Summary
Her beskriver vi en metode for generering av bakteriefrie kyllinger fra egg av en kommersiell broilerlinje, Ross PM3. Denne metoden kan tilpasses for generering av bakteriefrie dyr fra andre fjærfearter.
Abstract
Studier av tarmmikrobiotabidraget til vertsfysiologien og immunokogenogenens forenkles av tilgjengeligheten av bakteriefrie dyremodeller, som regnes som gullstandarden. Nesting fugler er ideelle modeller for produksjon av bakteriefrie dyr siden det ikke er nødvendig å heve sine slektninger under sterile forhold. Bakteriefrie kyllinger genereres hovedsakelig fra spesifikke patogenfrie (SPF) eksperimentelle linjer, som er dårlig representative for kommersielle kyllinglinjer. Metoden foreslått her tillot produksjon av bakteriefrie kyllinger fra den raskt voksende broilerlinjen Ross PM3, ofte brukt av fjærfeindustrien. Egg ble raskt samlet etter legging på en broileroppdrettergård. De gjennomgikk en streng dekontamineringsprosess fra samlingen til introduksjonen i en steril egglukeisolator. Kyllingene har blitt klekket ut og holdt i disse sterile isolatorene i den perioden som er nødvendig for å kontrollere steriliteten. Opprinnelig utviklet for en eksperimentell SPF hvit leghorn linje, den nåværende protokollen har blitt tilpasset ikke bare til Ross PM3 broiler linje, men også til vaktler. Det representerer derfor en robust og lett tilpasningsdyktig prosedyre til andre fjærfearter og hekkende fugler av økonomisk, biologisk eller økologisk relevans.
Introduction
Det har vært en dramatisk økning i vitenskapelig og populær interesse for tarmmikrobiotaens bidrag til dyrehelsen. Mikrobiota, bestående av bakterier, virus, sopp og arkaea som bor i forskjellige nisjer i dyrets tarm, er implisert direkte eller indirekte i reguleringen av inflammatoriske, smittsomme og metabolske sykdommer som ikke bare påvirker pattedyrarter, men også husdyr, som fjærfe1. Flere dyremodeller ble utviklet for bedre å studere tarmmikrobiotaens bidrag til helse og sykdom. For eksempel tillater bakteriefrie og gnotobiotiske dyr studiet av det totale fraværet av mikrober eller av en kjent mikrobiota, henholdsvis på fysiopatologien til infeksjoner 2,3. Men å generere og vedlikeholde disse dyrene krever spesialiserte teknikker og fasiliteter, og kostnadene, arbeidskraften og ferdighetene som kreves for å opprettholde dem begrenser tilgangen til mange forskere. Faktisk må bakteriefrie dyr overvåkes regelmessig for mulig forurensning ved hjelp av en kombinasjon av bakteriedyrkingsmetoder, mikroskopi, serologi, brutto morfologi og sekvenseringsbaserte deteksjonsteknikker. Lignende prosedyrer gjelder også for andre arter, for eksempel husdyr, hvor dyr generelt er større og krever større anlegg for avl og vedlikehold, noe som til en viss grad kan hemme forskning på mikrobiota.
Fjærfe, mer spesifikt kyllinger, er hjørnesteinen i husdyrproduksjon over hele verden, med en flokkpopulasjon som kan overstige 40 milliarder fugler per år. Det er den viktigste kilden til animalsk protein i verden (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Videre er det ingen kulturelle eller religiøse tabuer knyttet til oppdrett eller forbruk av kyllinger. Fjærfe tarmmikrobiota er viktig involvert i dyrets vekst, fôrkonverteringsforhold, immunitet, patogenresistens, blant mange andre ernæringsmessige, fysiologiske eller patologiske prosesser4. Genereringen av bakteriefrie kyllinger er derfor uunnværlig for å understreke dialogen mellom mikrobiota og verten4. Selv om mikrobielle samfunn bor i kylling ovidukten5, er innholdet av et egg ferskt lagt av en sunn høne for det meste fri for mikroorganismer, eggeskallet og membranene som har mekaniske barrierer for å unngå mikroorganismeinvasjon4. I tillegg blir kyllinger lett oppdratt i fravær av sine slektninger, som i motsetning til pattedyr tillater produksjon av bakteriefrie dyr uten foreldreoppdrett under sterile forhold.
Det eksperimentelle anlegget "Infectiology of Farm, Model and Wild Animals" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, France, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) er en del av det franske nasjonale infrastrukturnettverket EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE har mestret produksjonen av bakteriefrie kyllinger for å utføre ulike eksperimentelle studier i mer enn 40 år 7,8,9,10,11. Disse dyrene ble produsert av spesifikke patogenfrie (SPF) egg fra en hvit leghorn leggingslinje hevet i lukket avl siden 1970-tallet. Hovedsakelig brukt til mikrobiologiske studier 7,8,9, opplever bakteriefrie fugler en gjenoppblomstring av interesse med spørsmål som tarmmikrobiotaens bidrag til atferd13, næringsutnyttelse14, immunutvikling15 og endokrine aktivitet. Selv om noen studier har blitt publisert ved hjelp av bakteriefrie broilerlinjer16, forblir disse studiene underrepresentert sammenlignet med studier ved hjelp av eksperimentelle laglinjer. Utviklingen av vitenskapelige spørsmål mot krysstale mellom mikrobiota og dens vert i fjærfe helse og velferd har ført oss til å tilpasse vår historiske protokoll for å produsere bakteriefrie broilere av Ross PM3 linjen, verdens mest utnyttede broiler kylling linje.
Protocol
Dyrepleieprosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fastsatt av EUs rådsdirektiv (86/609/EEC) og av de franske forskriftene om dyreforsøk.
1. Isolator forberedelse
- Sett de nødvendige materialene inn i en stiv isolator under positivt trykk: 50 ml rør, 5, 10 og 25 ml plastpipetter, bestrålet fôr, autoklavert vann og sterile forseglede plastbeholdere.
- Fyll overførings bakteriedreoblet felle med en 2% kvartær ammoniumløsning.
- Steriliser isolatoren tre ganger med formaldehyddamp ved å bruke 60 ml formalin (24% formaldehyd) tilsatt til 30 g kaliumpermanganat per kubikkmeter (m3). Beveg materialene inne i isolatoren mellom hver sterilisering for å sikre sterilisering av alle kontaktflater.
- Sett isolatortemperaturen til 37 °C i minst 2 dager før du introduserer eggene. Sett hygrometeret til 65-70% relativ fuktighet (RH) på introduksjonsdagen.
2. Eggkolleksjon og inkubasjon
- Samle eggene fra gårder valgt på grunnlag av en god klekkingshastighet av legghøner (minst 80% på toppen av eggproduksjonen) og deres gode sanitærstatus (dvs. fravær av vanlige fjærfepatogener og fravær av sykdommer i flokken). Velg visuelt rene og feilfrie egg på tredemøllen.
- Dekontaminer straks eggoverflaten ved å dyppe dem i 5 min i en 1,5% peracetic acid løsning ved romtemperatur.
- Transport eggene til det eksperimentelle anlegget ved hjelp av en boks dekontaminert med formaldehyddamp.
- Oppbevar eggene i 24 timer ved 4 °C. Gjenta dekontamineringsprosessen som er beskrevet i trinn 2.2, og plasser dem i en klekkeinkubator (dag 0) i 19 dager.
3. Klekking
- På dag 19, verifisere fruktbarheten, levedyktigheten (motility) og embryoutviklingen ved å candling dem ved hjelp av en lett egg stearinlys under sterile forhold. Introduser bare levende embryonerte egg i de sterile klekkeisolatorene.
- Dekontaminer de valgte eggene ved å sprøyte 1,5% peracetic acid løsning i 30 s eller til hele overflaten av hvert egg er dekket. Egg vil holde kontakten med sprayen i 16 min og 30 s under overføringen til isolatorer.
- Overfør eggene til de sterile klekkeisolatorene og skyll dem med sterilt demineralisert vann før du plasserer dem i klekkerommet.
MERK: Dyr klekkes og oppdras i sterile isolatorer. De blir matet ad libitum med et kommersielt kosthold sterilisert av gammabestråling og vannet med autoklavert vann fra springen levert av vanndispensere.
4. Bakteriologisk statusanalyse
- En dag etter klekking, ta en fekal prøve direkte fra endetarmen til forskjellige kyllinger og samle dem i et sterilisert glassrør for å gjøre denne prøven representativ for alle dyr i en gitt isolator.
- De fekale prøvene er mer eller mindre flytende, tilsett en tilsvarende 1 ml avføring til 9 ml tioglykolatbuljong med resazurin. Tilsett den gjenværende fekale prøven til 9 ml hjernehjerteinfusjonsbuljong (BHI) og inkuber rørene ved 37 °C uten å riste i 18 til 48 timer. Dette vil tillate veksten av et bredt spekter av aerobe, fakultets aerobe og ikke-raske anaerobe arter.
MERK: Thioglykolatbuljong med resazurin er beregnet for påvisning av ikke-raske anaerobe bakterier, men det muliggjør også påvisning av aerobe bakterier. Dette mediet overholder de europeiske, amerikanske og japanske farmakopéene for sterilitetstesting 18,19,20. - Observer visuelt om noen endring i vekstmediet oppstår etter 18 timers inkubasjon. Etter 48 timer, ta en dråpe fra BHI fekal-buljong media, plasser den på en glasssklie og observere under et mikroskop (40X forstørrelse) for fravær eller tilstedeværelse av bakterier.
- Hvis det er mistanke om tilstedeværelse av bakterier, ta en prøve fra BHI-kultur og frø den på BHI agarplater. Inkuber ved 37 °C i 18 til 48 timer.
- Hvis kolonier er til stede, utfør høygjennomstrømningsteknikker som MALDI-TOF massespektrometri for presis mikrobiell identifikasjon.
MERK: Etter 72 timer, hvis de bakteriologiske analysene er negative, blir dyrene erklært bakteriefrie.
Representative Results
Seks løp av bakteriefri kyllinggenerasjon ble gjennomført med Ross PM3-egg som kom fra to forskjellige franske gårder (tabell 1). Totalt 853 egg ble samlet inn og etter to dekontamineringstrinn og 19 dager med inkubasjon var 86,40% levedyktige. 490 av disse levedyktige eggene gjennomgikk et tredje dekontamineringstrinn og ble introdusert i ulike klekkeisolatorer, for en gjennomsnittlig klekkehastighet på 79,80%. Dette representerer en klekkingshastighet på 68,94% sammenlignet med det første antall egg som samles inn.
Klekkeresultatene varierer imidlertid betydelig i henhold til serien som utføres: fra 41,67% til 88,16% av levedyktige kyllinger sammenlignet med antall egg som samles inn. Disse variasjonene ble også observert blant de forskjellige lukene under samme eksperiment. Siden ikke alle isolatorer har blitt brukt til alle løp, er det vanskelig å utelukke en isolatoravhengig effekt. Denne batcheffekten var imidlertid direkte korrelert med legghønsens alder (figur 1), hvor egg som kommer fra eldre høner var mindre levedyktige.
De seks løypene ble utført ved hjelp av fire forskjellige klekkeisolatorer. Etter bakteriologisk kontroll ble dyrene fra 14 av de 16 isolatorene bekreftet å være bakteriefrie. Dette tilsvarer en suksessrate på 87,5%. De to gjenværende isolatorene ble forurenset av en enkelt miljø- og ikke-patogen bakterie.
Alle dyr som brukes til de vitenskapelige forsøkene forble bakteriefrie til slutten av studiene, i minst tre uker etter klekking.
Figur 1: Effekt av hønsens alder på klekkingshastighet Den nåværende figuren fremhever klekkingsratene som observeres basert på legghønsflokkens alder, uttrykt i uker med legging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Innsamlede egg | D19 levedyktige egg | D19 levedyktige egg/oppsamlede egg | Egg transferert til isolator 1 | Egg transferert til isolator 2 | Egg transferert til isolator 3 | Egg transferert til isolator 4 | totalt overførte egg | levedyktige kyllinger klekket ut i isolator 1 | levedyktige kyllinger klekket ut i isolator 2 | levedyktige kyllinger klekket ut i isolator 3 | levedyktige kyllinger klekket ut i isolator 4 | totalt av levedyktige klekkede kyllinger | levedyktig klekket / overført egg isolator1 | levedyktig klekket / overført egg isolator2 | levedyktig klekket / overført egg isolator3 | levedyktig klekket / overført egg isolator4 | levedyktig klekket / overført egg globalt | |
| Kjør 1 | 101 | 93 | 92.08% | 23 | 24 | - | - | 47 | 22 | 23 | - | - | 45 | 95.65% | 95.83% | 95.74% | ||
| Kjør 2 | 130 | 117 | 90.00% | 25 | 25 | 25 | 75 | 20 | 24 | 18 | - | 62 | 80.00% | 96.00% | 72.00% | 82.67% | ||
| Kjør 3 | 132 | 97 | 73.48% | 26 | - | 26 | 45 | 97 | 14 | - | 13 | 28* | 27 | 53.85% | 50.00% | 62.22% | 56.70% | |
| Kjør 4 | 130 | 116 | 89.23% | 36 | 35 | - | - | 71 | 33 | 34 | - | - | 67 | 91.67% | 97.14% | 94.37% | ||
| Kjør 5 | 180 | 148 | 82.22% | 30 | 30 | 30 | 30 | 120 | 26* | 25 | 17 | 24 | 66 | 86.67% | 83.33% | 56.67% | 80.00% | 76.67% |
| Kjør 6 | 180 | 166 | 92.22% | - | 40 | 40 | - | 80 | - | 35 | 35 | - | 70 | 86.67% | 87.50% | 87.50% | 87.50% | |
| Total | 853 | 737 | 86.40% | 140 | 154 | 121 | 75 | 490 | 89 | 141 | 83 | 24 | 337 | 82.14% | 91.56% | 68.60% | 69.33% | 79.80% |
Tabell 1: Tekniske resultater av de ulike klekkeforsøkene. Det nåværende bordet fremhever resultatene av den 6 serien av bakteriefri klekking utført: antall egg samlet, levedyktighet av embryoet på 19 dager og levedyktige klekkede kyllinger i de ulike isolatorene.
Discussion
Flere metoder for å generere bakteriefrie kyllinger har tidligere blitt beskrevet 7,21,22. Enkle metoder, som den som presenteres her, bruker forskjellige desinfeksjonsmidler for å redusere bakteriebelastningen i eggoverflaten og i isolatorene. De mest brukte desinfeksjonsmidlene er mercuric klorid, kvartær ammonium, iodoform, natriumhypokloritt og klordioksidløsninger. Resultatene er ofte tilfredsstillende. Til tross for tilgjengeligheten av disse metodene, kan få strukturer imidlertid bruke metoden og heve dyrene i stor skala, og dermed gjøre bruken av bakteriefrie kyllinger til en relativt sjelden tilnærming, bare brukt til å ta opp svært spesifikke vitenskapelige spørsmål. Metodene, materialene og utstyret som er beskrevet her, tillater en svært effektiv klekkingsandel av bakteriefrie broilere, som forblir sunne og sterile i minst 3 uker (varigheten av de vitenskapelige forsøkene de ble produsert).
Resultatene viser at tilpasningen av protokollen til produksjon av bakteriefrie kyllinger fra egg samlet i kommersielle fjærfe gårder er vellykket. Erfaring med SPF eggproduksjon avslører at klekkingseffektiviteten først og fremst avhenger av legghønsens alder og kvaliteten på innsamlede egg. Begge parametrene ble tatt i betraktning når gårder ble valgt og egg samlet inn. Ved hjelp av samme metode er den gjennomsnittlige klekkingshastigheten til bakteriefrie broilere mye bedre enn den som ble oppnådd i den siste produksjonen av SPF-legghøner på vårt anlegg (79% vs 35%), uten å påvirke dyrets sterilitet (87% vs 83%). Disse forskjellene kan være knyttet til fuglens genetiske bakgrunn (broilere versus lag) samt til kvaliteten på eggeskallet, som sannsynligvis vil være mer skjøre i eggene til SPF-dyrene, holdt i lukket avl i mer enn 40 år. Videre viser vi også at transport av mer enn 2 timer (fra gårdene til det eksperimentelle anlegget) ikke påvirker klekkingseffektivitet og kvalitet.
Selv om steriliseringsprosessen som ble brukt til klekking av isolatorer og protokollen for eggdekontaminering ble optimalisert, var rundt 10% av isolatorene ikke bakteriefrie. For å forstå opprinnelsen til forurensningen, er det svært viktig å utføre rutinemessig sterilitetskontroll av de klekkede isolatorene før eggintroduksjon.
Når det gjelder fuglenes sterilitetsstatus, prøvde vi å bruke metoder som tillater vekst av aerobe og ikke-raske anaerobe bakterier fra fekale prøver, og dermed sikre at vi oppdager levende, levedyktige bakterier. Disse metodene overholder internasjonale farmakopeier for sterilitetstesting og representerer raske, enkle og kostnadsreduserende teknikker som skal brukes rutinemessig. Imidlertid kan molekylærbiologiske teknikker som 16S rRNA gensekvensering, men ikke gi informasjon om bakterie levedyktighet, brukes til bekreftelse av tilstedeværelsen av ikke-cultivable bakterier. Faktisk antydet en nylig studie at noen bakterier av mors oviduktmikrobiota ser ut til å bli overført til embryoet gjennom eggehviten, som senere utgjør det meste av embryo tarmbakteriell populasjon5. Videre antydet en annen studie at en del av de mikrobielle kolonisatorene som lå i tidlige embryoer ble arvet fra mødrehøner, og tarmmikrobiell overflod og mangfold ble senere påvirket av miljøfaktorer og vertsgenetikk under utvikling23. Resultatene av disse studiene er imidlertid basert på DNA-sekvensanalyse, hvor et stort antall av disse bakteriene kan være døde eller ikke replikerbare i eggehviten (sterkt lastet med antimikrobielle molekyler). Thomas og samarbeidspartnere16 utførte sterilitetstesting gjennom vurdering av dyrkbare aerobe og fakultets aerobe bakterier gjennom fekal dropping på BHI-plater, og fremhevet dermed effektiviteten av standard bakteriologiske metoder for bakteriefri sterilitetskontroll. Videre brukte vi i den foreslåtte protokollen vekstovervåking i tioglykolatbuljong med resazurin for å kunne oppdage veksten av ikke-raske anaerobe bakterier.
Allerede brukt til produksjon av bakteriefrie vaktler og kyllinger, er protokollen tilpasningsdyktig til produksjon av bakteriefrie dyr fra de fleste hekkende fugler og tilbyr perspektiver for studiet av mikrobiotabidrag til fysiologien til disse dyrene. Foruten bruk av denne modellen for å undersøke vert-mikrobiota gjensidige interaksjoner i fjærfe tarmen, kan det også være nyttig for anvendt forskning. For eksempel kan den brukes til å vurdere sikkerhet og effekt av probiotika avledet fra kylling tarmkommensale mikroorganismer for å forbedre dyrets helse og robusthet.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for oppdretterne og samfunnet Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Frankrike) for tilførsel av befruktede egg. Denne studien ble utført i regi av forskningskonsortiet APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019), som ble finansiert av Région Centre Val de Loire, Frankrike.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
| 50 mL tubes | Falcon | ||
| BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
| Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
| Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
| Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
| Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
| Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
| Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
| Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
| Pipette aid | Drummond | ||
| Plastic pipettes | |||
| Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
| Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
| Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
| Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |
References
- Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. Chicken microbiota: importance and detection echnology. Frontiers in Veterinary Science. 23, 5 (2018).
- Grover, M., Kashyap, P. C. Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology. Neurogastroenterology & Motility. 26 (6), 745-748 (2014).
- Umesaki, Y. Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system. Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).
- Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fernández, M. E. Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection? Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374 (2019).
- Lee, S., et al. Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota. International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838 (2019).
- Hincke, M. T., et al. Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation. Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).
- Le Bars, J. Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens. Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).
- Lafont, J. P., et al. Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens. Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).
- Brée, A., Dho, M., Lafont, J. P. Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors. Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).
- Dozois, C. M., et al. Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli. Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).
- Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization. Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).
- Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Brée, A., Schouler, C. Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain. PLoS One. 7 (4), 35475 (2012).
- Kraimi, N., et al. Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica). of Experimental Biology. 222, (2019).
- Stanley, D., et al. Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens. Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).
- Han, Z., et al. Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens. Infection and Immunity. 85 (11), 0038017 (2017).
- Thomas, M., et al. Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken. mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).
- Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks. British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).
- European Pharmacopoeia. European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , reference 01/2009:20601 (2009).
- Japanese Pharmacopoeia, Japanese Pharmacopoeia. Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , made official March 31, 2009, by the Ministry of Health, Labour and Welfare Ministerial Notification No. 190 (2009).
- United States Pharmacopeia (USP). United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), December 1, 2008, official on May 1, 2009 (2008).
- Harrison, G. F. Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods. Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).
- Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. A simple method for production and rearing of the germ-free chick. J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).
- Ding, J., et al. Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens. Frontiers in Microbiology. 8, 1967 (2017).
