Summary
Här beskriver vi en metod för generering av bakteriefria kycklingar från ägg av en kommersiell broilerlinje, Ross PM3. Denna metod kan anpassas för generering av bakteriefria djur från andra fjäderfäarter.
Abstract
Studier av tarmmikrobiotans bidrag till värdfysiologin och immunkompetensen underlättas av tillgången på bakteriefria djurmodeller, som anses vara guldstandarden. Häckande fåglar är idealiska modeller för produktion av bakteriefria djur eftersom det inte finns något behov av att höja sina släktingar under sterila förhållanden. Bakteriefria kycklingar genereras huvudsakligen från specifika patogenfria (SPF) experimentella linjer, som är dåligt representativa för kommersiella kycklinglinjer. Den metod som föreslås här möjliggjorde produktion av bakteriefria kycklingar från den snabbt växande broilerlinjen Ross PM3, som vanligtvis används av fjäderfäindustrin. Ägg samlades snabbt efter att ha lagts på en broileruppfödargård. De genomgick en strikt dekontamineringsprocess från samlingen till införandet i en steril äggkläckningsisolator. Kycklingarna har kläckts och förvarats i dessa sterila isolatorer under den period som är nödvändig för att kontrollera deras sterilitet. Ursprungligen utvecklad för en experimentell SPF vit benhornlinje, har det nuvarande protokollet anpassats inte bara till Ross PM3-broilerlinjen utan också till vaktlar. Det utgör därför ett robust och lätt anpassningsbart förfarande till andra fjäderfäarter och häckande fåglar av ekonomisk, biologisk eller ekologisk betydelse.
Introduction
Det har skett en dramatisk ökning av vetenskapligt och populärt intresse för tarmmikrobiotans bidrag till djurhälsan. Mikrobiotan, som består av bakterier, virus, svampar och arkéer som bor i olika nischer i djurets tarm, är direkt eller indirekt inblandad i regleringen av inflammatoriska, infektiösa och metaboliska sjukdomar som inte bara påverkar däggdjursarter utan även boskap, såsom fjäderfä1. Flera djurmodeller utvecklades för att bättre studera tarmmikrobiotans bidrag till hälsa och sjukdom. Till exempel tillåter bakteriefria och gnotobiotiska djur studier av fullständig frånvaro av mikrober eller av en känd mikrobiota respektive på fysiopatologin vid infektioner 2,3. Att generera och underhålla dessa djur kräver dock specialiserade tekniker och anläggningar, och de kostnader, arbetskraft och färdigheter som krävs för att underhålla dem begränsar deras tillgång till många forskare. Könsfria djur måste övervakas regelbundet för eventuell kontaminering med hjälp av en kombination av bakterieodlingsmetoder, mikroskopi, serologi, bruttomorfologi och sekvenseringsbaserade detektionstekniker. Liknande förfaranden gäller även för andra arter, t.ex. boskap, där djuren i allmänhet är större och kräver större anläggningar för avel och underhåll, vilket i viss utsträckning kan hämma forskningen om mikrobiotan.
Fjäderfä, närmare bestämt kycklingar, är hörnstenen i animalieproduktionen i hela världen, med en flockpopulation som kan överstiga 40 miljarder fåglar per år. Det är den viktigaste källan till animaliskt protein i världen (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Dessutom finns det inga kulturella eller religiösa tabun i samband med uppfödning eller konsumtion av kycklingar. Fjäderfä tarmmikrobiotan är viktigt involverad i djurets tillväxt, foderomvandlingsförhållande, immunitet, patogenresistens, bland många andra näringsmässiga, fysiologiska eller patologiska processer4. Genereringen av bakteriefria kycklingar är därför oumbärlig för att understryka dialogen mellan mikrobiotan och dess värd4. Även om mikrobiella samhällen bor i kycklingovidukten5, är innehållet i ett ägg som nyligen lagts av en frisk höna mestadels fri från mikroorganismer, äggskal och membran har mekaniska hinder för att undvika mikroorganisminvasion4. Dessutom höjs kycklingar lätt i frånvaro av sina släktingar, vilket, till skillnad från däggdjur, möjliggör produktion av bakteriefria djur utan föräldrauppfödning under sterila förhållanden.
Experimentanläggningen "Infectiology of Farm, Model and Wild Animals" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Frankrike, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) är en del av det franska nationella infrastrukturnätverket EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE har behärskat produktionen av bakteriefria kycklingar för att utföra olika experimentella studier i mer än 40 år 7,8,9,10,11. Dessa djur producerades från specifika patogenfria (SPF) ägg från en vit benhornsläggningslinje som fötts upp i sluten avel sedan 1970-talet. Används främst för mikrobiologiska studier 7,8,9, bakteriefria fåglar upplever en återuppkomst av intresse med frågor som tarmmikrobiotans bidrag till beteende13, näringsutnyttjande14, immunutveckling15 och endokrin aktivitet. Även om vissa studier har publicerats med bakteriefria broilerlinjer16, förblir dessa studier underrepresenterade jämfört med studier med experimentella skiktlinjer. Utvecklingen av vetenskapliga frågor mot överhörningen mellan mikrobiotan och dess värd inom fjäderfähälsa och välfärd har fått oss att anpassa vårt historiska protokoll för att producera bakteriefria slaktkycklingar av Ross PM3-linjen, världens mest använda slaktkycklinglinje.
Protocol
Djurvårdsprocedurer utfördes i enlighet med riktlinjerna i Europeiska gemenskapernas råds direktiv (86/609/EEG) och i de franska bestämmelserna om djurförsök.
1. Förberedelse av isolator
- Sätt in nödvändiga material i en styv isolator under positivt tryck: 50 ml rör, 5, 10 och 25 ml plastpipetter, bestrålad matning, autoklaverat vatten och sterila förseglade plastbehållare.
- Fyll överföringsgroicidala fällan med en 2% kvartär ammoniumlösning.
- Sterilisera isolatorn tre gånger med formaldehydånga genom att använda 60 ml formalin (24% formaldehyd) tillsatt till 30 g kaliumpermanganat per kubikmeter (m3). Flytta materialen inuti isolatorn mellan varje sterilisering för att säkerställa sterilisering av alla kontaktytor.
- Ställ in isolatortemperaturen på 37 °C i minst 2 dagar innan äggen förs in. Ställ in hygrometern på 65-70% relativ luftfuktighet (RH) på introduktionsdagen.
2. Ägguppsamling och inkubation
- Samla äggen från gårdar som valts på grundval av en god kläckningshastighet hos värphönsen (minst 80% vid toppen av äggproduktionen) och deras goda sanitära status (dvs frånvaro av vanliga fjäderfäpatogener och frånvaro av sjukdomar i flocken). Välj visuellt rena och felfria ägg på löpbandet.
- Dekontaminera omedelbart äggytan genom att doppa dem i 5 minuter i en 1,5% perättiksyralösning vid rumstemperatur.
- Transportera äggen till experimentanläggningen med en låda dekontaminerad med formaldehydånga.
- Förvara äggen i 24 timmar vid 4 °C. Upprepa dekontamineringsprocessen som beskrivs i steg 2.2 och placera dem i en kläckningsinkubator (dag 0) i 19 dagar.
3. Kläckning
- På dag 19, verifiera fertiliteten, livskraften (rörligheten) och embryoutvecklingen genom att krossa dem med en lätt äggljus under sterila förhållanden. För endast levande embryonerade ägg i de sterila kläckningsisolatorerna.
- Dekontaminera de valda äggen genom att spruta 1,5% perättiksyralösning i 30 s eller tills hela ytan av varje ägg är täckt. Ägg kommer att hålla kontakten med sprayen i 16 minuter och 30 s under överföringen till isolatorer.
- Överför äggen till de sterila kläckningsisolatorerna och skölj dem med sterilt demineraliserat vatten innan du placerar dem i kläckningsutrymmet.
OBS: Djur kläcks och föds upp i sterila isolatorer. De matas ad libitum med en kommersiell diet steriliserad genom gammabestrålning och vattnas med autoklaverat kranvatten som tillhandahålls av vattendispensrar.
4. Analys av bakteriologisk status
- En dag efter kläckning, ta ett fekalt prov direkt från ändtarmen hos olika kycklingar och slå dem i ett steriliserat glasrör för att göra detta prov representativt för alla djur inom en given isolator.
- Fekalproverna är mer eller mindre flytande, tillsätt motsvarande 1 ml avföring till 9 ml tioglykolatbuljong med resazurin. Tillsätt det återstående fekala provet till 9 ml infusionsbuljong för hjärnhjärtat (BHI) och inkubera rören vid 37 °C utan att skaka i 18 till 48 timmar. Detta kommer att möjliggöra tillväxt av ett brett spektrum av aeroba, fakultativa aeroba och icke-fastidiska anaeroba arter.
OBS: Tioglykolatbuljong med resazurin är avsedd för detektering av icke-frekventa anaeroba bakterier men det möjliggör också detektering av aeroba bakterier. Detta medium överensstämmer med de europeiska, amerikanska och japanska farmakopéerna för sterilitetstest 18,19,20. - Observera visuellt om någon modifiering i tillväxtmediet inträffar efter 18 timmars inkubation. Efter 48 h, ta en droppe från BHI fekal-buljongmedia, placera den på en glasskiva och observera under ett mikroskop (40X förstoring) för frånvaro eller närvaro av bakterier.
- Om det finns misstankar om förekomst av bakterier, ta ett prov från BHI-kulturen och frö det på BHI-agarplattor. Inkubera vid 37 °C i 18 till 48 timmar.
- Om kolonier är närvarande, utför tekniker med hög genomströmning såsom MALDI-TOF-masspektrometri för exakt mikrobiell identifiering.
ANMÄRKNING: Efter 72 timmar, om de bakteriologiska analyserna är negativa, förklaras djuren bakteriefria.
Representative Results
Sex körningar av bakteriefri kycklinggeneration genomfördes med Ross PM3-ägg från två olika franska gårdar (tabell 1). Totalt samlades 853 ägg in och efter två dekontamineringssteg och 19 dagars inkubation var 86,40% livskraftiga. 490 av dessa livskraftiga ägg genomgick ett tredje dekontamineringssteg och infördes i olika kläckningsisolatorer, för en genomsnittlig kläckningshastighet på 79,80%. Detta motsvarar en kläckningshastighet på 68,94% jämfört med det ursprungliga antalet insamlade ägg.
Kläckningsresultaten varierar emellertid väsentligt beroende på den utförda serien: från 41,67% till 88,16% av livskraftiga kycklingar jämfört med antalet insamlade ägg. Dessa variationer observerades också bland de olika luckorna under samma experiment. Eftersom inte alla isolatorer har använts för alla körningar är det svårt att utesluta en isolatorberoende effekt. Denna batcheffekt var dock direkt korrelerad med värphönsens ålder (figur 1), där ägg från äldre höns var mindre livskraftiga.
De sex körningarna utfördes med fyra olika kläckningsisolatorer. Efter bakteriologisk kontroll bekräftades djuren från 14 av de 16 isolatorerna vara bakteriefria. Detta motsvarar en framgångsgrad på 87,5%. De två återstående isolatorerna var förorenade av en enda miljö- och icke-patogena bakterier.
Alla djur som användes för de vetenskapliga försöken förblev bakteriefria fram till studiernas slut, i minst tre veckor efter kläckningen.
Figur 1: Effekten av hönans ålder på kläckningshastigheten Den nuvarande siffran belyser de kläckningsfrekvenser som observerats baserat på värphönshönsflockens ålder, uttryckt i veckor av värphöns. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Samlade ägg | D19 livskraftiga ägg | D19 livskraftiga ägg/insamlade ägg | Ägg som överförts till isolator 1 | Ägg som överförts till isolator 2 | Ägg som överförts till isolator 3 | Ägg som överförts till isolator 4 | totalt överförda ägg | livskraftiga kycklingar kläckta till isolator 1 | livskraftiga kycklingar kläckta till isolator 2 | livskraftiga kycklingar kläckta till isolator 3 | livskraftiga kycklingar kläckta till isolator 4 | Totalt antal livskraftiga kläckta kycklingar | livskraftiga kläckta/överförda ägg isolator1 | livskraftiga kläckta/överförda ägg isolator2 | livskraftiga kläckta/överförda ägg isolator3 | livskraftiga kläckta/överförda ägg isolator4 | livskraftiga kläckta/överförda ägg globalt | |
| Kör 1 | 101 | 93 | 92.08% | 23 | 24 | - | - | 47 | 22 | 23 | - | - | 45 | 95.65% | 95.83% | 95.74% | ||
| Kör 2 | 130 | 117 | 90.00% | 25 | 25 | 25 | 75 | 20 | 24 | 18 | - | 62 | 80.00% | 96.00% | 72.00% | 82.67% | ||
| Kör 3 | 132 | 97 | 73.48% | 26 | - | 26 | 45 | 97 | 14 | - | 13 | 28* | 27 | 53.85% | 50.00% | 62.22% | 56.70% | |
| Kör 4 | 130 | 116 | 89.23% | 36 | 35 | - | - | 71 | 33 | 34 | - | - | 67 | 91.67% | 97.14% | 94.37% | ||
| Kör 5 | 180 | 148 | 82.22% | 30 | 30 | 30 | 30 | 120 | 26* | 25 | 17 | 24 | 66 | 86.67% | 83.33% | 56.67% | 80.00% | 76.67% |
| Kör 6 | 180 | 166 | 92.22% | - | 40 | 40 | - | 80 | - | 35 | 35 | - | 70 | 86.67% | 87.50% | 87.50% | 87.50% | |
| Total | 853 | 737 | 86.40% | 140 | 154 | 121 | 75 | 490 | 89 | 141 | 83 | 24 | 337 | 82.14% | 91.56% | 68.60% | 69.33% | 79.80% |
Tabell 1: Tekniska resultat av de olika kläckningsförsöken. Denna tabell belyser resultaten av de 6 serier av bakteriefri kläckning som utförts: antal insamlade ägg, embryonets livskraft vid 19 dagar och livskraftiga kläckta kycklingar i de olika isolatorerna.
Discussion
Flera metoder för att generera bakteriefria kycklingar har tidigare beskrivits 7,21,22. Enkla metoder, som den som presenteras här, använder olika desinfektionsmedel för att minska bakteriebelastningen i äggytan och i isolatorerna. De vanligaste desinfektionsmedlen är kvicksilverklorid, kvartär ammonium, jodform, natriumhypoklorit och klordioxidlösningar. Resultaten är ofta tillfredsställande. Trots tillgängligheten av dessa metoder kan få strukturer tillämpa metoden och höja djuren i stor skala, vilket gör användningen av bakteriefria kycklingar till ett relativt sällsynt tillvägagångssätt, som bara används för att ta itu med mycket specifika vetenskapliga frågor. De metoder, material och utrustning som beskrivs här möjliggör en mycket effektiv kläckningsandel av bakteriefria slaktkycklingar, som förblir friska och sterila i minst 3 veckor (varaktigheten av de vetenskapliga experiment som de producerades till).
Resultaten visar att anpassningen av protokollet till produktionen av bakteriefria kycklingar från ägg som samlas in i kommersiella fjäderfäplantor är framgångsrik. Erfarenhet av SPF-äggproduktion visar att kläckningseffektiviteten främst beror på värphönsens ålder och på kvaliteten på insamlade ägg. Båda parametrarna beaktades när gårdar valdes och ägg samlades in. Med samma metod är den genomsnittliga kläckningshastigheten för bakteriefria slaktkycklingar mycket bättre än den som erhölls vid den senaste produktionen av SPF-värphöns på vår anläggning (79% mot 35%), utan att påverka djursteriliteten (87% mot 83%). Dessa skillnader kan vara förknippade med fåglarnas genetiska bakgrund (slaktkycklingar kontra lager) samt med äggskalets kvalitet, som sannolikt är mer ömtåligt i äggen från SPF-djuren, som hålls i sluten avel i mer än 40 år. Dessutom visar vi också att transport på mer än 2 h (från gårdarna till experimentanläggningen) inte påverkar kläckningseffektivitet och kvalitet.
Även om steriliseringsprocessen som användes för kläckningsisolatorer och protokollet för äggsanering optimerades, var cirka 10% av isolatorerna inte bakteriefria. För att förstå föroreningens ursprung är det mycket viktigt att utföra rutinmässig sterilitetskontroll av de kläckta isolatorerna före äggintroduktion.
När det gäller fåglarnas sterilitetsstatus försökte vi tillämpa metoder som möjliggör tillväxt av aeroba och icke-frekventa anaeroba bakterier från fekala prover, vilket säkerställer att vi upptäcker levande, livskraftiga bakterier. Dessa metoder överensstämmer med internationella farmakopéer för sterilitetstestning och representerar snabba, enkla och kostnadsreducerade tekniker som ska användas rutinmässigt. Molekylärbiologiska tekniker såsom 16S rRNA-gensekvensering, även om de inte ger information om bakteriernas livskraft, kan emellertid tillämpas för bekräftelse av närvaron av icke-odlingsbara bakterier. Faktum är att en ny studie föreslog att vissa bakterier av moderns oviduktmikrobiota verkar överföras till embryot genom äggvitan, vilket senare utgör större delen av embryot tarmbakteriepopulationen5. Dessutom föreslog en annan studie att en del av de mikrobiella kolonisatörerna som fanns i tidiga embryon ärvdes från moderhöns, och tarmens mikrobiella överflöd och mångfald påverkades senare av miljöfaktorer och värdgenetik under utveckling23. Resultaten av dessa studier är dock baserade på DNA-sekvensanalys, där ett stort antal av dessa bakterier kan vara döda eller inte replikerbara i äggvitan (kraftigt laddade med antimikrobiella molekyler). Thomas och medarbetare16 utförde sterilitetstester genom bedömning av odlingsbara aeroba och fakultativa aeroba bakterier genom fekal droppe på BHI-plattor, vilket belyser effektiviteten hos standardbakteriologiska metoder för bakteriefri sterilitetskontroll. Dessutom använde vi i det föreslagna protokollet tillväxtövervakning i tioglykolatbuljong med resazurin för att kunna detektera tillväxten av icke-frekventa anaeroba bakterier.
Protokollet används redan för produktion av bakteriefria vaktlar och kycklingar och är anpassningsbart till produktionen av bakteriefria djur från de flesta häckande fåglar och erbjuder perspektiv för studier av mikrobiotabidrag till dessa djurs fysiologi. Förutom användningen av denna modell för att undersöka värd-mikrobiota ömsesidiga interaktioner i fjäderfä tarm, kan det också vara användbart för tillämpad forskning. Till exempel, Det kan användas för att bedöma säkerhet och effekt av probiotika härrörande från kyckling gut commensal mikroorganismer för att förbättra djurens hälsa och robusthet.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma mot uppfödarna och sällskapet Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Frankrike) för tillgången på befruktade ägg. Denna studie genomfördes i regi av forskningskonsortiet APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019), som finansierades av Région Centre Val de Loire, Frankrike.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
| 50 mL tubes | Falcon | ||
| BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
| Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
| Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
| Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
| Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
| Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
| Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
| Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
| Pipette aid | Drummond | ||
| Plastic pipettes | |||
| Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
| Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
| Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
| Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |
References
- Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. Chicken microbiota: importance and detection echnology. Frontiers in Veterinary Science. 23, 5 (2018).
- Grover, M., Kashyap, P. C. Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology. Neurogastroenterology & Motility. 26 (6), 745-748 (2014).
- Umesaki, Y. Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system. Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).
- Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fernández, M. E. Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection? Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374 (2019).
- Lee, S., et al. Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota. International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838 (2019).
- Hincke, M. T., et al. Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation. Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).
- Le Bars, J. Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens. Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).
- Lafont, J. P., et al. Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens. Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).
- Brée, A., Dho, M., Lafont, J. P. Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors. Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).
- Dozois, C. M., et al. Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli. Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).
- Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization. Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).
- Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Brée, A., Schouler, C. Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain. PLoS One. 7 (4), 35475 (2012).
- Kraimi, N., et al. Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica). of Experimental Biology. 222, (2019).
- Stanley, D., et al. Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens. Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).
- Han, Z., et al. Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens. Infection and Immunity. 85 (11), 0038017 (2017).
- Thomas, M., et al. Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken. mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).
- Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks. British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).
- European Pharmacopoeia. European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , reference 01/2009:20601 (2009).
- Japanese Pharmacopoeia, Japanese Pharmacopoeia. Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , made official March 31, 2009, by the Ministry of Health, Labour and Welfare Ministerial Notification No. 190 (2009).
- United States Pharmacopeia (USP). United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), December 1, 2008, official on May 1, 2009 (2008).
- Harrison, G. F. Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods. Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).
- Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. A simple method for production and rearing of the germ-free chick. J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).
- Ding, J., et al. Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens. Frontiers in Microbiology. 8, 1967 (2017).
