Um modelo de murina induzida por doxorubicina de cardiomiopatia dilatada em Vivo

Summary

Descrito é um protocolo para estabelecer um modelo de cardiomiopatia dilatada induzida por Doxorubicina (DCM) em camundongos através de injeção intraperitoneal de doxorubicina a longo prazo.

Abstract

A cardiomiopatia dilatada (DCM) refere-se a um espectro de distúrbios heterogêneos do miocárdio caracterizado por dilatação ventricular e desempenho cardíaco deprimido na ausência de hipertensão arterial, valvular, congênita ou doenças cardíacas isquêmicas, e que podem estar relacionadas a infecções, anormalidades autoimunes ou metabólicas ou herança familiar. Pode evoluir para insuficiência cardíaca congestiva com um prognóstico ruim. A doxorubicina (Dox) é amplamente empregada como uma droga quimioterápica, mas seu uso é limitado porque causa alterações semelhantes ao DCM do miocárdio. Sua toxicidade miocárdio é atribuída ao estresse oxidativo, inflamação crônica e apoptose cardiomiocócica. Um modelo de DCM explorando esses sintomas de DCM induzidos pelo Dox não foi estabelecido.

Introduction

Uma das causas mais comuns de insuficiência cardíaca, o DCM é caracterizado pela dilatação ventricular e diminuição da função cardíaca e é a razão mais comum para transplante de coração em todo o mundo¹. Para investigar melhor sua patogênese e encontrar tratamentos eficazes, o acesso a modelos animais maduros é especialmente importante. O objetivo dos experimentos descritos é estabelecer um modelo de rato estável de DCM que se assemelha ao DCM humano.

Devido à complexa patogênese do DCM, existem muitos métodos diferentes para fazer modelos animais correspondentes. Os modelos espontâneos de DCM² são relativamente estáveis, mas são caros e não são facilmente disponíveis. Os modelos animais geneticamente modificados³ não são bem estabelecidos e requerem mais uso experimental. Modelos animais DCM induzidos por infecção viral⁴ ou defeitos autoimunes⁵ são fáceis de obter, mas não são totalmente representativos do DCM. Os modelos associados à toxicidade do miocárdio incluem modelos dcm induzidos pelo álcool e modelos animais DCM induzidos pelo Dox.

O modelo de cardiomiopatia induzido pelo Dox é obtido por injeção intraperitoneal de Dox⁶. O modelo explora o efeito colateral crônico mais grave do Dox: Após a exposição ao Dox, os pacientes desenvolvem sintomas de DCM de início tardio com uniformidade clínica⁷. O estresse oxidativo induzido pelo dox⁸ e o dano mitocondrial⁹, que levam à apoptose cardiomiocese, são sintomas na patogênese do DCM. Existem modelos de tratamento dox agudos e crônicos: uma única dose alta de Dox (15 mg/kg) induz um modelo de curto prazo para cardiomiopatia¹⁰, enquanto as injeções repetitivas de dox de baixa dose (seis semanais, 3 mg/kg) induzem um modelo de longo prazo para cardiomiopatia¹¹. Com base no estudo apresentado, camundongos do tipo selvagem injetaram uma vez por semana durante um mês em uma dose de 5 mg/kg de morfologia e histologia do coração consistentes com as características do DCM ao final do tratamento, fornecendo uma maneira ideal de estabelecer um modelo de DCM.

Protocol

Os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Nanjing Drum Tower Hospital.

1. Preparação dos reagentes e animais

1. Dissolver o cloridrato de doxorubicina (Pfizer, EUA) em água esterilizada. Vórtice para obter uma solução Dox de 1 mg/mL e manter a 4 °C.
2. Use camundongos C57BL/6 (8-10 semanas de idade; 25-30 g de peso). Para este estudo, os camundongos foram comprados no Centro de Pesquisa Animal Modelo da Universidade de Nanjing e mantidos na sala de animais do Nanjing Drum Tower Hospital.
3. As gaiolas de camundongos livres de patógenos foram mantidas sob um ciclo claro/escuro de 12 h a uma temperatura constante de 23 °C. Todos os animais foram alimentados com uma dieta normal de comida e receberam comida e água ad libitum.

2. Estabelecimento do modelo animal DCM

1. Randomize os camundongos em um grupo normal (n = 5) e dox (n = 5).
2. Administre a solução Dox intraperitoneal a uma dose de 5 mg/kg usando uma seringa esterilizada de 1 mL 1x por semana para o grupo Dox. Trate os ratos de controle da mesma forma com a mesma quantidade de solução salina.
3. Meça o peso corporal dos dois grupos semanalmente. Assim, ajuste a dose de injeção com base no peso corporal semanalmente por um total de 4 semanas, com uma dose acumulada de 20 mg/kg(Figura 1).
   NOTA: Um período de 4 semanas foi escolhido porque a ecocardiografia em 4 semanas mostrou diferença significativa na função cardíaca entre os dois grupos.

