-Mediated Tiling of Radial Glial Cells Facilitates Cerebral Cortical Development. Neuron. 103 (5), 836-852 (2019).
  85. Nowotschin, S., et al. The T-box transcription factor Eomesodermin is essential for AVE induction in the mouse embryo. Genes & Development. 27 (9), 997-1002 (2013).
  86. Balordi, F., Fishell, G. Mosaic removal of hedgehog signaling in the adult SVZ reveals that the residual wild-type stem cells have a limited capacity for self-renewal. Journal of Neuroscience. 27 (52), 14248-14259 (2007).
  87. Liang, H., et al. Neural development is dependent on the function of specificity protein 2 in cell cycle progression. Development. 140 (3), 552-561 (2013).
  88. Guo, C., Yang, W., Lobe, C. G. A Cre recombinase transgene with mosaic, widespread tamoxifen-inducible action. Genesis. 32 (1), 8-18 (2002).
  89. Ahn, S., Joyner, A. L. In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog. Nature. 437 (7060), 894-897 (2005).
  90. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136 (2), 295-305 (2009).
  91. Koundakjian, E. J., Appler, J. L., Goodrich, L. V. Auditory neurons make stereotyped wiring decisions before maturation of their targets. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14078-14088 (2007).
  92. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic β-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  93. Sohal, D. S., et al. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circulation Research. 89 (1), 20-25 (2001).
  94. Ventura, A., et al. Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature. 445 (7128), 661-665 (2007).
  95. Johnson, L., et al. Somatic activation of the K-ras oncogene causes early onset lung cancer in mice. Nature. 410 (6832), 1111-1116 (2001).
  96. Tasic, B., et al. Extensions of MADM (mosaic analysis with double markers) in mice. PLoS One. 7 (3), e33332 (2012).
  97. Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129 (22), 5301-5312 (2002).
  98. Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
  99. Schuchardt, A., D'Agati, V., Larsson-Blomberg, L., Costantini, F., Pachnis, V. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret. Nature. 367 (6461), 380-383 (1994).
  100. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 877-892 (2002).
  101. Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. eLife. 4, e10036 (2015).
  102. Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454 (7200), 104-108 (2008).
  103. Lasrado, R., et al. Lineage-dependent spatial and functional organization of the mammalian enteric nervous system. Science. 356 (6339), 722-726 (2017).
  104. Matsuoka, T., et al. Neural crest origins of the neck and shoulder. Nature. 436 (7049), 347-355 (2005).

Tags

Biologi Utgåva 159 mosaikanalys med dubbla markörer (MADM) klonal analys härstamningsanalys stamcells- hjärnbarken radiell gliaprogenitor (RGP) neurogenes neurovetenskap neuroutveckling
Härstamning spårning och klonal analys i utvecklingen av hjärnbarken med mosaik analys med dubbla markörer (MADM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beattie, R., Streicher, C., Amberg,… More

Beattie, R., Streicher, C., Amberg, N., Cheung, G., Contreras, X., Hansen, A. H., Hippenmeyer, S. Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM). J. Vis. Exp. (159), e61147, doi:10.3791/61147 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter