Un modello murino indotto da doxorubicina di cardiomiopatia dilatativa in vivo

Summary

È descritto un protocollo per stabilire un modello di cardiomiopatia dilatativa indotta da doxorubicina (DCM) nei topi tramite iniezione intraperitoneale a lungo termine di doxorubicina.

Abstract

La cardiomiopatia dilatativa (DCM) si riferisce a uno spettro di disturbi miocardici eterogenei caratterizzati da dilatazione ventricolare e prestazioni cardiache depresse in assenza di ipertensione, cardiopatie valvolari, congenite o ischemiche e che possono essere correlati a infezioni, anomalie autoimmuni o metaboliche o ereditarietà familiare. Può progredire in insufficienza cardiaca congestizia con una prognosi sfavorevole. La doxorubicina (Dox) è ampiamente impiegata come farmaco chemioterapico, ma il suo uso è limitato perché provoca cambiamenti simili a DCM del miocardio. La sua tossicità miocardica è attribuita allo stress ossidativo, all'infiammazione cronica e all'apoptosi cardiomiocitaria. Non è stato stabilito un modello di DCM che sfrutti questi sintomi di DCM indotti da Dox.

Introduction

Una delle cause più comuni di insufficienza cardiaca, DCM è caratterizzata da dilatazione ventricolare e diminuzione della funzione cardiaca ed è la ragione più comune per il trapianto di cuore in tutto il mondo¹. Al fine di indagare ulteriormente la sua patogenesi e trovare trattamenti efficaci, l'accesso a modelli animali maturi è particolarmente importante. Lo scopo degli esperimenti descritti è quello di stabilire un modello murino stabile di DCM che assomigli al DCM umano.

A causa della complessa patogenesi del DCM, ci sono molti metodi diversi per realizzare modelli animali corrispondenti. I modelli DCM^{spontanei 2} sono relativamente stabili, ma sono costosi e non facilmente disponibili. I modelli animali geneticamente modificati³ non sono ben consolidati e richiedono un uso più sperimentale. I modelli animali DCM indotti da infezione virale⁴ o difetti autoimmuni⁵ sono facili da ottenere, ma non sono del tutto rappresentativi del DCM. I modelli associati alla tossicità miocardica includono modelli DCM indotti da alcol e modelli animali DCM indotti da Dox.

Il modello di cardiomiopatia indotta da Dox è ottenuto mediante iniezione intraperitoneale di Dox⁶. Il modello sfrutta l'effetto collaterale cronico più grave di Dox: dopo l'esposizione a Dox, i pazienti sviluppano sintomi di DCM ad esordio tardivo con uniformità clinica^7. Lo stress ossidativo indotto da Dox⁸ e il danno mitocondriale⁹, che portano all'apoptosi cardiomiocitaria, sono sintomi nella patogenesi del DCM. Esistono modelli di trattamento Dox acuti e cronici: una singola dose elevata di Dox (15 mg/kg) induce un modello a breve termine per la cardiomiopatia^10,mentre iniezioni ripetitive di Dox a basso dosaggio (sei settimanali, 3 mg/kg) inducono un modello a lungo termine per la cardiomiopatia^11. Sulla base dello studio presentato, i topi wild type iniettati per via intraperitoneale una volta alla settimana per un mese alla dose di 5 mg/kg mostrano morfologia e istologia del cuore coerenti con le caratteristiche del DCM entro la fine del trattamento, fornendo un modo ideale per stabilire un modello DCM.

Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Nanjing Drum Tower Hospital.

1. Preparazione dei reagenti e degli animali

1. Sciogliere la doxorubicina cloridrato (Pfizer, USA) in acqua sterilizzata. Vortice per ottenere una soluzione di Dox di 1 mg/mL e mantenere a 4 °C.
2. Utilizzare topi C57BL/6 (8-10 settimane di età; 25-30 g di peso). Per questo studio, i topi sono stati acquistati dal Model Animal Research Center dell'Università di Nanchino e tenuti nella stanza degli animali del Nanjing Drum Tower Hospital.
3. Le gabbie per topi prive di agenti patogeni sono state mantenute sotto un ciclo luce/buio di 12 ore a una temperatura costante di 23 °C. Tutti gli animali sono stati nutriti con una normale dieta chow e hanno ricevuto cibo e acqua ad libitum.

