Summary
ここでは、市販のブロイラー系統であるRoss PM3の卵から無菌のひよこの生成方法について説明する。この方法は、他の家禽種からの無菌動物の生成に適合させることができる。
Abstract
宿主の生理機能および免疫能力に対する腸内微生物叢の寄与の研究は、ゴールドスタンダードと考えられている無菌動物モデルの利用可能性によって促進される。巣作りの鳥は、無菌条件下で親戚を育てる必要がないため、無菌動物の生産に理想的なモデルです。無菌ニワトリは、主に特定の病原体フリー(SPF)実験ラインから生成され、商業ニワトリラインの代表性はあまりありません。ここで提案された方法は、家禽産業で一般的に使用されている急成長しているブロイラーラインRoss PM3から無菌鶏を生産することを可能にしました。卵はブロイラーブリーダー農場で産卵した後すぐに集められました。彼らは、無菌卵孵化アイソレーターでの収集から導入まで、厳格な除染プロセスを受けました。ひよこは孵化され、それらの無菌性を制御するために必要な期間中、これらの無菌アイソレータに保管されています。もともと実験的なSPFホワイトレッグホーンライン用に開発された現在のプロトコルは、Ross PM3ブロイラーラインだけでなく、ウズラにも適応されています。したがって、それは経済的、生物学的または生態学的関連性のある他の家禽種および営巣鳥に堅牢で容易に適応可能な手順を表す。
Introduction
動物の健康に対する腸内微生物叢の寄与に関する科学的および一般的な関心が劇的に増加しています。動物の腸内の異なるニッチに生息する細菌、ウイルス、真菌、および古細菌からなる微生物叢は、哺乳類種だけでなく家禽などの家畜にも影響を及ぼす炎症性、感染性および代謝性疾患の調節に直接的または間接的に関与している1。健康と病気に対する腸内微生物叢の寄与をよりよく研究するために、いくつかの動物モデルが開発されました。例えば、無菌および膠着性動物は、感染症の生理病理学に関する微生物または既知の微生物叢の完全な不在の研究を可能にする2,3。しかし、これらの動物を生産および維持するには、特殊な技術と設備が必要であり、それらを維持するために必要なコスト、労力、およびスキルは、多くの研究者へのアクセスを制限します。実際、無菌動物は、細菌培養法、顕微鏡検査、血清学、肉眼形態学、およびシーケンシングベースの検出技術の組み合わせを使用して、汚染の可能性について定期的に監視する必要があります。同様の手順は、家畜などの他の種にも適用され、動物は一般的に大きく、繁殖と維持のためにより大きな施設を必要とし、微生物叢の研究をある程度妨げる可能性があります。
家禽、より具体的には鶏は、世界中の家畜生産の礎石であり、群れの人口は年間400億羽を超える可能性があります。それは世界で最も重要な動物性タンパク質源です(http://www.fao.org/poultry-production-products/en/)。さらに、鶏の飼育や消費に関連する文化的または宗教的タブーはありません。この家禽腸内微生物叢は、動物の成長、飼料転換率、免疫、病原抵抗性、他の多くの栄養学的、生理学的または病理学的プロセスの中でも重要に関与している4。したがって、無菌ニワトリの生成は、微生物叢とその宿主との間の対話を強調するために不可欠である4。たとえ微生物群集が鶏卵管5に生息していたとしても、健康な鶏が産みたての卵の含有量は、微生物、卵殻、および微生物の侵入を避けるための機械的障壁を有する膜がほとんどない4。さらに、ひよこは親戚がいなくても簡単に飼育され、哺乳類とは異なり、無菌条件下で親が飼育することなく無菌動物を生産することができます。
実験施設「農場、モデル、野生動物の感染学」(PFIE、UE-1277、フランス、ヌージーリー、https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12)は、フランス国家インフラネットワークEMERG'IN(https://www.emergin.fr/)の一部です。PFIEは、40年以上にわたり様々な実験的研究を行うために無菌ニワトリの生産を習得してきました 7,8,9,10,11.これらの動物は、1970年代から閉鎖繁殖で飼育された白いレッグホーン産卵系統からの特定の病原体フリー(SPF)卵から産生された。主に微生物学的研究7,8,9に使用されている無菌鳥は、行動13に対する腸内微生物叢の寄与13、栄養利用14、免疫発達15および内分泌活性などの質問を伴う関心の復活を経験している。無菌ブロイラー系統16を用いていくつかの研究が発表されたとしても、これらの研究は実験層系統を用いた研究と比較して過小評価されたままである。微生物叢と家禽の健康と福祉における宿主との間のクロストークに向けた科学的疑問の進化は、世界で最も利用されているブロイラーチキンラインであるロスPM3ラインの無菌ブロイラーを生産するために私たちの歴史的なプロトコルを適応させることにつながりました。
Protocol
動物のケア手順は、欧州共同体理事会指令(86/609/EEC)およびフランスの動物実験に関する規制によって設定されたガイドラインに従って実施されました。
1. アイソレータの準備
- 50 mLチューブ、5、10、25 mLプラスチックピペット、照射フィード、オートクレーブ水、滅菌密閉プラスチック容器など、必要な材料を陽圧下で硬質アイソレーターに挿入します。
- 転写殺菌トラップを2%第4級アンモニウム溶液で満たす。
- 1立方メートルあたり30gの過マンガン酸カリウム(m3)に60mLのホルマリン(24%ホルムアルデヒド)を加えて、ホルムアルデヒド蒸気でアイソレータを3回滅菌する。各滅菌の間にアイソレータ内の材料を移動して、すべての接触面の滅菌を確保します。
- 卵を導入する前に、少なくとも2日間アイソレータ温度を37°Cに設定してください。導入当日は湿度計を相対湿度(RH)の65~70%に設定してください。
2. 採卵と孵化
- 産卵鶏の良好な孵化率(産卵のピーク時に少なくとも80%)およびそれらの良好な衛生状態(すなわち、一般的な家禽病原体の欠如および群れ内の病気の欠如)に基づいて選択された農場から卵を集める。視覚的にトレッドミルの清潔で完璧な卵を選択します。
- 卵の表面を室温の1.5%過酢酸溶液に5分間浸漬して直ちに除染する。
- ホルムアルデヒド蒸気で除染された箱を使用して卵を実験施設に輸送する。
- 卵を4°Cで24時間保存する。 ステップ2.2で説明した除染プロセスを繰り返し、孵化インキュベーター(Day 0)に19日間置きます。
3. ハッチング
- 19日目に、無菌条件下で軽い卵キャンドルを使用してそれらを傾けることによって、受精能、生存率(運動性)および胚発生を検証します。生きた胚芽卵のみを滅菌孵化分離器に導入する。
- 1.5%過酢酸溶液を30秒間または各卵の表面全体が覆われるまで噴霧することによって、選択された卵を除染する。卵は、アイソレータへの移送中に16分間および30秒間スプレーと接触し続ける。
- 卵を滅菌孵化アイソレーターに移し、孵化空間に置く前に滅菌脱塩水ですすいでください。
注:動物は孵化し、滅菌アイソレータで飼育されます。それらは、ガンマ線照射によって滅菌された市販の食事を 自由摂取 させ、ウォーターディスペンサーによって提供されるオートクレーブされた水道水で水をまかれる。
4. 細菌学的状態分析
- 孵化の1日後、異なるひよこの直腸から直接糞便サンプルを採取し、滅菌ガラス管にプールして、このサンプルを所定のアイソレータ内のすべての動物を代表するものにします。
- 多かれ少なかれ液体である糞便サンプルを、レサズリンを含むチオグリコール酸ブロス9mLに1mLの便に相当するものを加える。残りの糞便サンプルを9mLの脳心臓注入ブロス(BHI)に加え、チューブを18〜48時間振盪することなく37°Cでインキュベートする。これは、広範囲の好気性、通性好気性および非堅固な嫌気性種の成長を可能にする。
注:レサズリンを含むチオグリコール酸ブロスは、非堅固な嫌気性細菌の検出を目的としていますが、好気性細菌の検出も可能にします。この培地は、無菌試験のためのヨーロッパ、アメリカ、および日本の薬局方に準拠しています 18,19,20. - インキュベーションの18時間後に成長培地に何らかの修飾が生じるかどうかを目視で観察する。48時間後、BHI糞便 - ブロス媒体から一滴を採取し、スライドガラス上に置き、細菌の有無または存在について顕微鏡(倍率40倍)で観察する。
- 細菌の存在が疑われる場合は、BHI培養物からサンプルを採取し、BHI寒天プレートに播種します。37°Cで18〜48時間インキュベートする。
- コロニーが存在する場合は、正確な微生物同定のためにMALDI-TOF質量分析などのハイスループット技術を実行します。
注:72時間後、細菌学的分析が陰性である場合、動物は無菌であると宣言される。
Representative Results
無菌のひよこの世代の6回のランは、2つの異なるフランスの農場から来たRoss PM3卵で行われました(表1)。合計853個の卵が回収され、2回の除染ステップと19日間の孵化の後、86.40%が生存可能であった。これらの生存卵のうち490個が3回目の除染工程を受け、様々な孵化隔離器に導入され、平均孵化率は79.80%であった。これは、最初に採取された卵の数と比較して68.94%の孵化率を表す。
しかし、孵化の結果は、収集された卵の数と比較して、生存可能なひよこの41.67%から88.16%まで、実施されたシリーズによって大きく異なります。これらの変動は、同じ実験中に異なるハッチング間でも観察された。すべてのアイソレータがすべての実行に使用されているわけではないため、アイソレータに依存する効果を除外することは困難です。しかし、このバッチ効果は産卵鶏の年齢と直接相関しており(図1)、高齢の鶏から来る卵は生存率が低い。
6回のランは、4つの異なるハッチングアイソレータを使用して実施した。細菌学的対照後、16個のアイソレータのうち14匹の動物が無菌であることを確認した。これは87.5%の成功率に相当します。残りの2つのアイソレータは、単一の環境細菌および非病原性細菌によって汚染された。
科学実験に使用されたすべての動物は、孵化後少なくとも3週間、研究が終了するまで無菌のままであった。
図1:孵化率に及ぼす鶏の年齢の影響 現在の図は、産卵の鶏の群れの年齢に基づいて観察された孵化率を強調し、数週間の産卵で表した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 集めた卵 | D19生存卵 | D19 生存卵/採取卵 | アイソレータ1に移された卵 | アイソレータ2に移された卵 | アイソレータ3に移された卵 | アイソレータ4に移された卵 | 移された卵の合計 | アイソレータ1に孵化した生存可能なひよこ | アイソレータ2に孵化した生存可能なひよこ | アイソレータ3に孵化した生存可能なひよこ | アイソレータ4に孵化した生存可能なひよこ | 生存可能な孵化したひよこの合計 | 生存可能な孵化/移卵アイソレータ1 | 生存可能な孵化/移卵アイソレータ2 | 生存可能な孵化/移卵アイソレータ3 | 生存可能な孵化/移卵アイソレータ4 | 生存可能な孵化/移卵グローバル | |
| 実行 1 | 101 | 93 | 92.08% | 23 | 24 | - | - | 47 | 22 | 23 | - | - | 45 | 95.65% | 95.83% | 95.74% | ||
| 実行 2 | 130 | 117 | 90.00% | 25 | 25 | 25 | 75 | 20 | 24 | 18 | - | 62 | 80.00% | 96.00% | 72.00% | 82.67% | ||
| 実行 3 | 132 | 97 | 73.48% | 26 | - | 26 | 45 | 97 | 14 | - | 13 | 28* | 27 | 53.85% | 50.00% | 62.22% | 56.70% | |
| 実行 4 | 130 | 116 | 89.23% | 36 | 35 | - | - | 71 | 33 | 34 | - | - | 67 | 91.67% | 97.14% | 94.37% | ||
| 実行 5 | 180 | 148 | 82.22% | 30 | 30 | 30 | 30 | 120 | 26* | 25 | 17 | 24 | 66 | 86.67% | 83.33% | 56.67% | 80.00% | 76.67% |
| 実行 6 | 180 | 166 | 92.22% | - | 40 | 40 | - | 80 | - | 35 | 35 | - | 70 | 86.67% | 87.50% | 87.50% | 87.50% | |
| トータル | 853 | 737 | 86.40% | 140 | 154 | 121 | 75 | 490 | 89 | 141 | 83 | 24 | 337 | 82.14% | 91.56% | 68.60% | 69.33% | 79.80% |
表1:異なるハッチング実験の技術的結果。 現在の表は、実施された6つの一連の無菌孵化の結果を強調している:収集された卵の数、19日での胚の生存率、および様々な分離器における生存可能な孵化雛。
Discussion
無菌ニワトリを生成するためのいくつかの方法は、以前に記載されている7、21、22。ここで紹介したような簡単な方法は、異なる消毒剤を使用して、卵表面およびアイソレータ内の細菌負荷を低減する。最も一般的に使用される消毒剤は、塩化水銀、第四級アンモニウム、ヨードホルム、次亜塩素酸ナトリウムおよび二酸化塩素溶液である。結果はしばしば満足のいくものです。しかし、これらの方法のアクセシビリティにもかかわらず、この方法を適用して動物を大規模に飼育できる構造はほとんどないため、無菌ニワトリの利用は比較的まれなアプローチであり、非常に具体的な科学的問題に対処するためにのみ使用されます。ここで説明する方法、材料および装置は、少なくとも3週間(それらが生産された科学的実験の期間)健康で無菌のままである無菌ブロイラーの非常に効率的な孵化率を可能にする。
結果は、商業養鶏場で収集された卵からの無菌のひよこの生産へのプロトコルの適応が成功したことを示しています。SPF産卵の経験は、孵化効率が主に産卵鶏の年齢と収集された卵の品質に依存することを明らかにしています。両方のパラメータは、農場が選択され、卵が収集されたときに考慮されました。同じ方法を使用して、無菌ブロイラーの平均孵化率は、動物の不妊症(87%対83%)に影響を与えることなく、私たちの施設でのSPF産卵鶏の最後の生産(79%対35%)で得られたものよりもはるかに優れています。これらの違いは、鳥類の遺伝的背景(ブロイラー対層)と、40年以上にわたって閉鎖飼育されているSPF動物の卵においてより壊れやすい可能性が高い卵殻の品質に関連している可能性がある。さらに、我々はまた、2時間以上の輸送(農場から実験施設まで)が孵化効率と品質に影響を及ぼさないことも示している。
アイソレータの孵化に使用される滅菌プロセスと卵除染のプロトコルは最適化されましたが、アイソレータの約10%は無菌ではありませんでした。汚染の原因を理解するためには、卵の導入前に孵化したアイソレータの日常的な無菌制御を行うことが非常に重要です。
鳥類の無菌状態については、糞便サンプルから好気性および非堅固な嫌気性細菌の増殖を可能にする方法を適用し、生きた生存可能な細菌を検出していることを確認しました。これらの方法は、無菌性試験のための国際薬局方に準拠しており、日常的に使用される迅速、容易、かつ低コストの技術を表しています。しかしながら、16S rRNA遺伝子シークエンシングなどの分子生物学技術は、細菌の生存率に関する情報を与えないものの、培養不能な細菌の存在の確認には適用することができる。実際、最近の研究では、母体の卵管微生物叢の一部の細菌が卵白を介して胚に転移し、後に胚腸内細菌集団の大部分を構成するように見えることが示唆された5。さらに、別の研究では、初期胚に収容された微生物植入者の一部は母体の雌鶏から受け継がれており、腸内微生物の豊富さと多様性は後に発生中の環境要因と宿主遺伝学の影響を受けることが示唆された23。しかし、これらの研究の結果はDNA配列解析に基づいており、これらの細菌の多くは卵白(抗菌分子を大量にロード)で死んでいるか複製できない可能性があります。トーマスと共同研究者16 は、BHIプレート上での糞便滴による培養可能な好気性および通性好気性細菌の評価を通じて無菌試験を実施し、無菌無菌制御のための標準的な細菌学的方法の効率を強調した。さらに、提案されたプロトコルでは、非堅固な嫌気性細菌の増殖を検出できるように、レサズリンを用いたチオグリコール酸ブロス中の増殖モニタリングを使用した。
すでに無菌ウズラやニワトリの生産に使用されているこのプロトコルは、ほとんどの営巣鳥からの無菌動物の生産に適応可能であり、これらの動物の生理機能への微生物叢の貢献の研究のための視点を提供します。家禽の腸内の宿主 - 微生物叢の相互相互作用を調査するためにこのモデルを使用することに加えて、それはまた、応用研究のために有用である可能性があります。例えば、動物の健康と堅牢性を改善するために、鶏腸共生微生物に由来するプロバイオティクスの安全性と有効性を評価するために使用することができる。
Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、受精卵の供給について、ブリーダーと社会Boyé accouvage(La Boissière en Gâtine、フランス)に感謝しています。この研究は、フランスのレジオン・センター・ヴァル・ド・ロワールが資金提供した研究コンソーシアムAPR-IA "INTEGRITY'(2017-2019)の後援の下で実施されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
| 50 mL tubes | Falcon | ||
| BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
| Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
| Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
| Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
| Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
| Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
| Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
| Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
| Pipette aid | Drummond | ||
| Plastic pipettes | |||
| Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
| Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
| Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
| Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |
References
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