Een doxorubicine-geïnduceerd murinemodel van gedilateerde cardiomyopathie in vivo

Summary

Beschreven is een protocol om een doxorubicine-geïnduceerd gedilateerde cardiomyopathie (DCM) model vast te stellen bij muizen via langdurige intraperitoneale injectie van Doxorubicine.

Abstract

Gedilateerde cardiomyopathie (DCM) verwijst naar een spectrum van heterogene myocardiale aandoeningen die worden gekenmerkt door ventriculaire dilatatie en depressieve hartprestaties in afwezigheid van hypertensie, valvulaire, aangeboren of ischemische hartziekten, en die verband kunnen houden met infectie, auto-immuun- of metabole afwijkingen of familie-overerving. Het kan zich ontwikkelen tot congestief hartfalen met een slechte prognose. Doxorubicine (Dox) wordt veel gebruikt als een chemotherapeutisch medicijn, maar het gebruik ervan is beperkt omdat het DCM-achtige veranderingen van het myocard veroorzaakt. De myocardiale toxiciteit wordt toegeschreven aan oxidatieve stress, chronische ontsteking en cardiomyocytenapoptose. Een model van DCM die deze dox-geïnduceerde DCM-symptomen gebruikt, is niet vastgesteld.

Introduction

Een van de meest voorkomende oorzaken van hartfalen, DCM wordt gekenmerkt door ventriculaire dilatatie en verminderde hartfunctie en is de meest voorkomende reden voor harttransplantatie wereldwijd¹. Om de pathogenese verder te onderzoeken en effectieve behandelingen te vinden, is toegang tot volwassen diermodellen bijzonder belangrijk. Het doel van de beschreven experimenten is om een stabiel muismodel van DCM vast te stellen dat lijkt op menselijke DCM.

Door de complexe pathogenese van DCM zijn er veel verschillende methoden om bijbehorende diermodellen te maken. Spontane DCM-modellen² zijn relatief stabiel, maar ze zijn duur en niet gemakkelijk verkrijgbaar. Genetisch gemodificeerde diermodellen³ zijn niet goed ingeburgerd en vereisen meer experimenteel gebruik. DCM-diermodellen geïnduceerd door virale infectie⁴ of auto-immuundefecten⁵ zijn gemakkelijk te verkrijgen, maar ze zijn niet volledig representatief voor DCM. Modellen geassocieerd met myocardiale toxiciteit omvatten alcohol-geïnduceerde DCM-modellen en Dox-geïnduceerde DCM-diermodellen.

Het Dox-geïnduceerde cardiomyopathiemodel wordt verkregen door intraperitoneale injectie van Dox⁶. Het model maakt gebruik van de meest ernstige chronische bijwerking van Dox: na blootstelling aan Dox ontwikkelen patiënten DCM-symptomen met late aanvang met klinische uniformiteit⁷. Dox-geïnduceerde oxidatieve stress⁸ en mitochondriale schade⁹, die leiden tot cardiomyocytenapoptose, zijn symptomen in de pathogenese van DCM. Er zijn acute en chronische Dox-behandelingsmodellen: een enkele hoge dosis Dox (15 mg / kg) induceert een kortetermijnmodel voor cardiomyopathie¹⁰, terwijl repetitieve dox-injecties met een lage dosis (zes per week, 3 mg / kg) een langetermijnmodel voor cardiomyopathie^{induceren 11}. Op basis van de gepresenteerde studie vertonen wildtype muizen die eenmaal per week gedurende een maand intraperitoneaal worden geïnjecteerd in een dosis van 5 mg / kg morfologie en histologie van het hart die consistent zijn met de kenmerken van DCM aan het einde van de behandeling, wat een ideale manier is om een DCM-model vast te stellen.

Protocol

Dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Nanjing Drum Tower Hospital.

1. Bereiding van de reagentia en dieren

1. Los doxorubicinehydrochloride (Pfizer, VS) op in gesteriliseerd water. Vortex om een Dox-oplossing van 1 mg/ml te verkrijgen en op 4 °C te houden.
2. Gebruik C57BL/6 muizen (8-10 weken oud; 25-30 g gewicht). Voor deze studie werden muizen gekocht van het Model Animal Research Center van nanjing University en bewaard in de dierenkamer van nanjing drum tower hospital.
3. Pathogeenvrije muizenkooien werden gehouden onder een licht/donkercyclus van 12 uur bij een constante temperatuur van 23 °C. Alle dieren kregen een normaal chow dieet en kregen voedsel en water ad libitum.

2. Vaststelling van het DCM-diermodel

1. Randomiseer muizen in een normale (n = 5) groep en Dox (n = 5) groep.
2. Dien de Dox-oplossing intraperitoneaal toe in een dosis van 5 mg/kg met behulp van een gesteriliseerde spuit van 1 ml 1x per week voor de Dox-groep. Behandel de controlemuizen op dezelfde manier met dezelfde hoeveelheid zoutoplossing.
3. Meet wekelijks het lichaamsgewicht van de twee groepen. Pas dienovereenkomstig de injectiedosis aan op basis van het lichaamsgewicht wekelijks gedurende in totaal 4 weken, met een cumulatieve dosis van 20 mg / kg (figuur 1).
   OPMERKING: Er werd gekozen voor een periode van 4 weken omdat echocardiografie na 4 weken een significant verschil in hartfunctie tussen de twee groepen liet zien.

3. Echocardiografisch onderzoek

1. Voer aan het einde van de vierde week een echocardiografisch onderzoek van de muizen uit.
2. Verdoof de muizen met 2% isofluraan intranasaal. Als de muizen niet reageren op een snufje van de huid met een getand pincet of het stimuleren van de tenen en staarten, ga dan verder met het protocol.
3. Plaats de muis op een platform voor het hanteren van dieren in rugligging. Om de anesthesie te behouden, bedekt u de neus en mond van het dier met een neuskegel en levert u 2% isofluraan.
   OPMERKING: Injecteer voor IP-anesthesie 4% chloraalhydraat in een dosis van 0,2 ml / 20 g.
4. Verwijder de borstvacht voorzichtig met een elektrisch scheerapparaat. Beoordeel de hartfunctie in vivo met behulp van transthoracale echocardiografie.
5. Voer het LV-echocardiogram uit in zowel de parasternale langas- als de korte-asweergaven met een framesnelheid van 233 Hz. End-systolische en einddiastolische dimensies werden gedefinieerd als de fasen die overeenkomen met respectievelijk de ECG T-golf en de R-golf.
6. Meet op de M-modus traceringen de gemiddelde LV eind-systolische diameter (LVIDd), LV einddiastolische diameter (LVIDs), interventriculaire septumdikte (IVS) en LV posterior wanddikte (LVPW) van 3-5 hartslagen. Bereken ook de ejectiefractie (EF) en fractieverkorting (FS) op basis van echocardiografie.

4. Histologische kleuring

1. Offer na de echocardiografische analyse de muizen op door intraventriculaire injectie van 10% kaliumchloride.
2. Perfuseer het hart met ongeveer 30 ml zoutoplossing na dissectie totdat de lever en longen bleek worden.
3. Snijd het hart weg en was het grondig in fosfaatbufferoplossing om bloed te extruderen.
4. Fixeer het hart in 4% formaline bij kamertemperatuur gedurende 24 uur en behandel het weefsel in een paraffinedoos zodat de paraffine afkoelt en stolt.
5. Snijd de harten in plakken van 5 μm dik voor pathologische kleuring.
6. Dewax en rehydrateer secties die papillaire spier bevatten.
   1. Incubeer dia's bij 55 °C gedurende 30 minuten. Incubeer vervolgens 2x xyleen gedurende 2 minuten elk; 100% ethanol 2x gedurende 2 min elk; 95% ethanol 2x gedurende 2 min elk; 80% ethanol gedurende 2 min; 75% ethanol gedurende 2 min; en 50% ethanol gedurende 2 min.
7. Vlek met hematoxyline en eosine (H & E) en massonvlek.

Representative Results

Hartfunctie
Gedilateerde cardiomyopathie wordt gekenmerkt door progressieve ventriculaire dilatatie en contractiele disfunctie. Figuur 2 toont representatieve echocardiografische beelden van de twee groepen. Met Dox behandelde muizen vertoonden een duidelijk verminderde linkerventrikel ejectiefractie en linkerventrikel fractionele verkorting (figuur 3A,B). De LV-diameter nam ook toe in zowel de diastolische als de systolische fase(figuur 3C,D). Hieruit bleek dat met Dox behandelde muizen een verminderde hartfunctie hadden.

Histologische kleuring
Pathologische kleuring werd uitgevoerd om de pathologische veranderingen van met zoutoplossing behandelde muizen en met Dox behandelde muizen te observeren. Myocardiale vezels van de muizen in de controlegroep waren netjes gerangschikt, zonder leukocyten te infiltreren. In de Dox-groep waren myocardiale myofiberen ongeordend en gebroken, en cardiomyocyten waren kleiner en dunner(figuur 4A). Massonkleuring toonde aan dat met Dox behandelde muizen meer interstitiële fibrose hadden(figuur 4B).

Figuur 1: Schematisch diagram van een dox-geïnduceerde gedilateerde cardiomyopathie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: De echocardiografie van de twee groepen. (A) Controlegroep; (B) Dox groep. Links is het lange-as gedeelte en rechts is het korte-as gedeelte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De hartfunctievariabelen tussen groepen. (A) EF; B) FS; C) LVEDd; (D) LVEDs. *P < 0,05, Student's t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Histologische kleuring. (A) H&E kleuring; (B) Masson kleuring. Links is de controlegroep en rechts is de Dox-groep. De bovenste pijl laat zien dat met Dox behandelde cardiomyocyten kleiner en dunner waren en dat de myofiberen ongeordend en gebroken waren. De onderste pijl duidt op de aanwezigheid van interstitiële fibrose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5

Discussion

Dox is een niet-specifiek periodiek antitumorchemotherapiegeneesmiddel dat vaak wordt gebruikt in de klinische praktijk¹². De belangrijkste bijwerking is cardiotoxiciteit, gekenmerkt door cardiomyopathie en daaropvolgende hartfalen¹³. Het onderliggende mechanisme omvat schade aan myocardiale lipideperoxidatie, remming van myocardiale sarcoplasmatisch reticulum Ca^{2 +}-ATPase-activiteit en activering van het myocardiale lokale renine-angiotensinesysteem, resulterend in verhoogde AT II-productie en intracellulaire calciumoverbelasting¹⁴. Vanwege het dodelijke effect van een grote dosis intraperitoneale injectie van Dox, werd in dit protocol een alternatieve manier gebruikt om een betrouwbaar model vast te stellen.

Het DCM-model dat met deze methode is vastgesteld, lijkt sterk op de pathogenese van menselijke DCM. Naast hartfalen, de meest voorkomende complicatie van Dox, werden ascites waargenomen bij DCM-muizen. Daarom moet tijdens de modelontwikkeling aandacht worden besteed aan steriele werking en tijdige vervanging van spuiten. Bovendien werden voor de Dox-dosis twee toedieningsmethoden vergeleken: een lange behandelingskuur met een kleine dosis en een kortdurende behandeling met een hoge dosis. De resultaten tonen aan dat continue injectie van Dox bij 5 mg / kg gedurende vier weken kan resulteren in een nauwkeurig model van DCM, lagere muizensterfte en een kortere tijd voor modelvorming.

Kortom, een stabiel, betrouwbaar en economisch DCM-diermodel voor muizen kan met succes worden vastgesteld door intraperitoneale injectie van Dox. Dit onderzoek biedt een ideaal model voor het bestuderen van DCM. Het zal bijdragen aan het onthullen van de pathogenese van gedilateerde cardiomyopathie of chronisch hartfalen en het verkennen van nieuwe geneesmiddelen of behandelingen voor toekomstige klinische toepassingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB