Summary
여기서 우리는 상업용 육계 라인 인 Ross PM3의 알에서 세균이없는 병아리를 생성하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 다른 가금류 종으로부터 세균이없는 동물의 생성에 적합 할 수 있습니다.
Abstract
숙주 생리학 및 면역 능력에 대한 장내 미생물 기여에 대한 연구는 황금 표준으로 간주되는 세균이없는 동물 모델의 가용성에 의해 촉진됩니다. 둥지를 짓는 새는 무균 조건에서 친척을 키울 필요가 없기 때문에 세균이없는 동물의 생산을위한 이상적인 모델입니다. 세균이없는 닭은 주로 상업적 닭 라인을 대표하지 못하는 특정 병원균이없는 (SPF) 실험 라인에서 생성됩니다. 여기에 제안 된 방법은 가금류 산업에서 일반적으로 사용되는 빠르게 성장하는 육계 라인 Ross PM3에서 세균이없는 닭을 생산할 수있었습니다. 알은 육계 육종가 농장에 누워있는 후 신속하게 수집되었습니다. 그들은 수집에서 멸균 된 계란 부화 격리기에서 도입에 이르기까지 엄격한 오염 제거 과정을 거쳤습니다. 병아리는 부화되어 불임을 조절하는 데 필요한 기간 동안이 멸균 격리기에 보관되었습니다. 원래 실험적인 SPF 화이트 레그혼 라인을 위해 개발된 본 프로토콜은 로스 PM3 육계 라인뿐만 아니라 메추라기에도 적용되었습니다. 따라서 그것은 다른 가금류 종에 강력하고 쉽게 적응할 수있는 절차를 나타내며 경제적, 생물학적 또는 생태 학적 관련성이있는 새를 중첩시킵니다.
Introduction
장내 미생물이 동물 건강에 기여하는 것에 관한 과학적, 대중적 관심이 극적으로 증가했습니다. 동물의 장에서 다른 틈새 시장에 서식하는 박테리아, 바이러스, 곰팡이 및 고세균으로 구성된 미생물은 포유류 종뿐만 아니라 가금류와 같은 가축에도 영향을 미치는 염증성, 감염성 및 대사성 질환의 조절에 직접 또는 간접적으로 연루되어 있습니다1. 건강과 질병에 대한 장내 미생물의 기여도를 더 잘 연구하기 위해 여러 동물 모델이 개발되었습니다. 예를 들어, 무세균 및 영지생물학 동물은 감염 2,3의 생리학적 병리학에 관한 미생물 또는 공지된 미생물의 완전한 부재에 대한 연구를 각각 허용한다. 그러나 이러한 동물을 생성하고 유지하려면 전문 기술과 시설이 필요하며 동물을 유지하는 데 필요한 비용, 노동 및 기술은 많은 연구자에 대한 접근을 제한합니다. 실제로, 세균이 없는 동물은 박테리아 배양 방법, 현미경, 혈청학, 총체적 형태학 및 시퀀싱 기반 검출 기술의 조합을 사용하여 가능한 오염에 대해 정기적으로 모니터링해야 합니다. 비슷한 절차가 가축과 같은 다른 종에도 적용되며, 동물은 일반적으로 더 크고 번식 및 유지 보수를 위해 더 큰 시설이 필요하므로 미생물에 대한 연구가 어느 정도 방해받을 수 있습니다.
가금류, 특히 닭은 전 세계 가축 생산의 초석이며, 연간 400 억 마리의 새를 초과 할 수있는 무리 인구가 있습니다. 그것은 세계에서 동물성 단백질의 가장 중요한 원천입니다 (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). 또한, 닭의 사육이나 소비와 관련된 문화적 또는 종교적 금기는 없습니다. 가금류 장내 미생물은 동물의 성장, 사료 전환율, 면역, 병원균 내성, 다른 많은 영양, 생리 학적 또는 병리학 적 과정 중에서 중요하게 관여합니다4. 따라서 세균이없는 닭의 생성은 microbiota와 그 숙주4 사이의 대화를 강조하는 데 필수적입니다. 미생물 군집이 닭 난관5에 서식하더라도, 건강한 암탉이 갓 낳은 달걀의 함량은 대부분 미생물, 달걀 껍질 및 미생물 침입을 피하기 위해 기계적 장벽을 가진 막이없습니다 4. 또한, 병아리는 친척이없는 상태에서 쉽게 자랄 수 있으며, 포유류와 달리 무균 조건에서 육아없이 세균이없는 동물을 생산할 수 있습니다.
실험 시설 "농장, 모델 및 야생 동물의 감염학"(PFIE, UE-1277, 센터 INRAE Val de Loire, Nouzilly, France, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12)은 프랑스 국립 인프라 네트워크 EMERG'IN (https://www.emergin.fr/)의 일부입니다. PFIE는 40 년 이상동안 다양한 실험 연구를 수행하기 위해 무균 닭 생산을 마스터했습니다 7,8,9,10,11. 이 동물들은 1970 년대 이후 폐쇄 된 번식에서 자란 흰 다리 뿔 부설 라인에서 특정 병원균이없는 (SPF) 알에서 생산되었습니다. 주로 미생물학 연구 7,8,9에 사용되는 무균 조류는 행동 13, 영양 활용14, 면역 발달 15 및 내분비 활성에 대한 장내 미생물의 기여와 같은 질문으로 관심의 부활을 경험하고 있습니다. 일부 연구가 무균 육계 라인16을 사용하여 발표되었다고해도, 이러한 연구는 실험 층 라인을 사용한 연구에 비해 과소 대표됩니다. 미생물과 가금류 건강 및 복지 분야의 숙주 사이의 누화에 대한 과학적 질문의 진화로 인해 우리는 세계에서 가장 많이 사용되는 육계 닭 라인 인 Ross PM3 라인의 세균이없는 육계를 생산하기 위해 역사적인 프로토콜을 채택하게되었습니다.
Protocol
동물 보호 절차는 유럽 공동체 협의회 지침 (86/609/EEC)과 동물 실험에 관한 프랑스 규정에 의해 설정된 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 절연기 준비
- 50 mL 튜브, 5, 10 및 25 mL 플라스틱 피펫, 조사 된 사료, 오토클레이브 워터 및 멸균 밀봉 된 플라스틱 용기와 같은 양압 하에서 단단한 분리기에 필요한 재료를 삽입하십시오.
- 이송 살균 트랩을 2 % 4 차 암모늄 용액으로 채 웁니다.
- 분리기를 60 mL의 포르말린 (24 % 포름 알데히드)을 사용하여 입방 미터 (m3) 당 과망간산 칼륨 30 g을 첨가하여 포름 알데히드 증기로3 회 멸균하십시오. 모든 접촉 표면의 살균을 보장하기 위해 각 멸균 사이에 격리기 내부의 재료를 이동하십시오.
- 계란을 도입하기 전에 적어도 2 일 동안 격리기 온도를 37 °C로 설정하십시오. 도입 당일에 습도계를 상대 습도 (RH)의 65-70 %로 설정하십시오.
2. 계란 수집 및 부화
- 산란계의 좋은 부화 비율 (계란 생산의 절정에서 적어도 80 %)과 좋은 위생 상태 (즉, 일반적인 가금류 병원균의 부재 및 무리 내의 질병의 부재)를 기준으로 선택된 농장에서 알을 수집하십시오. 디딜 방아에서 깨끗하고 완벽한 계란을 시각적으로 선택하십시오.
- 달걀 표면을 실온에서 1.5% 과초산 용액에 5분 동안 침지하여 즉시 오염을 제거한다.
- 포름알데히드 증기로 오염된 상자를 사용하여 계란을 실험 시설로 운반하십시오.
- 계란을 4°C에서 24시간 동안 보관한다. 단계 2.2에 기술된 오염 제거 과정을 반복하고, 이를 19일 동안 부화 인큐베이터(Day 0)에 둔다.
3. 해칭
- 19 일째에, 불임, 생존 가능성 (운동성) 및 배아 발달을 무균 조건 하에서 가벼운 달걀 촛불을 사용하여 캔들링함으로써 검증하십시오. 살아있는 배아 된 난자 만 멸균 부화 격리기에 도입하십시오.
- 1.5 % 과초산 용액을 30 초 동안 분무하거나 각 난자의 전체 표면이 덮일 때까지 선택한 난자를 오염 제거하십시오. 계란은 격리기로 옮기는 동안 16 분 및 30 초 동안 스프레이와 접촉합니다.
- 알을 멸균 부화 격리기로 옮기고 부화 공간에 놓기 전에 멸균 탈염수로 헹구십시오.
참고 : 동물은 멸균 격리기에서 부화되고 사육됩니다. 그들은 감마 조사에 의해 멸균 된 상업적 식단으로 광고 리비툼 을 먹이고 물 디스펜서가 제공하는 오토클레이브 된 수돗물로 물을 공급받습니다.
4. 세균학적 상태 분석
- 부화 후 하루 후, 다른 병아리의 직장에서 직접 분변 샘플을 가져 와서 멸균 된 유리 튜브에 모으면이 샘플이 주어진 격리기 내의 모든 동물을 대표하도록하십시오.
- 분변 샘플은 다소 액체이고, 레사주린과 함께 티오글리콜레이트 브로스 9 mL에 대변 1 mL를 첨가한다. 나머지 분변 샘플을 9 mL의 뇌 심장 주입 브로스(BHI)에 첨가하고, 튜브를 18 내지 48시간 동안 진탕 없이 37°C에서 인큐베이션한다. 이것은 호기성, 교수성 호기성 및 비 까다로운 혐기성 종의 광범위한 성장을 허용 할 것입니다.
참고 : resazurin을 함유 한 티오 글리콜 레이트 국물은 비 까다로운 혐기성 박테리아의 검출을위한 것이지만 호기성 박테리아의 검출을 가능하게합니다. 이 배지는 불임 테스트18,19,20에 대한 유럽, 미국 및 일본 약전을 준수합니다. - 배양 18시간 후에 성장 배지에서 어떤 변형이 발생하는지 육안으로 관찰한다. 48 시간 후, BHI 분변 - 국물 배지에서 방울을 가져 와서 유리 슬라이드에 놓고 현미경 (40X 배율)으로 박테리아의 부재 또는 존재를 관찰하십시오.
- 박테리아의 존재에 의심이있는 경우, BHI 배양물에서 샘플을 채취하여 BHI 한천 플레이트에 시드하십시오. 37°C에서 18 내지 48시간 동안 인큐베이션한다.
- 콜로니가 존재하는 경우, 정확한 미생물 식별을 위해 MALDI-TOF 질량 분광법과 같은 고처리량 기술을 수행하십시오.
참고 : 72 시간 후, 세균 학적 분석이 음성이면 동물은 세균이없는 것으로 선언됩니다.
Representative Results
무균 병아리 세대의 여섯 번의 실행은 두 개의 다른 프랑스 농장에서 나온 Ross PM3 알로 수행되었습니다 (표 1). 총 853 개의 알을 수집했으며 두 번의 오염 제거 단계와 19 일간의 배양 후에 86.40 %가 생존 할 수있었습니다. 이 생존 가능한 알들 중 490 개는 세 번째 오염 제거 단계를 거쳤으며 다양한 부화 격리기에 도입되어 평균 부화율은 79.80 %입니다. 이것은 수집 된 알의 초기 수에 비해 68.94 %의 부화율을 나타냅니다.
그러나 부화 결과는 수행 된 시리즈에 따라 크게 다릅니다 : 수집 된 알의 수에 비해 생존 가능한 병아리의 41.67 %에서 88.16 %까지. 이러한 변이는 동일한 실험 동안 상이한 해치들 사이에서도 관찰되었다. 모든 아이솔레이터가 모든 런에 사용된 것은 아니기 때문에, 아이솔레이터 의존적 효과를 배제하는 것은 어렵다. 그러나이 배치 효과는 산란계의 나이와 직접적으로 관련이 있었으며 (그림 1), 오래된 암탉에서 오는 알은 덜 실용적이었습니다.
여섯 번의 달리기는 네 개의 서로 다른 부화 절연기를 사용하여 수행되었습니다. 세균학적 대조군 후, 16개의 격리기 중 14마리로부터의 동물은 세균이 없는 것으로 확인되었다. 이는 87.5%의 성공률에 해당합니다. 나머지 두 개의 격리기는 단일 환경 및 비병원성 박테리아에 의해 오염되었다.
과학 실험에 사용 된 모든 동물은 부화 후 적어도 삼 주 동안 연구가 끝날 때까지 세균이없는 상태로 남아있었습니다.
그림 1: 암탉의 나이가 부화율에 미치는 영향 본 그림은 누워있는 암탉 무리의 나이에 따라 관찰 된 부화 속도를 강조하며, 누워있는 몇 주 동안 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 수집 된 계란 | D19 생존 가능한 계란 | D19 생존 가능한 계란 / 수집 된 계란 | 격리기로 옮겨진 계란 1 | 격리기로 옮겨진 계란 2 | 격리기로 옮겨진 계란 3 | 격리기로 옮겨진 계란 4 | 옮겨진 계란의 합계 | 생존 가능한 병아리가 격리기로 부화했다 1 | 생존 가능한 병아리가 격리기로 부화했다 2 | 생존 가능한 병아리가 격리기로 부화했다 3 | 생존 가능한 병아리가 격리기로 부화했다 4 | 생존 가능한 부화 병아리의 총 | 생존 가능한 부화 / 이송 된 계란 격리 장치1 | 생존 가능한 부화 / 이송 된 계란 격리 장치2 | 실행 가능한 부화 / 이송 된 계란 절연 장치3 | 생존 가능한 부화 / 이송 된 계란 격리 장치4 | 생존 가능한 부화 / 전송 된 계란 글로벌 | |
| 실행 1 | 101 | 93 | 92.08% | 23 | 24 | - | - | 47 | 22 | 23 | - | - | 45 | 95.65% | 95.83% | 95.74% | ||
| 실행 2 | 130 | 117 | 90.00% | 25 | 25 | 25 | 75 | 20 | 24 | 18 | - | 62 | 80.00% | 96.00% | 72.00% | 82.67% | ||
| 실행 3 | 132 | 97 | 73.48% | 26 | - | 26 | 45 | 97 | 14 | - | 13 | 28* | 27 | 53.85% | 50.00% | 62.22% | 56.70% | |
| 실행 4 | 130 | 116 | 89.23% | 36 | 35 | - | - | 71 | 33 | 34 | - | - | 67 | 91.67% | 97.14% | 94.37% | ||
| 실행 5 | 180 | 148 | 82.22% | 30 | 30 | 30 | 30 | 120 | 26* | 25 | 17 | 24 | 66 | 86.67% | 83.33% | 56.67% | 80.00% | 76.67% |
| 실행 6 | 180 | 166 | 92.22% | - | 40 | 40 | - | 80 | - | 35 | 35 | - | 70 | 86.67% | 87.50% | 87.50% | 87.50% | |
| 합계 | 853 | 737 | 86.40% | 140 | 154 | 121 | 75 | 490 | 89 | 141 | 83 | 24 | 337 | 82.14% | 91.56% | 68.60% | 69.33% | 79.80% |
표 1: 상이한 해칭 실험의 기술적 결과. 본 표는 수행 된 6 가지 일련의 무균 부화의 결과를 강조합니다 : 수집 된 난자의 수, 19 일에 배아의 생존 가능성 및 다양한 격리기에서 생존 가능한 부화 병아리.
Discussion
무균 닭을 생성하는 몇 가지 방법이 이전에 기술되었다 7,21,22. 여기에 제시된 것과 같은 간단한 방법은 계란 표면과 격리기에서 박테리아 부하를 줄이기 위해 다른 소독제를 사용합니다. 가장 일반적으로 사용되는 소독제는 수은 클로라이드, 사차 암모늄, 요오도 폼, 차아 염소산 나트륨 및 이산화 염소 용액입니다. 결과는 종종 만족 스럽습니다. 그러나 이러한 방법의 접근성에도 불구하고이 방법을 적용하고 동물을 대규모로 키울 수있는 구조는 거의 없으므로 세균이없는 닭을 비교적 드문 접근법으로 만들고 매우 구체적인 과학적 질문을 해결하는 데에만 사용됩니다. 여기에 설명 된 방법, 재료 및 장비는 적어도 3 주 동안 건강하고 멸균 된 상태로 유지되는 세균이없는 육계의 매우 효율적인 부화 비율을 허용합니다 (생산 된 과학 실험 기간).
결과는 상업용 가금류 농장에서 수집 된 알에서 세균이없는 병아리 생산에 대한 프로토콜의 적응이 성공적이라는 것을 보여줍니다. SPF 계란 생산에 대한 경험에 따르면 부화 효율은 주로 산란계의 나이와 수집 된 알의 품질에 달려 있습니다. 두 매개 변수 모두 농장을 선택하고 계란을 수집 할 때 고려되었습니다. 동일한 방법을 사용하면 무균 육계의 평균 부화율은 동물 불임성에 영향을 미치지 않고 우리 시설에서 SPF 산란계의 마지막 생산 (79 % 대 35 %)에서 얻은 것보다 훨씬 낫습니다 (87 % 대 83 %). 이러한 차이는 조류의 유전 적 배경 (육계 대 층)뿐만 아니라 SPF 동물의 알에서 더 깨지기 쉬운 달걀 껍질의 품질과 관련 될 수 있으며 40 년 이상 폐쇄 된 번식으로 유지됩니다. 또한, 우리는 또한 2 시간 이상 (농장에서 실험 시설로) 운송이 부화 효율과 품질에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다.
부화 격리기에 사용되는 살균 공정과 계란 오염 제거 프로토콜이 최적화되었지만 격리기의 약 10 %는 세균이 없었습니다. 오염의 기원을 이해하기 위해서는 계란이 도입되기 전에 부화 된 격리기의 일상적인 멸균 제어를 수행하는 것이 매우 중요합니다.
새의 불임 상태에 관해서, 우리는 분변 샘플에서 호기성 및 비 까다로운 혐기성 박테리아의 성장을 허용하는 방법을 적용하여 우리가 살아 있고 실행 가능한 박테리아를 탐지하고 있음을 보장하려고 노력했습니다. 이러한 방법은 멸균 테스트를위한 국제 약전을 준수하며 일상적으로 사용되는 빠르고 쉽고 비용 절감 된 기술을 나타냅니다. 그러나, 16S rRNA 유전자 시퀀싱과 같은 분자 생물학 기술은 박테리아 생존력에 대한 정보를 제공하지는 않지만, 비배양성 박테리아의 존재의 확인을 위해 적용될 수 있다. 실제로, 최근의 연구에 따르면 모성 난관 미생물의 일부 박테리아는 난자를 통해 배아로 옮겨지는 것으로 보이며, 나중에 배아 내장 박테리아 집단의 대부분을 구성한다5. 또한, 또 다른 연구에 따르면 초기 배아에 보관 된 미생물 식민지 개척자의 일부는 모성 암탉으로부터 물려 받았으며 장내 미생물의 풍부함과 다양성은 나중에 개발23 동안 환경 요인과 숙주 유전학의 영향을 받았다. 그러나 이러한 연구의 결과는 DNA 서열 분석을 기반으로하며, 많은 수의 박테리아가 달걀 흰자에서 죽거나 복제 할 수 없습니다 (항균 분자가 크게 로딩 됨). Thomas와 공동 연구자(16 )는 BHI 플레이트에 분변 적하를 통해 재배 가능한 호기성 및 교수성 호기성 박테리아의 평가를 통해 멸균성 테스트를 수행하여, 무균 멸균 제어를 위한 표준 세균학적 방법의 효율성을 강조했다. 또한, 제안 된 프로토콜에서, 우리는 비 까다로운 혐기성 박테리아의 성장을 감지 할 수 있도록 resazurin과 함께 티오 글리콜 레이트 국물에서 성장 모니터링을 사용했습니다.
이미 무균 메추라기와 닭의 생산에 사용된이 프로토콜은 대부분의 둥지를 짓는 새에서 세균이없는 동물의 생산에 적응할 수 있으며 이러한 동물의 생리학에 대한 미생물 기여도 연구를위한 관점을 제공합니다. 가금류 장에서의 숙주 - 미생물 상호 작용을 조사하기 위해이 모델을 사용하는 것 외에도 응용 연구에 유용 할 수 있습니다. 예를 들어, 동물의 건강과 견고성을 향상시키기 위해 닭장 공생 미생물에서 유래 한 프로바이오틱스의 안전성과 효능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 수정 된 난자의 공급에 대한 브리더 스와 Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, France)에 감사드립니다. 이 연구는 연구 컨소시엄 APR-IA "INTEGRITY"(2017-2019)의 후원하에 수행되었으며, 프랑스 Région Centre Val de Loire가 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
| 50 mL tubes | Falcon | ||
| BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
| Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
| Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
| Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
| Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
| Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
| Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
| Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
| Pipette aid | Drummond | ||
| Plastic pipettes | |||
| Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
| Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
| Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
| Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |
References
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