En Doxorubicin-induceret Murine Model af udvidet kardiomyopati i Vivo

Summary

Beskrevet er en protokol til at etablere en Doxorubicin-induceret udvidet kardiomyopati (DCM) model i mus via langsigtet intraperitoneal injektion af Doxorubicin.

Abstract

Udvidet kardiomyopati (DCM) refererer til et spektrum af heterogene myokardiesygdomme karakteriseret ved ventrikulær dilatation og deprimeret hjertepræstation i mangel af hypertension, valvular, medfødt, eller iskæmisk hjertesygdomme, og som kan være relateret til infektion, autoimmune eller metaboliske abnormiteter, eller familie arv. Det kan udvikle sig til overbelastet hjertesvigt med en dårlig prognose. Doxorubicin (Dox) er almindeligt anvendt som et kemoterapeutisk lægemiddel, men dets anvendelse er begrænset, fordi det forårsager DCM-lignende ændringer af myokardiet. Dens myokardietoksicitet tilskrives oxidativ stress, kronisk betændelse, og kardiomyocyt apoptose. En model af DCM udnytte disse Dox-induceret DCM symptomer er ikke blevet etableret.

Introduction

En af de mest almindelige årsager til hjertesvigt, DCM er karakteriseret ved ventrikulær dilatation og nedsat hjertefunktion og er den mest almindelige årsag til hjertetransplantation på verdensplan¹. For yderligere at undersøge dens patogenese og finde effektive behandlinger er adgang til modne dyremodeller særlig vigtig. Formålet med de beskrevne eksperimenter er at etablere en stabil musemodel af DCM, der ligner menneskelige DCM.

På grund af DCM's komplekse patogenese er der mange forskellige metoder til at lave tilsvarende dyremodeller. Spontane DCM-modeller² er relativt stabile, men de er dyre og ikke let tilgængelige. Genetisk modificerede dyremodeller³ er ikke veletablerede og kræver mere eksperimentel anvendelse. DCM dyremodeller forårsaget af virusinfektion⁴ eller autoimmune defekter⁵ er nemme at opnå, men de er ikke helt repræsentative for DCM. Modeller forbundet med myokardietoksicitet omfatter alkohol-induceret DCM modeller og Dox-induceret DCM dyremodeller.

Den Dox-inducerede kardiomyopatimodel opnås ved intraperitoneal injektion af Dox⁶. Modellen udnytter den mest alvorlige kroniske bivirkning af Dox: Efter Dox eksponering, patienter udvikler sent debut DCM symptomer med klinisk ensartethed⁷. Dox-induceret oxidativ stress⁸ og mitokondrieskader⁹, som fører til kardiomyocyt apoptose, er symptomer i patogenesen af DCM. Der findes akutte og kroniske Dox-behandlingsmodeller: En enkelt høj dosis Dox (15 mg/kg) fremkalder en kortsigtet model for kardiomyopati¹⁰, mens gentagne dox-injektioner med lav dosis (seks ugentlige, 3 mg/kg) fremkalder en langsigtet model for kardiomyopati¹¹. Baseret på den præsenterede undersøgelse injiceres vilde typemus intraperitoneally en gang om ugen i en måned ved en dosis på 5 mg /kg displaymorfologi og histologi i hjertet i overensstemmelse med DCM's egenskaber ved afslutningen af behandlingen, hvilket giver en ideel måde at etablere en DCM-model på.

Protocol

Dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Nanjing Drum Tower Hospital.

1. Tilberedning af reagenser og dyr

1. Opløs doxorubicinhydrochlorid (Pfizer, USA) i steriliseret vand. Vortex for at opnå en Dox-opløsning på 1 mg/mL og holde ved 4 °C.
2. Brug C57BL/6 mus (8-10 uger gamle; 25-30 g vægt). Til denne undersøgelse blev mus købt fra Model Animal Research Center på Nanjing University og opbevaret i dyrerummet på Nanjing Drum Tower Hospital.
3. Patogenfrie musebure blev opretholdt under en 12 timers lys/mørk cyklus ved en konstant temperatur på 23 °C. Alle dyr blev fodret med en normal chow kost og fik mad og vand ad libitum.

2. Etablering af DCM dyremodel

1. Randomiser mus i en normal (n = 5) gruppe og Dox (n = 5) gruppe.
2. Dox-opløsningen intraperitonealt ved en dosis på 5 mg/kg ved hjælp af en 1 mL steriliseret sprøjte 1x om ugen for Dox-gruppen. Behandl kontrolmusene på samme måde med den samme mængde saltvandsopløsning.
3. Mål kropsvægten af de to grupper ugentligt. Juster derfor injektionsdosis baseret på kropsvægt ugentligt i i alt 4 uger med en kumulativ dosis på 20 mg/kg (Figur 1).
   BEMÆRK: En tidsperiode på 4 uger blev valgt, fordi ekkokardiografi efter 4 uger viste en signifikant forskel i hjertefunktionen mellem de to grupper.

3. Ekkokardiografisk undersøgelse

1. I slutningen af den fjerde uge skal du foretage en ekkokardiografisk undersøgelse af musene.
2. Bedøve musene med 2% isoflurane intranasally. Hvis musene ikke reagerer på en knivspids af huden med en tandet pincet eller stimulerer tæerne og haler, fortsæt med protokollen.
3. Placer musen på en dyrehåndteringsplatform i liggende stilling. For at opretholde anæstesi skal du dække dyrets næse og mund med en næsekegle og levere 2% isoflurane.
   BEMÆRK: For IP-anæstesi injiceres 4 % chloralhydrat ved en dosis på 0,2 mL/20 g.
4. Fjern brystpels forsigtigt med en elektrisk barbermaskine. Vurder hjertefunktion in vivo ved hjælp af transthoracic ekkokardiografi.
5. Udfør LV-ekkokardiogrammet i både de parasternalske langakse- og kortaksede visninger med en billedhastighed på 233 Hz. Endsystoliske og end-diastoliske dimensioner blev defineret som de faser, der svarer til henholdsvis EKG T-bølgen og R-bølgen.
6. På M-mode sporinger, måle den gennemsnitlige LV endesystolisk diameter (LVIDd), LV ende-diastolisk diameter (LVIDs), interventrikulær septal tykkelse (IVS), og LV posterior vægt tykkelse (LVPW) fra 3-5 hjerteslag. Beregn også udslyngningsfraktionen (EF) og Brøkforkortning (FS) baseret på ekkokardiografi.

4. Histologisk farvning

1. Efter ekkokardiografisk analyse skal musene ofres ved intraventrikulær injektion af 10% kaliumchlorid.
2. Gennemgå hjertet med ca. 30 mL saltvand efter dissektion, indtil leveren og lungen bliver bleg.
3. Fjern hjertet og vask det grundigt i fosfatbufferopløsning for at ekstrudere blod.
4. Fix hjertet i 4% formalin ved stuetemperatur i 24 timer og behandle vævet i en paraffin boks, således at paraffin voks køler ned og størkner.
5. Skær hjerterne i 5 μm tykke skiver til patologisk farvning.
6. Dewax og rehydrere sektioner, der indeholder papillære muskler.
   1. Inkuberes ved 55 °C i 30 min. Derefter inkuberes i xylen 2x i 2 min hver; 100% ethanol 2x i 2 min hver; 95% ethanol 2x i 2 min hver; 80% ethanol i 2 min; 75% ethanol i 2 min; og 50% ethanol i 2 min.
7. Plet ved hjælp af hæmatoxylin og eosin (H &E) samt Massons plet.

Representative Results

Hjertefunktion
Udvidet kardiomyopati er karakteriseret ved progressiv ventrikulær dilatation og kontraktile dysfunktion. Figur 2 viser repræsentative ekkokardigrafiske billeder af de to grupper. Dox-behandlede mus viste markant reduceret venstre ventrikulær udslyngning fraktion og venstre ventrikulær fraktioneret afkortning (Figur 3A,B). LV-diameteren steg også i både de diastoliske og systoliske faser (figur 3C,D). Dette afslørede, at Dox-behandlede mus havde en nedsat hjertefunktion.

Histologisk farvning
Patologisk farvning blev udført for at observere de patologiske ændringer af saltvandsbehandlede mus og Dox-behandlede mus. Myokardiefibre af musene i kontrolgruppen var pænt arrangeret uden at infiltrere leukocytter. I Dox-gruppen blev myokardiemyofibre uorganiseret og brudt, og kardiomyocytter var mindre og tyndere (Figur 4A). Massonfarvning viste, at Dox-behandlede mus havde mere interstitiel fibrose (Figur 4B).

Figur 1: Skematisk diagram over en Dox-induceret udvidet kardiomyopati. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: De to gruppers ekkokardiografi. (A) Kontrolgruppe; (B) Dox-gruppen. Venstre er den lange akse sektion og højre er den korte akse sektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Hjertefunktionsvariablerne mellem grupper. a) EF; b) FS; C) LVEDd; (D) LVED'er. * P < 0,05, Student's t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Histologisk farvning. (A) H&E farvning; (B) Masson farvning. Venstre er kontrolgruppen, og til højre er Dox-gruppen. Den øverste pil viser, at Dox-behandlede kardiomyocytter var mindre og tyndere og myofibererne blev uorden og brudt. Den nederste pil betegner tilstedeværelsen af interstitiel fibrose. Klik her for at se en større version af dette tal.

5

Discussion

Dox er et uspecifikt periodisk antitumor kemoterapi lægemiddel, der almindeligvis anvendes i klinisk praksis¹². Dens vigtigste bivirkning er kardiotoksicitet, karakteriseret ved kardiomyopati og efterfølgende hjertesvigt¹³. Den underliggende mekanisme omfatter skader på myokardie lipidperoxidation, hæmning af myokardie sarcoplasmisk reticulum Ca²⁺-ATPase aktivitet, og aktivering af myokardie lokale renin-angiotensin system, hvilket resulterer i øget AT II produktion og intracellulær calcium overbelastning¹⁴. På grund af den dødelige virkning af en stor dosis intraperitoneal injektion af Dox, en alternativ måde at etablere en pålidelig model blev brugt i denne protokol.

DCM-modellen, der er etableret ved denne metode, ligner meget patogenesen af human DCM. Ud over hjertesvigt blev den mest almindelige komplikation af Dox, ascites observeret hos DCM mus. Derfor bør der under modeludvikling lægges vægt på steril drift og rettidig udskiftning af sprøjter. Derudover blev to administrationsmetoder sammenlignet for Dox-dosis: et langt behandlingsforløb med en lille dosis og kortvarig behandling med en høj dosis. Resultaterne viser, at kontinuerlig injektion af Dox ved 5 mg/kg i fire uger kan resultere i en nøjagtig model af DCM, lavere musdødelighed og kortere tid til modelvirksomhed.

Sammenfattende, en stabil, pålidelig og økonomisk mus DCM dyremodel kan med succes etableres ved intraperitoneal injektion af Dox. Denne forskning giver en ideel model til at studere DCM. Det vil bidrage til at afsløre patogenesen af udvidet kardiomyopati eller kronisk hjertesvigt og udforske nye lægemidler eller behandlinger til fremtidige kliniske anvendelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB