Summary
Her beskriver vi en metode til generering af kimfrie kyllinger fra æg af en kommerciel slagtekyllingelinje, Ross PM3. Denne metode kan tilpasses til generering af kimfrie dyr fra andre fjerkræarter.
Abstract
Undersøgelser af tarmens mikrobiotabidrag til værtsfysiologien og immunkompetence lettes af tilgængeligheden af bakteriefrie dyremodeller, der betragtes som guldstandarden. Nestende fugle er ideelle modeller til produktion af kimfrie dyr, da der ikke er behov for at opdrage deres slægtninge under sterile forhold. Kimfrie kyllinger genereres hovedsageligt fra specifikke patogenfrie (SPF) eksperimentelle linjer, som er dårligt repræsentative for kommercielle kyllingelinjer. Den metode, der foreslås her, tillod produktion af kimfrie kyllinger fra den hurtigt voksende slagtekyllingelinje Ross PM3, der almindeligvis anvendes af fjerkræindustrien. Æg blev hurtigt indsamlet efter lægning på en slagtekylling opdrætter gård. De gennemgik en streng dekontamineringsproces fra samlingen til introduktionen i en steril ægklækningsisolator. Kyllingerne er blevet udklækket og opbevaret i disse sterile isolatorer i den periode, der er nødvendig for at kontrollere deres sterilitet. Oprindeligt udviklet til en eksperimentel SPF hvid leghorn linje, er den nuværende protokol blevet tilpasset ikke kun til Ross PM3 slagtekyllingelinjen, men også til vagtler. Det udgør derfor en robust og let tilpasningsdygtig procedure til andre fjerkræarter og ynglefugle af økonomisk, biologisk eller økologisk relevans.
Introduction
Der har været en dramatisk stigning i den videnskabelige og folkelige interesse for tarmmikrobiotas bidrag til dyresundheden. Mikrobiotaen, der består af bakterier, vira, svampe og arkæer, der befinder sig i forskellige nicher i dyrets tarm, er direkte eller indirekte impliceret i reguleringen af inflammatoriske, infektiøse og metaboliske sygdomme, der ikke kun påvirker pattedyrarter, men også husdyr, såsom fjerkræ1. Flere dyremodeller blev udviklet for bedre at studere tarmmikrobiotas bidrag til sundhed og sygdom. For eksempel tillader kimfrie og gnobiotiske dyr undersøgelsen af henholdsvis fuldstændig fravær af mikrober eller af en kendt mikrobiota på fysiopatologien af infektioner 2,3. Generering og vedligeholdelse af disse dyr kræver imidlertid specialiserede teknikker og faciliteter, og de omkostninger, arbejdskraft og færdigheder, der kræves for at opretholde dem, begrænser deres adgang til mange forskere. Faktisk skal bakteriefrie dyr overvåges regelmæssigt for mulig kontaminering ved hjælp af en kombination af bakteriedyrkningsmetoder, mikroskopi, serologi, grovmorfologi og sekventeringsbaserede detektionsteknikker. Lignende procedurer gælder også for andre arter, såsom husdyr, hvor dyrene generelt er større og kræver større faciliteter til deres avl og vedligeholdelse, hvilket til en vis grad kan hæmme forskningen i mikrobiota.
Fjerkræ, mere specifikt kyllinger, er hjørnestenen i husdyrproduktionen over hele verden med en flokpopulation, der kan overstige 40 milliarder fugle om året. Det er den vigtigste kilde til animalsk protein i verden (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Desuden er der ingen kulturelle eller religiøse tabuer forbundet med opdræt eller forbrug af kyllinger. Fjerkrætarmmikrobiotaen er vigtigt involveret i dyrets vækst, foderomdannelsesforhold, immunitet, patogenresistens, blandt mange andre ernæringsmæssige, fysiologiske eller patologiske processer4. Generationen af bakteriefrie kyllinger er derfor uundværlig for at understrege dialogen mellem mikrobiotaen og dens vært4. Selvom mikrobielle samfund befinder sig i kyllingens ovidukt5, er indholdet af et æg, der er frisklagt af en sund høne, for det meste fri for mikroorganismer, æggeskallen og membranerne, der besidder mekaniske barrierer for at undgå mikroorganismeinvasion4. Derudover opdrættes kyllinger let i mangel af deres slægtninge, som i modsætning til pattedyr tillader produktion af kimfrie dyr uden forældreopdræt under sterile forhold.
Forsøgsanlægget "Infectiology of Farm, Model and Wild Animals" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Frankrig, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) er en del af det franske nationale infrastrukturnetværk EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE har mestret produktionen af kimfrie kyllinger til at udføre forskellige eksperimentelle undersøgelser i mere end 40 år 7,8,9,10,11. Disse dyr blev produceret af specifikke patogenfrie (SPF) æg fra en hvid benhornslægningslinje opdrættet i lukket avl siden 1970'erne. Hovedsageligt brugt til mikrobiologiske undersøgelser 7,8,9 oplever kimfrie fugle en genopblussen af interesse med spørgsmål som tarmmikrobiotas bidrag til adfærd 13, næringsstofudnyttelse14, immunudvikling15 og endokrin aktivitet. Selv om nogle undersøgelser er blevet offentliggjort ved hjælp af kimfrie slagtekyllingelinjer16, forbliver disse undersøgelser underrepræsenteret sammenlignet med undersøgelser, der bruger eksperimentelle laglinjer. Udviklingen af videnskabelige spørgsmål i retning af krydstalen mellem mikrobiotaen og dens vært inden for fjerkræsundhed og -velfærd har fået os til at tilpasse vores historiske protokol til at producere bakteriefrie slagtekyllinger af Ross PM3-linjen, verdens mest anvendte slagtekyllingelinje.
Protocol
Dyreplejeprocedurerne blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne i De Europæiske Fællesskabers rådsdirektiv (86/609/EØF) og i de franske forordninger om dyreforsøg.
1. Isolatorpræparat
- Indsæt de nødvendige materialer i en stiv isolator under positivt tryk: 50 ml rør, 5, 10 og 25 ml plastpipetter, bestrålet foder, autoklaveret vand og sterile forseglede plastbeholdere.
- Fyld overførselsbakteriefælden med en 2% kvaternær ammoniumopløsning.
- Steriliser isolatoren tre gange med formaldehyddamp ved anvendelse af 60 ml formalin (24% formaldehyd) tilsat til 30 g kaliumpermanganat pr. Kubikmeter (m3). Flyt materialerne inde i isolatoren mellem hver sterilisering for at sikre sterilisering af alle kontaktflader.
- Isolatortemperaturen indstilles til 37 °C i mindst 2 dage, før æggene indføres. Indstil hygrometeret til 65-70% af den relative luftfugtighed (RH) på introduktionsdagen.
2. Ægopsamling og inkubation
- Saml æggene fra gårde, der er udvalgt på grundlag af en god rugefugl af æglæggende høner (mindst 80% på toppen af ægproduktionen) og deres gode hygiejnestatus (dvs. fravær af almindelige fjerkræpatogener og fravær af sygdomme i flokken). Vælg visuelt rene og fejlfri æg på løbebåndet.
- Dekontaminere straks ægoverfladen ved at dyppe dem i 5 minutter i en 1,5% pereddikesyreopløsning ved stuetemperatur.
- Transporter æggene til forsøgsanlægget ved hjælp af en kasse dekontamineret med formaldehyddamp.
- Opbevar æggene i 24 timer ved 4 °C. Gentag dekontamineringsprocessen beskrevet i trin 2.2, og læg dem i en rugeinkubator (dag 0) i 19 dage.
3. Udklækning
- På dag 19 skal du kontrollere frugtbarheden, levedygtigheden (bevægeligheden) og embryoudviklingen ved at candling dem ved hjælp af en lys æggelyse under sterile forhold. Indfør kun levende embryonerede æg i de sterile rugeisolatorer.
- Dekontaminere de udvalgte æg ved at sprøjte 1,5% pereddikesyreopløsning i 30 s eller indtil hele overfladen af hvert æg er dækket. Æg forbliver i kontakt med sprayen i 16 minutter og 30 s under overførslen til isolatorer.
- Overfør æggene til de sterile rugeisolatorer og skyl dem med sterilt demineraliseret vand, inden de placeres i rugerummet.
BEMÆRK: Dyrene udklækkes og opdrættes i sterile isolatorer. De fodres ad libitum med en kommerciel kost steriliseret ved gammabestråling og vandes med autoklaveret ledningsvand leveret af vanddispensere.
4. Analyse af bakteriologisk status
- En dag efter udklækningen skal du tage en fækal prøve direkte fra endetarmen hos forskellige kyllinger og samle dem i et steriliseret glasrør for at gøre denne prøve repræsentativ for alle dyr inden for en given isolator.
- Fækalprøverne er mere eller mindre flydende, tilsæt svarende til 1 ml afføring til 9 ml thioglycolate bouillon med resazurin. Tilsæt den resterende fækale prøve til 9 ml hjernehjerteinfusionsbouillon (BHI) og inkuber rørene ved 37 °C uden at ryste i 18 til 48 timer. Dette vil muliggøre vækst af en bred vifte af aerobe, fakultative aerobe og ikke-falske anaerobe arter.
BEMÆRK: Thioglycolate bouillon med resazurin er beregnet til påvisning af ikke-skadelige anaerobe bakterier, men det muliggør også påvisning af aerobe bakterier. Dette medium overholder de europæiske, amerikanske og japanske farmakopéer til sterilitetstest 18,19,20. - Overhold visuelt, om der sker ændringer i vækstmediet efter 18 timers inkubation. Efter 48 timer skal du tage en dråbe fra BHI fækal-bouillonmediet, placere det på et glasglas og observere under et mikroskop (40X forstørrelse) for fravær eller tilstedeværelse af bakterier.
- Hvis der er mistanke om tilstedeværelsen af bakterier, skal du tage en prøve fra BHI-kulturen og så den på BHI-agarplader. Inkuber ved 37 °C i 18 til 48 timer.
- Hvis der er kolonier til stede, skal du udføre teknikker med høj gennemstrømning såsom MALDI-TOF massespektrometri for præcis mikrobiel identifikation.
BEMÆRK: Hvis de bakteriologiske analyser er negative efter 72 timer, erklæres dyrene for bakteriefrie.
Representative Results
Seks kørsler af kimfri kyllingers generation blev udført med Ross PM3-æg, der kom fra to forskellige franske gårde (tabel 1). I alt 853 æg blev indsamlet, og efter to dekontamineringstrin og 19 dages inkubation var 86,40% levedygtige. 490 af disse levedygtige æg gennemgik et tredje dekontamineringstrin og blev indført i forskellige rugeisolatorer med en gennemsnitlig rugehastighed på 79,80%. Dette repræsenterer en rugehastighed på 68,94% sammenlignet med det oprindelige antal indsamlede æg.
Rugeresultaterne varierer dog betydeligt alt efter den udførte serie: fra 41,67% til 88,16% af levedygtige kyllinger sammenlignet med antallet af indsamlede æg. Disse variationer blev også observeret blandt de forskellige luger under det samme eksperiment. Da ikke alle isolatorer er blevet brugt til alle kørsler, er det svært at udelukke en isolatorafhængig effekt. Denne batcheffekt var imidlertid direkte korreleret med æglæggende høners alder (figur 1), hvor æg fra ældre høns var mindre levedygtige.
De seks kørsler blev udført ved hjælp af fire forskellige rugeisolatorer. Efter bakteriologisk kontrol blev dyrene fra 14 af de 16 isolatorer bekræftet at være bakteriefrie. Det svarer til en succesrate på 87,5%. De to resterende isolatorer var forurenet af en enkelt miljømæssig og ikke-patogen bakterie.
Alle dyr, der blev anvendt til de videnskabelige forsøg, forblev kimfrie indtil undersøgelsernes afslutning i mindst tre uger efter udklækningen.
Figur 1: Effekten af hønens alder på rugehastigheden Den nuværende figur fremhæver de rugehastigheder, der er observeret baseret på æglæggende hønefloks alder, udtrykt i uger med lægning. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Indsamlede æg | D19 levedygtige æg | D19 levedygtige æg/indsamlede æg | Æg overført til isolator 1 | Æg overført til isolator 2 | Æg overført til isolator 3 | Æg overført til isolator 4 | i alt overførte æg | levedygtige kyllinger udklækket i isolator 1 | levedygtige kyllinger udklækket i isolator 2 | levedygtige kyllinger udklækket i isolator 3 | levedygtige kyllinger udklækket i isolator 4 | i alt levedygtige udklækkede kyllinger | levedygtig klækket/overført ægisolator1 | levedygtig klækket/overført ægisolator2 | levedygtig klækket/overført æg isolator3 | levedygtig klækket/overført ægisolator4 | levedygtige udklækkede/overførte æg globalt | |
| Løb 1 | 101 | 93 | 92.08% | 23 | 24 | - | - | 47 | 22 | 23 | - | - | 45 | 95.65% | 95.83% | 95.74% | ||
| Løb 2 | 130 | 117 | 90.00% | 25 | 25 | 25 | 75 | 20 | 24 | 18 | - | 62 | 80.00% | 96.00% | 72.00% | 82.67% | ||
| Løb 3 | 132 | 97 | 73.48% | 26 | - | 26 | 45 | 97 | 14 | - | 13 | 28* | 27 | 53.85% | 50.00% | 62.22% | 56.70% | |
| Løb 4 | 130 | 116 | 89.23% | 36 | 35 | - | - | 71 | 33 | 34 | - | - | 67 | 91.67% | 97.14% | 94.37% | ||
| Løb 5 | 180 | 148 | 82.22% | 30 | 30 | 30 | 30 | 120 | 26* | 25 | 17 | 24 | 66 | 86.67% | 83.33% | 56.67% | 80.00% | 76.67% |
| Løb 6 | 180 | 166 | 92.22% | - | 40 | 40 | - | 80 | - | 35 | 35 | - | 70 | 86.67% | 87.50% | 87.50% | 87.50% | |
| Total | 853 | 737 | 86.40% | 140 | 154 | 121 | 75 | 490 | 89 | 141 | 83 | 24 | 337 | 82.14% | 91.56% | 68.60% | 69.33% | 79.80% |
Tabel 1: Tekniske resultater af de forskellige udklækningsforsøg. Denne tabel fremhæver resultaterne af de 6 serier af kimfri udklækning, der er udført: antal indsamlede æg, embryoets levedygtighed efter 19 dage og levedygtige klækkede kyllinger i de forskellige isolatorer.
Discussion
Flere metoder til at generere kimfrie kyllinger er tidligere beskrevet 7,21,22. Enkle metoder, som den, der præsenteres her, bruger forskellige desinfektionsmidler til at reducere bakteriebelastningen i ægoverfladen og i isolatorerne. De mest almindeligt anvendte desinfektionsmidler er mercuricchlorid, kvaternær ammonium, iodform, natriumhypochlorit og chlordioxidopløsninger. Resultaterne er ofte tilfredsstillende. På trods af tilgængeligheden af disse metoder kan få strukturer imidlertid anvende metoden og opdrætte dyrene i stor skala, hvilket gør brugen af bakteriefrie kyllinger til en relativt sjælden tilgang, der kun bruges til at behandle meget specifikke videnskabelige spørgsmål. De metoder, materialer og udstyr, der er beskrevet her, muliggør en yderst effektiv rugeandel af kimfrie slagtekyllinger, som forbliver sunde og sterile i mindst 3 uger (varigheden af de videnskabelige forsøg, som de blev produceret til).
Resultaterne viser, at tilpasningen af protokollen til produktion af kimfrie kyllinger fra æg indsamlet i kommercielle fjerkræbedrifter er vellykket. Erfaringerne med SPF-ægproduktion viser, at rugeeffektiviteten primært afhænger af æglæggende høners alder og af kvaliteten af de indsamlede æg. Begge parametre blev taget i betragtning, da gårde blev valgt og æg indsamlet. Ved hjælp af samme metode er den gennemsnitlige rugehastighed for kimfrie slagtekyllinger meget bedre end den, der blev opnået i den sidste produktion af SPF-æglæggende høner på vores anlæg (79% vs 35%), uden at det påvirker dyrets sterilitet (87% vs 83%). Disse forskelle kan være forbundet med fuglenes genetiske baggrund (slagtekyllinger versus lag) samt med æggeskallens kvalitet, som sandsynligvis vil være mere skrøbelig i æggene fra SPF-dyrene, der holdes i lukket avl i mere end 40 år. Desuden viser vi også, at transport af mere end 2 timer (fra gårdene til forsøgsanlægget) ikke påvirker rugeeffektiviteten og kvaliteten.
Selvom steriliseringsprocessen, der blev brugt til udklækning af isolatorer, og protokollen til ægdekontaminering blev optimeret, var omkring 10% af isolatorerne ikke bakteriefrie. For at forstå forureningens oprindelse er det meget vigtigt at udføre rutinemæssig sterilitetskontrol af de klækkede isolatorer inden ægindføring.