2. Istituzione del modello animale DCM

1. Randomizzare i topi in un gruppo normale (n = 5) e dox (n = 5).
2. Somministrare la soluzione di Dox per via intraperitoneale alla dose di 5 mg/kg utilizzando una siringa sterilizzata da 1 mL 1 volta a settimana per il gruppo Dox. Trattare i topi di controllo allo stesso modo con la stessa quantità di soluzione salina.
3. Misurare il peso corporeo dei due gruppi settimanalmente. Di conseguenza, aggiustare la dose di iniezione in base al peso corporeo settimanalmente per un totale di 4 settimane, con una dose cumulativa di 20 mg/kg (Figura 1).
   NOTA: È stato scelto un periodo di tempo di 4 settimane perché l'ecocardiografia a 4 settimane ha mostrato una differenza significativa nella funzione cardiaca tra i due gruppi.

3. Esame ecocardiografico

1. Alla fine della quarta settimana, condurre un esame ecocardiografico dei topi.
2. Anestetizzare i topi con il 2% di isoflurano per via intranasale. Se i topi non rispondono a un pizzico di pelle con una pinzetta dentata o stimolando le dita dei piedi e la coda, continuare con il protocollo.
3. Posizionare il mouse su una piattaforma di manipolazione degli animali in posizione supina. Per mantenere l'anestesia, coprire il naso e la bocca dell'animale con un cono nasale e fornire il 2% di isoflurano.
   NOTA: Per l'anestesia IP, iniettare il 4% di idrato di cloralio alla dose di 0,2 ml/20 g.
4. Rimuovere accuratamente la pelliccia del torace con un rasoio elettrico. Valutare la funzione cardiaca in vivo utilizzando l'ecocardiografia transtoracica.
5. Eseguire l'ecocardiogramma LV sia nell'asse lungo parasternale che nell'asse corto ad un frame rate di 233 Hz. Le dimensioni sistolica e diastolica finale sono state definite come le fasi corrispondenti rispettivamente all'onda T ECG e all'onda R.
6. Sui tracciati in modalità M, misurare il diametro medio sistolico finale LV (LVIDd), il diametro diastolico terminale LV (LVID), lo spessore del setto interventricolare (IVS) e lo spessore della parete posteriore LV (LVPW) da 3-5 battiti cardiaci. Calcola anche la frazione di eiezione (EF) e l'accorciamento della frazione (FS) in base all'ecocardiografia.

4. Colorazione istologica

1. Dopo l'analisi ecocardiografica, sacrificare i topi con l'iniezione intraventricolare di cloruro di potassio al 10%.
2. Perfondere il cuore con circa 30 ml di soluzione salina dopo la dissezione fino a quando il fegato e il polmone diventano pallidi.
3. Asportare il cuore e lavarlo accuratamente in soluzione tampone fosfato per estrudere il sangue.
4. Fissare il cuore in formalina al 4% a temperatura ambiente per 24 ore e trattare il tessuto in una scatola di paraffina in modo che la cera di paraffina si raffreddi e si solidifichi.
5. Tagliare i cuori in fette spesse 5 μm per la colorazione patologica.
6. Decerazione e sezioni reidratate contenenti muscolo papillare.
   1. Incubare i vetrini a 55 °C per 30 min. Quindi, incubare in xilene 2 volte per 2 minuti ciascuno; 100% etanolo 2x per 2 minuti ciascuno; 95% di etanolo 2x per 2 minuti ciascuno; 80% di etanolo per 2 min; 75% di etanolo per 2 min; e 50% di etanolo per 2 min.
7. Macchiare con ematossilina ed eosina (H & E) e la macchia di Masson.

Representative Results

Funzione cardiaca
La cardiomiopatia dilatativa è caratterizzata da progressiva dilatazione ventricolare e disfunzione contrattile. La Figura 2 mostra immagini ecocardiografiche rappresentative dei due gruppi. I topi trattati con Dox hanno mostrato una frazione di eiezione ventricolare sinistra marcatamente ridotta e un accorciamento frazionario ventricolare sinistro (Figura 3A,B). Il diametro LV è aumentato anche nella fase diastolica e sistolica (Figura 3C,D). Ciò ha rivelato che i topi trattati con Dox avevano una funzione cardiaca compromessa.

Colorazione istologica
La colorazione patologica è stata eseguita per osservare i cambiamenti patologici dei topi trattati con soluzione salina e dei topi trattati con Dox. Le fibre miocardiche dei topi nel gruppo di controllo erano disposte in modo ordinato, senza infiltrarsi nei leucociti. Nel gruppo Dox, le miofibre miocardiche erano disordinate e rotte e i cardiomiociti erano più piccoli e più sottili (Figura 4A). La colorazione di Masson ha mostrato che i topi trattati con Dox avevano più fibrosi interstiziale (Figura 4B).

Figura 1: Diagramma schematico di una cardiomiopatia dilatativa indotta da Dox. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: L'ecocardiografia dei due gruppi. (A) Gruppo di controllo; (B) Gruppo Dox. A sinistra è la sezione dell'asse lungo e a destra è la sezione dell'asse corto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Le variabili della funzione cardiaca tra i gruppi. a)EF; b)FS; (C) LVEDd; (D) LVED. *P < 0.05, T-test dellostudente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Colorazione istologica. (A) Colorazione H&E; (B) Colorazione di Masson. A sinistra è il gruppo di controllo e a destra è il gruppo Dox. La freccia superiore mostra che i cardiomiociti trattati con Dox erano più piccoli e più sottili e le miofibre erano disordinate e rotte. La freccia inferiore denota la presenza di fibrosi interstiziale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Dox è un farmaco chemioterapico antitumorale periodico non specifico comunemente usato nella pratica clinica¹². Il suo principale effetto collaterale è la cardiotossicità, caratterizzata da cardiomiopatia e successiva insufficienza cardiaca¹³. Il meccanismo sottostante include il danno della perossidazione lipidica miocardica, l'inibizione del reticolo sarcoplasmatico miocardico Ca²⁺-ATPasi e l'attivazione del sistema renninico-angiotensina locale miocardico, con conseguente aumento della produzione di AT II e sovraccarico intracellulare di calcio¹⁴. A causa dell'effetto letale di una grande dose di iniezione intraperitoneale di Dox, in questo protocollo è stato utilizzato un modo alternativo per stabilire un modello affidabile.

Il modello DCM stabilito da questo metodo è molto simile alla patogenesi del DCM umano. Oltre all'insufficienza cardiaca, la complicanza più comune di Dox, l'ascite è stata osservata nei topi DCM. Pertanto, durante lo sviluppo del modello, si deve prestare attenzione al funzionamento sterile e alla sostituzione tempestiva delle siringhe. Inoltre, per la dose di Dox, sono stati confrontati due metodi di somministrazione: un lungo ciclo di trattamento con una piccola dose e un trattamento a breve termine con una dose elevata. I risultati mostrano che l'iniezione continua di Dox a 5 mg / kg per quattro settimane può portare a un modello accurato di DCM, ridurre la mortalità dei topi e un tempo più breve per la creazione del modello.

In sintesi, un modello animale DCM murino stabile, affidabile ed economico può essere stabilito con successo mediante iniezione intraperitoneale di Dox. Questa ricerca fornisce un modello ideale per lo studio del DCM. Contribuirà a rivelare la patogenesi della cardiomiopatia dilatativa o dell'insufficienza cardiaca cronica ed esplorare nuovi farmaci o trattamenti per future applicazioni cliniche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB