Un modelo murino inducido por doxorrubicina de miocardiopatía dilatada in vivo

Summary

Se describe un protocolo para establecer un modelo de miocardiopatía dilatada (MCD) inducida por doxorrubicina en ratones mediante inyección intraperitoneal a largo plazo de doxorrubicina.

Abstract

La miocardiopatía dilatada (MCD) se refiere a un espectro de trastornos miocárdicos heterogéneos caracterizados por dilatación ventricular y rendimiento cardíaco deprimido en ausencia de hipertensión, enfermedades cardíacas valvulares, congénitas o isquémicas, y que pueden estar relacionados con infecciones, anomalías autoinmunes o metabólicas, o herencia familiar. Puede progresar a insuficiencia cardíaca congestiva con un mal pronóstico. La doxorrubicina (Dox) se emplea ampliamente como un fármaco quimioterapéutico, pero su uso es limitado porque causa cambios similares a la DCM del miocardio. Su toxicidad miocárdica se atribuye al estrés oxidativo, la inflamación crónica y la apoptosis cardiomiocita. No se ha establecido un modelo de DCM que explote estos síntomas de DCM inducidos por Dox.

Introduction

Una de las causas más comunes de insuficiencia cardíaca, la DCM se caracteriza por la dilatación ventricular y la disminución de la función cardíaca y es la razón más común para el trasplante de corazón en todo el mundo¹. Para investigar más a fondo su patogénesis y encontrar tratamientos efectivos, el acceso a modelos animales maduros es especialmente importante. El propósito de los experimentos descritos es establecer un modelo de ratón estable de DCM que se asemeje al DCM humano.

Debido a la compleja patogénesis de DCM, hay muchos métodos diferentes para hacer modelos animales correspondientes. Los modelos² de DCM espontáneos son relativamente estables, pero son caros y no están fácilmente disponibles. Los modelos animales modificados genéticamente³ no están bien establecidos y requieren un uso más experimental. Los modelos animales DCM inducidos por infección viral⁴ o defectos autoinmunes⁵ son fáciles de obtener, pero no son totalmente representativos de DCM. Los modelos asociados con la toxicidad miocárdica incluyen modelos DCM inducidos por alcohol y modelos animales DCM inducidos por Dox.

El modelo de miocardiopatía inducida por Dox se obtiene mediante inyección intraperitoneal de Dox^6. El modelo explota el efecto secundario crónico más grave de Dox: Después de la exposición a Dox, los pacientes desarrollan síntomas de DCM de inicio tardío con uniformidad clínica⁷. El estrés oxidativo inducido por Dox⁸ y el daño mitocondrial^9,que conducen a la apoptosis de los cardiomiocitos, son síntomas en la patogénesis de dcM. Existen modelos de tratamiento dox agudo y crónico: una sola dosis alta de Dox (15 mg/kg) induce un modelo a corto plazo para la miocardiopatía^10,mientras que las inyecciones repetitivas de Dox en dosis bajas (seis semanales, 3 mg/kg) inducen un modelo a largo plazo para la miocardiopatía¹¹. Según el estudio presentado, los ratones de tipo salvaje inyectados por vía intraperitoneal una vez a la semana durante un mes a una dosis de 5 mg / kg muestran morfología e histología del corazón consistentes con las características de DCM al final del tratamiento, proporcionando una forma ideal de establecer un modelo de DCM.

Protocol

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital Nanjing Drum Tower.

1. Preparación de los reactivos y animales

1. Disolver el clorhidrato de doxorrubicina (Pfizer, EE.UU.) en agua esterilizada. Vórtice para obtener una solución Dox de 1 mg/ml y mantener a 4 °C.
2. Use ratones C57BL/6 (8–10 semanas de edad; 25–30 g de peso). Para este estudio, los ratones fueron comprados en el Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad de Nanjing y mantenidos en la sala de animales del Hospital nanjing Drum Tower.
3. Las jaulas de ratones libres de patógenos se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a una temperatura constante de 23 °C. Todos los animales fueron alimentados con una dieta normal de chow y recibieron comida y agua ad libitum.

2. Establecimiento del modelo animal DCM

1. Aleatorizar ratones en un grupo normal (n = 5) y Dox (n = 5).
2. Administrar la solución dox por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg utilizando una jeringa esterilizada de 1 ml 1 veces a la semana para el grupo Dox. Trate a los ratones de control de la misma manera con la misma cantidad de solución salina.
3. Mida el peso corporal de los dos grupos semanalmente. En consecuencia, ajuste la dosis de inyección en función del peso corporal semanalmente durante un total de 4 semanas, con una dosis acumulada de 20 mg / kg (Figura 1).
   NOTA: Se eligió un período de tiempo de 4 semanas porque la ecocardiografía a las 4 semanas mostró una diferencia significativa en la función cardíaca entre los dos grupos.

3. Examen ecocardiográfico

1. Al final de la cuarta semana, realice un examen ecocardiográfico de los ratones.
2. Anestesiar a los ratones con 2% de isoflurano por vía intranasal. Si los ratones no responden a una pizca de la piel con una pinza dentada o estimulando los dedos de los pies y la cola, continúe con el protocolo.
3. Coloque el ratón en una plataforma de manipulación de animales en posición supina. Para mantener la anestesia, cubra la nariz y la boca del animal con un cono nasal y administre isoflurano al 2%.
   NOTA: Para la anestesia IP, inyecte hidrato de cloral al 4% a una dosis de 0,2 ml/20 g.
4. Retire el pelaje del pecho con cuidado con una afeitadora eléctrica. Evaluar la función cardíaca in vivo mediante ecocardiografía transtorácica.
5. Realizar el ecocardiograma del VI tanto en las vistas paraesternales de eje largo como de eje corto a una velocidad de fotogramas de 233 Hz. Las dimensiones sistólicas finales y diastólicas finales se definieron como las fases correspondientes a la onda T del ECG y a la onda R, respectivamente.
6. En los trazados en modo M, mida el diámetro sistólico final del VI promedio (LVIDd), el diámetro diastólico final del VI (LVID), el grosor septal interventricular (IVS) y el grosor de la pared posterior del VI (LVPW) de 3 a 5 latidos cardíacos. También calcule la fracción de eyección (EF) y el acortamiento de fracción (FS) en función de la ecocardiografía.

4. Tinción histológica

1. Después del análisis ecocardiográfico, sacrificar a los ratones mediante inyección intraventricular de cloruro de potasio al 10%.
2. Perfundir el corazón con aproximadamente 30 ml de solución salina después de la disección hasta que el hígado y el pulmón se vuelvan pálidos.
3. Extirpe el corazón y lávelo a fondo en una solución tampón de fosfato para extruir la sangre.
4. Fije el corazón en formalina al 4% a temperatura ambiente durante 24 h y trate el tejido en una caja de parafina para que la cera de parafina se enfríe y se solidifique.
5. Cortar los corazones en rodajas de 5 μm de grosor para la tinción patológica.
6. Desparar y rehidratar secciones que contengan músculo papilar.
   1. Incubar portaobjetos a 55 °C durante 30 min. Luego, incubar en xileno 2x durante 2 min cada uno; 100% etanol 2x durante 2 min cada uno; 95% de etanol 2x durante 2 min cada uno; 80% de etanol durante 2 min; 75% de etanol durante 2 min; y etanol al 50% durante 2 min.
7. Tinción con hematoxilina y eosina (H&E), así como la tinción de Masson.

Representative Results

Función cardíaca
La miocardiopatía dilatada se caracteriza por dilatación ventricular progresiva y disfunción contráctil. La Figura 2 muestra imágenes ecocardiográficas representativas de los dos grupos. Los ratones tratados con Dox mostraron una fracción de eyección del ventrículo izquierdo marcadamente reducida y acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo(Figura 3A,B). El diámetro del VI también aumentó tanto en la fase diastólica como en la sistólica (Figura 3C,D). Esto reveló que los ratones tratados con Dox tenían una función cardíaca deteriorada.

Tinción histológica
Se realizó tinción patológica para observar los cambios patológicos de ratones tratados con solución salina y ratones tratados con Dox. Las fibras miocárdicas de los ratones en el grupo de control estaban ordenadas cuidadosamente, sin infiltrar leucocitos. En el grupo Dox, las miofiberes miocárdicas estaban desordenadas y rotas, y los cardiomiocitos eran más pequeños y delgados(Figura 4A). La tinción de Masson mostró que los ratones tratados con Dox tenían más fibrosis intersticial(Figura 4B).

Figura 1: Diagrama esquemático de una miocardiopatía dilatada inducida por Dox. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: La ecocardiografía de los dos grupos. (A) Grupo de control; (B) Grupo Dox. Izquierda es la sección de eje largo y derecha es la sección de eje corto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Las variables de la función cardíaca entre grupos. A) EF; b)FS; C)LVEDd; (D) LVEDs. *P < 0.05, Prueba t delestudiante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Tinción histológica. (A) Tinción de H&E; (B) Tinción de Masson. A la izquierda está el grupo de control y a la derecha está el grupo Dox. La flecha superior muestra que los cardiomiocitos tratados con Dox eran más pequeños y delgados y que las miofiberes estaban desordenadas y rotas. La flecha inferior denota la presencia de fibrosis intersticial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Dox es un fármaco antitumoral antitumoral inespecífico de uso común en la práctica clínica¹². Su principal efecto secundario es la cardiotoxicidad, caracterizada por miocardiopatía y posterior insuficiencia cardíaca¹³. El mecanismo subyacente incluye el daño de la peroxidación lipídica miocárdica, la inhibición del retículo sarcoplásmico miocárdico Ca²⁺-ATPasa y la activación del sistema miocárdico local de renina-angiotensina, lo que resulta en un aumento de la producción de AT II y sobrecarga de calcio intracelular¹⁴. Debido al efecto letal de una gran dosis de inyección intraperitoneal de Dox, se utilizó una forma alternativa de establecer un modelo confiable en este protocolo.

El modelo DCM establecido por este método es muy similar a la patogénesis del DCM humano. Además de la insuficiencia cardíaca, la complicación más común de Dox, la ascitis se observó en ratones DCM. Por lo tanto, durante el desarrollo del modelo, se debe prestar atención a la operación estéril y al reemplazo oportuno de las jeringas. Además, para la dosis de Dox, se compararon dos métodos de administración: un ciclo largo de tratamiento con una dosis pequeña y un tratamiento a corto plazo con una dosis alta. Los resultados muestran que la inyección continua de Dox a 5 mg / kg durante cuatro semanas puede resultar en un modelo preciso de DCM, una menor mortalidad de ratones y un tiempo más corto para el establecimiento del modelo.

En resumen, se puede establecer con éxito un modelo animal DCM de ratón estable, confiable y económico mediante la inyección intraperitoneal de Dox. Esta investigación proporciona un modelo ideal para estudiar DCM. Contribuirá a revelar la patogénesis de la miocardiopatía dilatada o la insuficiencia cardíaca crónica y explorará nuevos medicamentos o tratamientos para futuras aplicaciones clínicas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB