Summary
Здесь мы описываем метод получения безмикробных цыплят из яиц коммерческой бройлерной линии Ross PM3. Этот метод может быть адаптирован для генерации безмикробных животных из других видов домашней птицы.
Abstract
Исследования вклада микробиоты кишечника в физиологию и иммунокомпетентность хозяина облегчаются наличием безмикробных животных моделей, которые считаются золотым стандартом. Гнездящиеся птицы являются идеальными моделями для производства безмикробных животных, так как нет необходимости выращивать их сородичей в стерильных условиях. Цыплята без микробов в основном получают из экспериментальных линий без специфических патогенов (SPF), которые плохо подходят для коммерческих куриных линий. Предложенный здесь метод позволил производить безмикробных цыплят из быстрорастущей бройлерной линии Ross PM3, обычно используемой птицеводческой промышленностью. Яйца были быстро собраны после откладки на ферме бройлеров. Они прошли строгий процесс дезактивации от сбора до введения в стерильный изолятор инкубации яиц. Птенцы были вылуплены и содержались в этих стерильных изоляторах в течение периода, необходимого для контроля их стерильности. Первоначально разработанный для экспериментальной линии белого леггорна SPF, настоящий протокол был адаптирован не только к линии бройлеров Ross PM3, но и к перепелам. Таким образом, он представляет собой надежную и легко адаптируемую процедуру для других видов домашней птицы и гнездящихся птиц, имеющих экономическое, биологическое или экологическое значение.
Introduction
Наблюдается резкое увеличение научного и популярного интереса к вкладу кишечной микробиоты в здоровье животных. Микробиота, состоящая из бактерий, вирусов, грибков и архей, населяющих различные ниши в кишечнике животного, прямо или косвенно участвует в регуляции воспалительных, инфекционных и метаболических заболеваний, поражающих не только виды млекопитающих, но и домашний скот, такой как домашняя птица1. Несколько животных моделей были разработаны для лучшего изучения вклада кишечной микробиоты в здоровье и болезни. Например, безмикробные и гнотобиотические животные позволяют изучать полное отсутствие микробов или известной микробиоты, соответственно, по физиопатологии инфекций 2,3. Однако производство и содержание этих животных требует специализированных методов и средств, а затраты, труд и навыки, необходимые для их содержания, ограничивают их доступ ко многим исследователям. Действительно, животные, свободные от микробов, должны регулярно контролироваться на предмет возможного загрязнения с использованием комбинации методов культивирования бактерий, микроскопии, серологии, грубой морфологии и методов обнаружения на основе секвенирования. Аналогичные процедуры также применяются к другим видам, таким как домашний скот, где животные, как правило, крупнее и требуют больших возможностей для их разведения и содержания, что может в некоторой степени препятствовать исследованиям микробиоты.
Птица, в частности куры, является краеугольным камнем животноводства во всем мире, с популяцией стада, которая может превышать 40 миллиардов птиц в год. Это самый важный источник животного белка в мире (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Кроме того, не существует культурных или религиозных табу, связанных с выращиванием или потреблением кур. Микробиота кишечника птицы играет важную роль в росте животных, коэффициенте конверсии корма, иммунитете, устойчивости к патогенам, среди многих других питательных, физиологических или патологических процессов4. Таким образом, поколение кур без микробов необходимо, чтобы подчеркнуть диалог между микробиотой и ее хозяином4. Даже если микробные сообщества населяют куриный яйцевод5, содержание яйца, только что отложенного здоровой курицей, в основном свободно от микроорганизмов, яичной скорлупы и мембран, обладающих механическими барьерами, чтобы избежать инвазии микроорганизмов4. Кроме того, птенцов легко выращивают в отсутствие их сородичей, что, в отличие от млекопитающих, позволяет производить безмикробных животных без родительского выращивания в стерильных условиях.
Экспериментальный центр «Инфектология фермерских, модельных и диких животных» (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, France, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) является частью Французской национальной инфраструктурной сети EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE освоила производство безмикробных цыплят для выполнения различных экспериментальных исследований более 40 лет 7,8,9,10,11. Эти животные были получены из специфических яиц без патогенов (SPF) из белой линии откладки леггорна, выращенной в закрытой селекции с 1970-х годов. В основном используемые для микробиологических исследований 7,8,9, птицы, свободные от микробов, испытывают возрождение интереса к таким вопросам, как вклад микробиоты кишечника в поведение 13, использование питательных веществ14, иммунное развитие15 и эндокринная активность. Даже если некоторые исследования были опубликованы с использованием линий бройлеров без микробов16, эти исследования остаются недопредставленными по сравнению с исследованиями с использованием экспериментальных линий слоя. Эволюция научных вопросов в сторону перекрестных помех между микробиотой и ее хозяином в здоровье и благополучии птицы привела нас к адаптации нашего исторического протокола для производства безмикробных бройлеров линии Ross PM3, наиболее используемой в мире линии бройлеров.
Protocol
Процедуры по уходу за животными проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Директивой Совета Европейских сообществ (86/609/EEC) и французскими правилами экспериментов на животных.
1. Подготовка изолятора
- Вставьте необходимые материалы в жесткий изолятор под положительным давлением: трубки 50 мл, пластиковые пипетки 5, 10 и 25 мл, облученный корм, автоклавная вода и стерильные герметичные пластиковые контейнеры.
- Заполните переносную бактерицидную ловушку 2% четвертичным раствором аммония.
- Стерилизуют изолятор три раза парами формальдегида, используя 60 мл формалина (24% формальдегида), добавленного к 30 г перманганата калия на кубический метр (м3). Перемещайте материалы внутри изолятора между каждой стерилизацией, чтобы обеспечить стерилизацию всех контактных поверхностей.
- Установите температуру изолятора на уровне 37 °C в течение не менее 2 дней перед введением яиц. Установите гигрометр на 65-70% относительной влажности (RH) в день введения.
2. Сбор и инкубация яиц
- Собирайте яйца с ферм, отобранных на основе хорошей скорости вылупления кур-несушек (не менее 80% на пике яйценоскости) и их хорошего санитарного состояния (т.е. отсутствия распространенных возбудителей птицы и отсутствия болезней в стаде). Визуально выбирайте чистые и безупречные яйца на беговой дорожке.
- Немедленно обеззаражьте поверхность яиц, окунув их на 5 мин в 1,5% раствор перуксусной кислоты комнатной температуры.
- Транспортируйте яйца в экспериментальную установку с помощью коробки, обеззараженной парами формальдегида.
- Хранить яйца в течение 24 часов при температуре 4 °C. Повторите процесс обеззараживания, описанный на этапе 2.2, и поместите их в инкубатор для вылупления (день 0) на 19 дней.
3. Штриховка
- На 19-й день проверьте фертильность, жизнеспособность (моторику) и развитие эмбриона, с помощью легкой яичной свечи в стерильных условиях. Вводите в стерильные изоляторы инкубации только живые эмбриональные яйца.
- Обеззараживайте выбранные яйца путем распыления 1,5% раствора перуксусной кислоты в течение 30 с или до тех пор, пока вся поверхность каждого яйца не будет покрыта. Яйца будут оставаться в контакте с спреем в течение 16 мин и 30 с во время переноса в изоляторы.
- Переложите яйца в стерильные изоляторы инкубации и промойте их стерильной деминерализованной водой, прежде чем поместить их в инкубационное пространство.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные вылупляются и выращиваются в стерильных изоляторах. Их кормят ad libitum коммерческой диетой, стерилизуемой гамма-облучением и поливают автоклавной водопроводной водой, предоставляемой диспенсерами для воды.
4. Анализ бактериологического статуса
- Через день после вылупления возьмите образец фекалий непосредственно из прямой кишки разных птенцов и объедините их в стерилизованную стеклянную трубку, чтобы сделать этот образец репрезентативным для всех животных в пределах данного изолятора.
