Summary
Nous décrivons ici une méthode pour la génération de poussins exempts de germes à partir d’œufs d’une lignée de poulets de chair commerciale, le Ross PM3. Cette méthode peut être adaptée pour la génération d’animaux exempts de germes d’autres espèces de volailles.
Abstract
Les études de la contribution du microbiote intestinal à la physiologie et à l’immunocompétence de l’hôte sont facilitées par la disponibilité de modèles animaux exempts de germes, qui sont considérés comme l’étalon-or. Les oiseaux nicheurs sont des modèles idéaux pour la production d’animaux exempts de germes, car il n’est pas nécessaire d’élever leurs parents dans des conditions stériles. Les poulets exempts de germes sont principalement générés à partir de lignées expérimentales sans agents pathogènes spécifiques (FPS), qui sont peu représentatives des lignées de poulets commerciales. La méthode proposée ici a permis la production de poulets exempts de germes à partir de la lignée de poulets de chair à croissance rapide Ross PM3, couramment utilisée par l’industrie avicole. Les œufs ont été rapidement récoltés après la ponte dans une ferme d’élevage de poulets de chair. Ils ont subi un processus de décontamination strict de la collecte à l’introduction dans un isolateur stérile d’éclosion d’œufs. Les poussins ont été éclos et gardés dans ces isolateurs stériles pendant la période nécessaire pour contrôler leur stérilité. Développé à l’origine pour une ligne expérimentale de livournes blanches SPF, le présent protocole a été adapté non seulement à la lignée de poulets de chair Ross PM3, mais aussi aux cailles. Il s’agit donc d’une procédure robuste et facilement adaptable à d’autres espèces de volailles et d’oiseaux nicheurs présentant un intérêt économique, biologique ou écologique.
Introduction
Il y a eu une augmentation spectaculaire de l’intérêt scientifique et populaire concernant la contribution du microbiote intestinal à la santé animale. Le microbiote, composé de bactéries, de virus, de champignons et d’archées qui habitent différentes niches dans l’intestin de l’animal, est impliqué directement ou indirectement dans la régulation des maladies inflammatoires, infectieuses et métaboliques affectant non seulement les espèces de mammifères, mais aussi le bétail, comme la volaille1. Plusieurs modèles animaux ont été développés pour mieux étudier la contribution du microbiote intestinal à la santé et à la maladie. Par exemple, les animaux exempts de germes et gnotobiotiques permettent l’étude de l’absence totale de microbes ou d’un microbiote connu, respectivement, sur la physiopathologie des infections 2,3. Cependant, la production et l’entretien de ces animaux nécessitent des techniques et des installations spécialisées, et les coûts, la main-d’œuvre et les compétences nécessaires pour les entretenir limitent leur accès à de nombreux chercheurs. En effet, les animaux exempts de germes doivent être surveillés régulièrement pour détecter toute contamination possible à l’aide d’une combinaison de méthodes de culture de bactéries, de microscopie, de sérologie, de morphologie brute et de techniques de détection basées sur le séquençage. Des procédures similaires s’appliquent également à d’autres espèces, telles que le bétail, où les animaux sont généralement plus gros et nécessitent des installations plus grandes pour leur reproduction et leur entretien, ce qui peut entraver, dans une certaine mesure, la recherche sur le microbiote.
La volaille, plus précisément les poulets, est la pierre angulaire de la production animale dans le monde entier, avec un cheptel qui peut dépasser 40 milliards d’oiseaux par an. C’est la source de protéines animales la plus importante au monde (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). De plus, il n’y a pas de tabous culturels ou religieux associés à l’élevage ou à la consommation de poulets. Le microbiote intestinal de la volaille est impliqué de manière importante dans la croissance de l’animal, le taux de conversion alimentaire, l’immunité, la résistance aux agents pathogènes, parmi de nombreux autres processus nutritionnels, physiologiques ou pathologiques4. La génération de poulets exempts de germes est donc indispensable pour souligner le dialogue entre le microbiote et son hôte4. Même si les communautés microbiennes habitent l’oviductede poulet 5, le contenu d’un œuf fraîchement pondu par une poule en bonne santé est pour la plupart exempt de micro-organismes, la coquille d’œuf et les membranes possédant des barrières mécaniques pour éviter l’invasion de micro-organismes4. De plus, les poussins sont facilement élevés en l’absence de leurs parents, ce qui, contrairement aux mammifères, permet la production d’animaux exempts de germes sans élevage parental dans des conditions stériles.
L’installation expérimentale « Infectiologie des animaux d’élevage, modèles et sauvages » (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, France, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) fait partie du réseau national d’infrastructures emerg’in (https://www.emergin.fr/) Français. PFIE maîtrise la production de poulets sans germes pour effectuer diverses études expérimentales depuis plus de 40 ans 7,8,9,10,11. Ces animaux ont été produits à partir d’œufs spécifiques exempts d’agents pathogènes (FPS) provenant d’une lignée de ponte de livournes blanches élevée en élevage fermé depuis les années 1970. Principalement utilisés pour les études microbiologiques 7,8,9, les oiseaux exempts de germes connaissent un regain d’intérêt avec des questions telles que la contribution du microbiote intestinal au comportement13, l’utilisation des nutriments14, le développement immunitaire15 et l’activité endocrinienne. Même si certaines études ont été publiées sur des lignées de poulets de chair sans germes16, ces études restent sous-représentées par rapport aux études utilisant des lignées de couches expérimentales. L’évolution des questions scientifiques vers la diaphonie entre le microbiote et son hôte dans la santé et le bien-être des volailles nous a amenés à adapter notre protocole historique pour produire des poulets de chair sans germes de la lignée Ross PM3, la lignée de poulets de chair la plus utilisée au monde.
Protocol
Les procédures de soins aux animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices fixées par la directive du Conseil des Communautés européennes (86/609/CEE) et par les règlements Français sur l’expérimentation animale.
1. Préparation de l’isolateur
- Insérez les matériaux nécessaires dans un isolateur rigide sous pression positive: tubes de 50 mL, pipettes en plastique de 5, 10 et 25 mL, alimentation irradiée, eau autoclavée et récipients en plastique scellés stériles.
- Remplissez le piège germicide de transfert avec une solution d’ammonium quaternaire à 2%.
- Stériliser l’isolateur trois fois avec de la vapeur de formaldéhyde en utilisant 60 mL de formol (24% de formaldéhyde) ajouté à 30 g de permanganate de potassium par mètre cube (m3). Déplacez les matériaux à l’intérieur de l’isolateur entre chaque stérilisation pour assurer la stérilisation de toutes les surfaces de contact.
- Réglez la température de l’isolateur à 37 °C pendant au moins 2 jours avant d’introduire les œufs. Réglez l’hygromètre à 65-70% d’humidité relative (HR) le jour de l’introduction.
2. Collecte et incubation des ovules
- Prélever les œufs dans les fermes sélectionnées sur la base d’un bon taux d’éclosion des poules pondeuses (au moins 80 % au plus fort de la production d’œufs) et de leur bon état sanitaire (c.-à-d. absence d’agents pathogènes communs de la volaille et absence de maladies au sein du troupeau). Sélectionnez visuellement des œufs propres et impeccables sur le tapis roulant.
- Décontaminer immédiatement la surface de l’œuf en les trempant pendant 5 min dans une solution d’acide peracétique à 1,5% à température ambiante.
- Transporter les œufs à l’installation expérimentale à l’aide d’une boîte décontaminée avec de la vapeur de formaldéhyde.
- Conserver les œufs pendant 24 heures à 4 °C. Répétez le processus de décontamination décrit à l’étape 2.2 et placez-les dans un incubateur à couver (jour 0) pendant 19 jours.
3. Éclosion
- Le jour 19, vérifiez la fertilité, la viabilité (motilité) et le développement embryonnaire en les mettant en boîte à l’aide d’un chandelier à œufs léger dans des conditions stériles. N’introduisez que des œufs embryonnés vivants dans les isolateurs d’éclosion stériles.
- Décontaminer les œufs sélectionnés en pulvérisant une solution d’acide peracétique à 1,5 % pendant 30 s ou jusqu’à ce que toute la surface de chaque œuf soit recouverte. Les œufs resteront en contact avec le spray pendant 16 min et 30 s pendant le transfert dans des isolateurs.
- Transférer les œufs dans les isolateurs d’éclosion stériles et les rincer à l’eau déminéralisée stérile avant de les placer dans l’espace d’éclosion.
REMARQUE: Les animaux sont éclos et élevés dans des isolateurs stériles. Ils sont nourris ad libitum avec un régime commercial stérilisé par irradiation gamma et arrosés avec de l’eau du robinet autoclavée fournie par des distributeurs d’eau.
4. Analyse de l’état bactériologique
- Un jour après l’éclosion, prélever un échantillon fécal directement dans le rectum de différents poussins et les regrouper dans un tube de verre stérilisé afin de rendre cet échantillon représentatif de tous les animaux dans un isolateur donné.
- Les échantillons fécaux étant plus ou moins liquides, ajouter l’équivalent de 1 mL de selles à 9 mL de bouillon de thioglycolate avec de la résazurine. Ajouter l’échantillon fécal restant à 9 mL de bouillon de perfusion cardiaque cérébrale (BHI) et incuber les tubes à 37 °C sans agiter pendant 18 à 48 h. Cela permettra la croissance d’un large éventail d’espèces aérobies, aérobies facultatives et anaérobies non fastidieuses.
REMARQUE: Le bouillon de thioglycolate avec de la résazurine est destiné à la détection de bactéries anaérobies non fastidieuses, mais il permet également la détection de bactéries aérobies. Ce milieu est conforme aux pharmacopées européenne, américaine et japonaise pour les tests de stérilité 18,19,20. - Observez visuellement si une modification du milieu de croissance se produit après 18 heures d’incubation. Après 48 h, prenez une goutte du bouillon fécal BHI, placez-la sur une lame de verre et observez au microscope (grossissement 40X) l’absence ou la présence de bactéries.
- En cas de suspicion de présence de bactéries, prélevez un échantillon de la culture BHI et ensemencez-le sur des plaques de gélose BHI. Incuber à 37 °C pendant 18 à 48 h.
- Si des colonies sont présentes, effectuez des techniques à haut débit telles que la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour une identification microbienne précise.
NOTE: Après 72 h, si les analyses bactériologiques sont négatives, les animaux sont déclarés exempts de germes.
Representative Results
Six cycles de génération de poussins exempts de germes ont été effectués avec des œufs Ross PM3 provenant de deux fermes Français différentes (tableau 1). Au total, 853 œufs ont été prélevés et après deux étapes de décontamination et 19 jours d’incubation, 86,40 % étaient viables. 490 de ces œufs viables ont subi une troisième étape de décontamination et ont été introduits dans divers isolateurs d’éclosion, pour un taux d’éclosion moyen de 79,80 %. Cela représente un taux d’éclosion de 68,94 % par rapport au nombre initial d’œufs récoltés.
Cependant, les résultats d’éclosion varient considérablement selon les séries réalisées : de 41,67 % à 88,16 % des poussins viables par rapport au nombre d’œufs collectés. Ces variations ont également été observées entre les différentes trappes au cours d’une même expérience. Étant donné que tous les isolateurs n’ont pas été utilisés pour toutes les séries, il est difficile d’exclure un effet dépendant de l’isolateur. Cependant, cet effet de lot était directement corrélé à l’âge des poules pondeuses (figure 1), où les œufs provenant de poules plus âgées étaient moins viables.
Les six essais ont été effectués à l’aide de quatre isolateurs d’éclosion différents. Après contrôle bactériologique, il a été confirmé que les animaux de 14 des 16 isolateurs étaient exempts de germes. Cela correspond à un taux de réussite de 87,5%. Les deux isolateurs restants ont été contaminés par une seule bactérie environnementale et non pathogène.
Tous les animaux utilisés pour les expériences scientifiques sont restés exempts de germes jusqu’à la fin des études, pendant au moins trois semaines après l’éclosion.
Figure 1 : Effet de l’âge de la poule sur le taux d’éclosion La présente figure met en évidence les taux d’éclosion observés en fonction de l’âge du troupeau de poules pondeuses, exprimé en semaines de ponte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Œufs collectés | D19 œufs viables | D19 œufs viables/œufs collectés | Oeufs transférés dans l’isolateur 1 | Oeufs transférés dans un isolateur 2 | Oeufs transférés dans un isolateur 3 | Oeufs transférés dans un isolateur 4 | total des œufs transférés | poussins viables éclos dans l’isolateur 1 | poussins viables éclos dans l’isolateur 2 | poussins viables éclos dans l’isolateur 3 | poussins viables éclos dans l’isolateur 4 | total des poussins éclos viables | isolateur viable d’œufs éclos/transférés1 | isolateur viable d’œufs éclos/transférés2 | isolateur viable d’œufs éclos/transférés3 | isolateur viable d’œufs éclos/transférés4 | œufs éclos ou transférés viables à l’échelle mondiale | |
| Exécution 1 | 101 | 93 | 92.08% | 23 | 24 | - | - | 47 | 22 | 23 | - | - | 45 | 95.65% | 95.83% | 95.74% | ||
| Exécution 2 | 130 | 117 | 90.00% | 25 | 25 | 25 | 75 | 20 | 24 | 18 | - | 62 | 80.00% | 96.00% | 72.00% | 82.67% | ||
| Exécution 3 | 132 | 97 | 73.48% | 26 | - | 26 | 45 | 97 | 14 | - | 13 | 28* | 27 | 53.85% | 50.00% | 62.22% | 56.70% | |
| Exécuter 4 | 130 | 116 | 89.23% | 36 | 35 | - | - | 71 | 33 | 34 | - | - | 67 | 91.67% | 97.14% | 94.37% | ||
| Exécuter 5 | 180 | 148 | 82.22% | 30 | 30 | 30 | 30 | 120 | 26* | 25 | 17 | 24 | 66 | 86.67% | 83.33% | 56.67% | 80.00% | 76.67% |
| Exécuter 6 | 180 | 166 | 92.22% | - | 40 | 40 | - | 80 | - | 35 | 35 | - | 70 | 86.67% | 87.50% | 87.50% | 87.50% | |
| Total | 853 | 737 | 86.40% | 140 | 154 | 121 | 75 | 490 | 89 | 141 | 83 | 24 | 337 | 82.14% | 91.56% | 68.60% | 69.33% | 79.80% |
Tableau 1 : Résultats techniques des différentes expériences d’éclosion. Le présent tableau met en évidence les résultats des 6 séries d’éclosions sans germes réalisées : nombre d’œufs collectés, viabilité de l’embryon à 19 jours et poussins éclos viables dans les différents isolateurs.
Discussion
Plusieurs méthodes pour générer des poulets sans germes ont déjà été décrites 7,21,22. Des méthodes simples, telles que celle présentée ici, utilisent différents désinfectants pour réduire la charge bactérienne à la surface des œufs et dans les isolateurs. Les désinfectants les plus couramment utilisés sont le chlorure mercurique, l’ammonium quaternaire, l’iodoforme, l’hypochlorite de sodium et les solutions de dioxyde de chlore. Les résultats sont souvent satisfaisants. Cependant, malgré l’accessibilité de ces méthodes, peu de structures peuvent appliquer la méthode et élever les animaux à grande échelle, faisant ainsi de l’utilisation de poulets exempts de germes une approche relativement rare, utilisée uniquement pour répondre à des questions scientifiques très spécifiques. Les méthodes, matériaux et équipements décrits ici permettent une proportion d’éclosion très efficace de poulets de chair exempts de germes, qui restent en bonne santé et stériles pendant au moins 3 semaines (la durée des expériences scientifiques pour lesquelles ils ont été produits).
Les résultats montrent que l’adaptation du protocole à la production de poussins exempts de germes à partir d’œufs collectés dans des élevages avicoles commerciaux est couronnée de succès. L’expérience de la production d’œufs SPF révèle que l’efficacité de l’éclosion dépend principalement de l’âge des poules pondeuses et de la qualité des œufs collectés. Les deux paramètres ont été pris en considération lors du choix des fermes et de la collecte des œufs. En utilisant la même méthode, le taux moyen d’éclosion des poulets de chair exempts de germes est bien meilleur que celui obtenu lors de la dernière production de poules pondeuses SPF dans notre établissement (79% vs 35%), sans affecter la stérilité animale (87% vs 83%). Ces différences peuvent être associées au bagage génétique des oiseaux (poulets de chair versus pondeuses) ainsi qu’à la qualité de la coquille d’œuf, qui est susceptible d’être plus fragile dans les œufs des animaux SPF, gardés en élevage fermé pendant plus de 40 ans. De plus, nous montrons également que le transport de plus de 2 h (des fermes à l’installation expérimentale) n’affecte pas l’efficacité et la qualité de l’éclosion.
Bien que le processus de stérilisation utilisé pour les isolateurs d’éclosion et le protocole de décontamination des œufs aient été optimisés, environ 10% des isolateurs n’étaient pas exempts de germes. Afin de comprendre l’origine de la contamination, il est très important d’effectuer un contrôle de stérilité de routine des isolateurs éclos avant l’introduction des œufs.
En ce qui concerne l’état de stérilité des oiseaux, nous avons essayé d’appliquer des méthodes qui permettent la croissance de bactéries anaérobies aérobies et non fastidieuses à partir d’échantillons fécaux, assurant ainsi que nous détectons des bactéries vivantes et viables. Ces méthodes sont conformes aux pharmacopées internationales pour les tests de stérilité et représentent des techniques rapides, faciles et coûteuses à utiliser régulièrement. Cependant, des techniques de biologie moléculaire telles que le séquençage du gène de l’ARNr 16S, bien qu’elles ne donnent pas d’informations sur la viabilité des bactéries, peuvent être appliquées pour confirmer la présence de bactéries non cultivables. En effet, une étude récente a suggéré que certaines bactéries du microbiote de l’ovducte maternel semblent être transférées à l’embryon par le biais du blanc d’œuf, constituant plus tard la majeure partie de la population bactérienne de l’intestin embryonnaire5. De plus, une autre étude a suggéré qu’une partie des colonisateurs microbiens hébergés dans les embryons précoces étaient hérités de poules maternelles, et que l’abondance et la diversité microbiennes intestinales ont ensuite été influencées par des facteurs environnementaux et la génétique de l’hôte au cours du développement23. Cependant, les résultats de ces études sont basés sur l’analyse de la séquence d’ADN, où un grand nombre de ces bactéries pourraient être mortes ou non reproductibles dans le blanc d’œuf (fortement chargé de molécules antimicrobiennes). Thomas et ses collaborateurs16 ont effectué des tests de stérilité par l’évaluation de bactéries aérobies cultivables et aérobies facultatives par chute fécale sur des plaques de BHI, soulignant ainsi l’efficacité des méthodes bactériologiques standard pour le contrôle de la stérilité sans germes. De plus, dans le protocole proposé, nous avons utilisé la surveillance de la croissance dans le bouillon thioglycolate avec de la résazurine pour pouvoir détecter la croissance de bactéries anaérobies non fastidieuses.
Déjà utilisé pour la production de cailles et de poulets exempts de germes, le protocole est adaptable à la production d’animaux exempts de germes de la plupart des oiseaux nicheurs et offre des perspectives pour l’étude de la contribution du microbiote à la physiologie de ces animaux. Outre l’utilisation de ce modèle pour étudier les interactions mutuelles hôte-microbiote dans l’intestin de la volaille, il pourrait également être utile pour la recherche appliquée. Par exemple, il pourrait être utilisé pour évaluer l’innocuité et l’efficacité des probiotiques dérivés de micro-organismes commensaux de l’intestin du poulet afin d’améliorer la santé et la robustesse des animaux.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les éleveurs et la société Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, France) pour la fourniture d’œufs fécondés. Cette étude a été menée sous l’égide du consortium de recherche APR-IA « INTEGRITY » (2017-2019), financé par la Région Centre Val de Loire, France.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
| 50 mL tubes | Falcon | ||
| BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
| Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
| Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
| Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
| Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
| Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
| Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
| Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
| Pipette aid | Drummond | ||
| Plastic pipettes | |||
| Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
| Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
| Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
| Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |
References
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