Med hensyn til fuglenes sterilitetsstatus forsøgte vi at anvende metoder, der tillader vækst af aerobe og ikke-falske anaerobe bakterier fra fækale prøver, hvilket sikrer, at vi opdager levende, levedygtige bakterier. Disse metoder er i overensstemmelse med internationale farmakopéer til sterilitetstest og repræsenterer hurtige, nemme og omkostningsreducerede teknikker, der skal anvendes rutinemæssigt. Molekylærbiologiske teknikker såsom 16S rRNA-gensekventering, selvom de ikke giver information om bakteriernes levedygtighed, kan imidlertid anvendes til bekræftelse af tilstedeværelsen af ikke-dyrkelige bakterier. Faktisk foreslog en nylig undersøgelse, at nogle bakterier i moderens oviduktmikrobiota ser ud til at blive overført til embryoet gennem æggehviden, hvilket senere udgør det meste af embryotetarmbakteriepopulationen5. Desuden foreslog en anden undersøgelse, at en del af de mikrobielle kolonisatorer, der var i tidlige embryoner, blev arvet fra moderhøns, og tarmens mikrobielle overflod og mangfoldighed blev senere påvirket af miljøfaktorer og værtsgenetik under udvikling23. Resultaterne af disse undersøgelser er imidlertid baseret på DNA-sekvensanalyse, hvor et stort antal af disse bakterier kunne være døde eller ikke replikerbare i æggehviden (stærkt fyldt med antimikrobielle molekyler). Thomas og samarbejdspartnere16 udførte sterilitetstest gennem vurdering af dyrkelige aerobe og fakultative aerobe bakterier gennem fækalt fald på BHI-plader, hvilket fremhævede effektiviteten af standardbakteriologiske metoder til bakteriefri sterilitetskontrol. Desuden anvendte vi i den foreslåede protokol vækstovervågning i thioglycolate bouillon med resazurin for at kunne påvise væksten af ikke-skadelige anaerobe bakterier.
Protokollen, der allerede anvendes til produktion af kimfrie vagtler og kyllinger, kan tilpasses produktionen af kimfrie dyr fra de fleste fuglefugle og giver perspektiver til undersøgelse af mikrobiotas bidrag til disse dyrs fysiologi. Udover brugen af denne model til at undersøge værtsmikrobiota gensidige interaktioner i fjerkrætarmen, kan det også være nyttigt til anvendt forskning. Det kan f.eks. bruges til at vurdere sikkerheden og effektiviteten af probiotika afledt af kyllingers tarmkommensale mikroorganismer for at forbedre dyrs sundhed og robusthed.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for opdrætterne og samfundet Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Frankrig) for levering af befrugtede æg. Denne undersøgelse blev udført i regi af forskningskonsortiet APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019), som blev finansieret af Région Centre Val de Loire, Frankrig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
| 50 mL tubes | Falcon | ||
| BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
| Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
| Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
| Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
| Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
| Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
| Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
| Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
| Pipette aid | Drummond | ||
| Plastic pipettes | |||
| Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
| Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
| Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
| Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |
References
- Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. Chicken microbiota: importance and detection echnology. Frontiers in Veterinary Science. 23, 5 (2018).
- Grover, M., Kashyap, P. C. Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology. Neurogastroenterology & Motility. 26 (6), 745-748 (2014).
- Umesaki, Y. Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system. Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).
- Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fernández, M. E. Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection? Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374 (2019).
- Lee, S., et al. Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota. International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838 (2019).
- Hincke, M. T., et al. Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation. Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).
- Le Bars, J. Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens. Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).
- Lafont, J. P., et al. Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens. Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).
- Brée, A., Dho, M., Lafont, J. P. Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors. Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).
- Dozois, C. M., et al. Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli. Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).
- Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization. Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).
- Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Brée, A., Schouler, C. Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain. PLoS One. 7 (4), 35475 (2012).
- Kraimi, N., et al. Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica). of Experimental Biology. 222, (2019).
- Stanley, D., et al. Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens. Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).
- Han, Z., et al. Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens. Infection and Immunity. 85 (11), 0038017 (2017).
- Thomas, M., et al. Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken. mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).
- Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks. British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).
- European Pharmacopoeia. European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , reference 01/2009:20601 (2009).
- Japanese Pharmacopoeia, Japanese Pharmacopoeia. Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , made official March 31, 2009, by the Ministry of Health, Labour and Welfare Ministerial Notification No. 190 (2009).
- United States Pharmacopeia (USP). United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), December 1, 2008, official on May 1, 2009 (2008).
- Harrison, G. F. Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods. Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).
- Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. A simple method for production and rearing of the germ-free chick. J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).
- Ding, J., et al. Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens. Frontiers in Microbiology. 8, 1967 (2017).