- Чтобы образцы кала были более или менее жидкими, добавляют эквивалент 1 мл стула к 9 мл тиогликолатного бульона с ресазурином. Добавьте оставшийся образец фекалий в 9 мл мозгового инфузионного отвара сердца (BHI) и инкубируйте пробирки при 37 °C без встряхивания в течение 18-48 ч. Это позволит выращивать широкий спектр аэробных, факультативных аэробных и неверных анаэробных видов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тиогликолятный бульон с ресазурином предназначен для обнаружения нефацидных анаэробных бактерий, но он также позволяет обнаруживать аэробные бактерии. Эта среда соответствует европейским, американским и японским фармакопеям для тестирования на стерильность 18,19,20. - Визуально наблюдать, происходит ли какая-либо модификация в ростовых средах после 18 часов инкубации. Через 48 ч возьмите каплю из фекально-бульонной среды BHI, поместите ее на стеклянную горку и наблюдайте под микроскопом (40-кратное увеличение) за отсутствием или присутствием бактерий.
- Если есть подозрение на наличие бактерий, возьмите образец из культуры BHI и посейте его на пластины агара BHI. Инкубировать при 37 °C в течение 18-48 ч.
- Если колонии присутствуют, проведите высокопроизводительные методы, такие как масс-спектрометрия MALDI-TOF для точной микробной идентификации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 72 ч, если бактериологические анализы отрицательные, животные объявляются свободными от микробов.
Representative Results
Шесть прогонов генерации цыплят без микробов были проведены с яйцами Росса PM3, поступающими с двух разных французских ферм (таблица 1). В общей сложности было собрано 853 яйца, и после двух этапов дезактивации и 19 дней инкубации 86,40% были жизнеспособными. 490 из этих жизнеспособных яиц прошли третью стадию дезактивации и были введены в различные изоляторы инкубации, при среднем коэффициенте вылупления 79,80%. Это представляет собой показатель вылупления 68,94% по сравнению с первоначальным количеством собранных яиц.
Однако результаты вылупления существенно различаются в зависимости от проведенной серии: от 41,67% до 88,16% жизнеспособных цыплят по сравнению с количеством собранных яиц. Эти вариации также наблюдались среди разных люков во время одного и того же эксперимента. Поскольку не все изоляторы использовались для всех запусков, трудно исключить эффект, зависящий от изолятора. Однако этот эффект партии был напрямую коррелирован с возрастом кур-несушек (рисунок 1), где яйца, поступающие от старых кур, были менее жизнеспособными.
Шесть прогонов были проведены с использованием четырех различных изоляторов инкубации. После бактериологического контроля было подтверждено, что животные из 14 из 16 изоляторов не содержат микробов. Это соответствует показателю успеха в 87,5%. Два оставшихся изолятора были загрязнены одной экологической и непатогенной бактерией.
Все животные, используемые для научных экспериментов, оставались свободными от микробов до конца исследований, по крайней мере, в течение трех недель после вылупления.
Рисунок 1: Влияние возраста курицы на скорость вылупления На настоящем рисунке показаны показатели вылупления, наблюдаемые на основе возраста стада кур-несушек, выраженного в неделях укладки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Собранные яйца | D19 жизнеспособные яйца | D19 жизнеспособные яйца / собранные яйца | Яйца перекачивают в изолятор 1 | Яйца, переложенные в изолятор 2 | Яйца перекачивают в изолятор 3 | Яйца перекачивают в изолятор 4 | общее количество перенесенных яиц | жизнеспособные птенцы, вылупившиеся в изоляторе 1 | жизнеспособные птенцы вылупились в изоляторе 2 | жизнеспособные птенцы вылупились в изоляторе 3 | жизнеспособные птенцы вылупились в изоляторе 4 | общее количество жизнеспособных вылупившихся цыплят | жизнеспособный изолятор вылупившихся/перенесенных яиц1 | жизнеспособный изолятор инкубационных/перенесенных яиц2 | жизнеспособный изолятор инкубационных/перенесенных яиц3 | жизнеспособный изолятор вылупившихся/перенесенных яиц4 | жизнеспособные вылупившиеся/перенесенные яйца по всему миру | |
| Выполнить 1 | 101 | 93 | 92.08% | 23 | 24 | - | - | 47 | 22 | 23 | - | - | 45 | 95.65% | 95.83% | 95.74% | ||
| Выполнить 2 | 130 | 117 | 90.00% | 25 | 25 | 25 | 75 | 20 | 24 | 18 | - | 62 | 80.00% | 96.00% | 72.00% | 82.67% | ||
| Вылет 3 | 132 | 97 | 73.48% | 26 | - | 26 | 45 | 97 | 14 | - | 13 | 28* | 27 | 53.85% | 50.00% | 62.22% | 56.70% | |
| Бег 4 | 130 | 116 | 89.23% | 36 | 35 | - | - | 71 | 33 | 34 | - | - | 67 | 91.67% | 97.14% | 94.37% | ||
| Пробег 5 | 180 | 148 | 82.22% | 30 | 30 | 30 | 30 | 120 | 26* | 25 | 17 | 24 | 66 | 86.67% | 83.33% | 56.67% | 80.00% | 76.67% |
| Выполнить 6 | 180 | 166 | 92.22% | - | 40 | 40 | - | 80 | - | 35 | 35 | - | 70 | 86.67% | 87.50% | 87.50% | 87.50% | |
| Итог | 853 | 737 | 86.40% | 140 | 154 | 121 | 75 | 490 | 89 | 141 | 83 | 24 | 337 | 82.14% | 91.56% | 68.60% | 69.33% | 79.80% |
Таблица 1: Технические результаты различных экспериментов по штриховке. В настоящей таблице представлены результаты 6 проведенных серий безмикробного вылупления: количество собранных яиц, жизнеспособность эмбриона через 19 дней и жизнеспособные вылупившиеся птенцы в различных изоляторах.
Discussion
Несколько методов получения цыплят без микробов были ранее описаны 7,21,22. Простые методы, такие как представленный здесь, используют различные дезинфицирующие средства для снижения бактериальной нагрузки на поверхность яйцеклетки и в изоляторах. Наиболее часто используемыми дезинфицирующими средствами являются растворы хлорида ртути, четвертичного аммония, йодоформа, гипохлорита натрия и диоксида хлора. Результаты часто удовлетворительны. Однако, несмотря на доступность этих методов, немногие структуры могут применять метод и выращивать животных в больших масштабах, что делает использование кур без микробов относительно редким подходом, используемым только для решения очень конкретных научных вопросов. Методы, материалы и оборудование, описанные здесь, позволяют высокоэффективно вылуплять долю бройлеров без микробов, которые остаются здоровыми и стерильными в течение не менее 3 недель (продолжительность научных экспериментов, для которых они были произведены).
Результаты показывают, что адаптация протокола к производству безмикробных цыплят из яиц, собранных на коммерческих птицефабриках, проходит успешно. Опыт производства яиц SPF показывает, что эффективность инкубации зависит, прежде всего, от возраста кур-несушек и от качества собранных яиц. Оба параметра учитывались при выборе ферм и сборе яиц. При использовании того же метода средняя скорость вылупления бройлеров без микробов намного лучше, чем полученная при последнем производстве кур-несушек SPF на нашем объекте (79% против 35%), не влияя на стерильность животных (87% против 83%). Эти различия могут быть связаны с генетическим фоном птиц (бройлеры против несушек), а также с качеством яичной скорлупы, которая, вероятно, будет более хрупкой в яйцах животных SPF, содержащихся в закрытой селекции более 40 лет. Более того, мы также показываем, что транспортировка более 2 ч (от ферм до экспериментального объекта) не влияет на эффективность и качество вылупления.
Хотя процесс стерилизации, используемый для инкубационных изоляторов, и протокол обеззараживания яиц были оптимизированы, около 10% изоляторов не были свободны от микробов. Чтобы понять происхождение загрязнения, очень важно провести рутинный контроль стерильности вылупившихся изоляторов перед введением яиц.
Что касается статуса стерильности птиц, мы попытались применить методы, которые позволяют выращивать аэробные и нелестные анаэробные бактерии из образцов фекалий, тем самым гарантируя, что мы обнаруживаем живые, жизнеспособные бактерии. Эти методы соответствуют международным фармакопеям для тестирования стерильности и представляют собой быстрые, простые и экономичные методы, которые будут использоваться регулярно. Однако методы молекулярной биологии, такие как секвенирование гена 16S рРНК, хотя и не дают информации о жизнеспособности бактерий, могут быть применены для подтверждения наличия некультивируемых бактерий. Действительно, недавнее исследование показало, что некоторые бактерии микробиоты материнского яйцевода, по-видимому, переносятся эмбриону через яичный белок, позже составляя большую часть бактериальной популяции кишечника эмбриона5. Более того, другое исследование показало, что часть микробных колонизаторов, обнаруженных в ранних эмбрионах, была унаследована от материнских кур, а на микробное изобилие и разнообразие кишечника позже повлияли факторы окружающей среды и генетика хозяина во время развития23. Однако результаты этих исследований основаны на анализе последовательности ДНК, где большое количество этих бактерий может быть мертвым или невоспроизводимым в яичном белке (сильно загруженном антимикробными молекулами). Томас и его коллеги16 провели тестирование стерильности путем оценки культивируемых аэробных и факультативных аэробных бактерий путем фекального падения на пластины BHI, тем самым подчеркнув эффективность стандартных бактериологических методов для контроля стерильности без микробов. Более того, в предложенном протоколе мы использовали мониторинг роста в тиогликолатном бульоне с ресазурином, чтобы иметь возможность обнаруживать рост нефацидных анаэробных бактерий.
Протокол, уже используемый для производства безмикробных перепелов и кур, адаптируется к производству безмикробных животных из большинства гнездящихся птиц и предлагает перспективы для изучения вклада микробиоты в физиологию этих животных. Помимо использования этой модели для исследования взаимных взаимодействий хозяина и микробиоты в кишечнике птицы, она также может быть полезна для прикладных исследований. Например, он может быть использован для оценки безопасности и эффективности пробиотиков, полученных из комменсальных микроорганизмов куриного кишечника, для улучшения здоровья и устойчивости животных.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарны заводчикам и обществу Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Франция) за поставку оплодотворенных яиц. Данное исследование проводилось под эгидой исследовательского консорциума APR-IA «INTEGRITY» (2017-2019), который финансировался Région Centre Val de Loire, Франция.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
| 50 mL tubes | Falcon | ||
| BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
| Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
| Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
| Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
| Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
| Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
| Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
| Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
| Pipette aid | Drummond | ||
| Plastic pipettes | |||
| Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
| Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
| Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
| Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |
References
- Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. Chicken microbiota: importance and detection echnology. Frontiers in Veterinary Science. 23, 5 (2018).
- Grover, M., Kashyap, P. C. Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology. Neurogastroenterology & Motility. 26 (6), 745-748 (2014).
- Umesaki, Y. Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system. Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).
- Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fernández, M. E. Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection? Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374 (2019).
- Lee, S., et al. Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota. International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838 (2019).
- Hincke, M. T., et al. Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation. Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).
- Le Bars, J. Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens. Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).
- Lafont, J. P., et al. Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens. Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).
- Brée, A., Dho, M., Lafont, J. P. Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors. Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).
- Dozois, C. M., et al. Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli. Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).
- Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization. Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).
- Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Brée, A., Schouler, C. Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain. PLoS One. 7 (4), 35475 (2012).
- Kraimi, N., et al. Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica). of Experimental Biology. 222, (2019).
- Stanley, D., et al. Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens. Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).
- Han, Z., et al. Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens. Infection and Immunity. 85 (11), 0038017 (2017).
- Thomas, M., et al. Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken. mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).
- Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks. British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).
- European Pharmacopoeia. European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , reference 01/2009:20601 (2009).
- Japanese Pharmacopoeia, Japanese Pharmacopoeia. Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , made official March 31, 2009, by the Ministry of Health, Labour and Welfare Ministerial Notification No. 190 (2009).
- United States Pharmacopeia (USP). United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), December 1, 2008, official on May 1, 2009 (2008).
- Harrison, G. F. Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods. Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).
- Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. A simple method for production and rearing of the germ-free chick. J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).
- Ding, J., et al. Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens. Frontiers in Microbiology. 8, 1967 (2017).