3. Exame ecocardiográfico

1. No final da quarta semana, realize um exame ecocardiográfico dos camundongos.
2. Anestesiar os camundongos com 2% de isoflurane intranasally. Se os camundongos não responderem a uma pitada da pele com uma pinça dentada ou estimular os dedos dos dedos e caudas, continue com o protocolo.
3. Coloque o mouse em uma plataforma de manuseio de animais na posição supina. Para manter a anestesia, cubra o nariz e a boca do animal com um cone de nariz e entregue 2% de isoflurane.
   NOTA: Para anestesia IP, injete 4% de hidrato de cloro a uma dose de 0,2 mL/20 g.
4. Remova a pele do peito cuidadosamente com uma máquina de barbear elétrica. Avalie a função cardíaca in vivo usando ecocardiografia transtorácica.
5. Realize o ecocardiograma LV tanto nas visões parasternal de longo eixo quanto em eixo curto a uma taxa de quadros de 233 Hz. As dimensões sistólicas e terminais foram definidas como as fases correspondentes à onda ECG T e à onda R, respectivamente.
6. Nos traçadores do modo M, meça o diâmetro médio lv end-sistólica (LVIDd), diâmetro diastólico final lv (LVIDs), espessura septal interventricular (IVS) e espessura posterior da parede LV (LVPW) de 3-5 batimentos cardíacos. Calcule também a fração de ejeção (EF) e o encurtamento de frações (FS) com base na ecocardiografia.

4. Coloração histológica

1. Após a análise ecocardiográfica, sacrifique os camundongos por injeção intraventricular de 10% de cloreto de potássio.
2. Perfunda o coração com cerca de 30 mL de soro fisiológico após dissecção até que o fígado e o pulmão fiquem pálidos.
3. Extirpa o coração e lave-o completamente em solução tampão fosfato para extrusão sangue.
4. Fixar o coração em 4% de formalina à temperatura ambiente por 24 h e tratar o tecido em uma caixa de parafina para que a cera de parafina esfrie e solidifique.
5. Corte os corações em fatias de 5 μm de espessura para coloração patológica.
6. De cera e seções de reidratação contendo músculo papilar.
   1. Incubar lâminas a 55 °C por 30 min. Em seguida, incubar em xileno 2x por 2 min cada; 100% etanol 2x por 2 min cada; 95% de etanol 2x por 2 min cada; 80% de etanol por 2 min; 75% de etanol por 2 min; e 50% de etanol por 2 min.
7. Mancha usando hematoxilina e eosina (H&E), bem como a mancha de Masson.

Representative Results

Função cardíaca
A cardiomiopatia dilatada é caracterizada pela dilatação ventricular progressiva e disfunção contratil. A Figura 2 mostra imagens ecocardiográficas representativas dos dois grupos. Os camundongos tratados com dox apresentaram uma fração de ejeção ventricular esquerda significativamente reduzida e encurtamento fracionado ventricular esquerdo(Figura 3A,B). O diâmetro da LV também aumentou nas fases diastólica e sistólica(Figura 3C,D). Isso revelou que os camundongos tratados com Dox tinham uma função cardíaca prejudicada.

Manchas histológicas
A coloração patológica foi realizada para observar as alterações patológicas de camundongos tratados com soro fisiológico e camundongos tratados com dox. As fibras miocárdias dos camundongos do grupo controle foram ordenadamente organizadas, sem infiltrar leucócitos. No grupo Dox, os miofibers miocárdios foram desordenados e quebrados, e os cardiomiócitos foram menores e mais finos(Figura 4A). A coloração de Masson mostrou que os camundongos tratados com Dox tinham mais fibrose intersticiais (Figura 4B).

Figura 1: Diagrama esquemático de uma cardiomiopatia dilatada induzida pelo Dox. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A ecocardiografia dos dois grupos. (A) Grupo de controle; (B) Grupo dox. Esquerda é a seção de eixo longo e direita é a seção de eixo curto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: As variáveis de função cardíaca entre os grupos. (A)EF; (B) FS; (C) LVEDd; (D) LVEDs. *P < 0,05, teste t doaluno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Mancha histológica. (A)Mancha H&E; (B)Mancha de masson. Esquerda é o grupo de controle e à direita é o grupo Dox. A seta superior mostra que os cardiomiócitos tratados com Dox eram menores e mais finos e os miofibers estavam desordenados e quebrados. A seta inferior denota a presença de fibrose intersticial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5

Discussion

Dox é um medicamento de quimioterapia antitumor periódico inespecífico comumente utilizado na clínica¹². Seu principal efeito colateral é a cardiotoxicidade, caracterizada por cardiomiopatia e subsequente insuficiência cardíaca¹³. O mecanismo subjacente inclui danos da peroxidação lipídica miocárdica, inibição do reticulum sarcoplasmático miocárdio Ca²⁺-ATIVIDADE ATPase, e ativação do sistema local de renin-angiotensina miocárdica, resultando em aumento da produção AT II e sobrecarga intracelular de cálcio¹⁴. Devido ao efeito letal de uma grande dose de injeção intraperitoneal de Dox, uma maneira alternativa de estabelecer um modelo confiável foi usada neste protocolo.

O modelo DCM estabelecido por este método é muito semelhante à patogênese do DCM humano. Além da insuficiência cardíaca, a complicação mais comum de Dox, ascites foram observadas em camundongos DCM. Portanto, durante o desenvolvimento do modelo, deve-se prestar atenção à operação estéril e à substituição oportuna das seringas. Além disso, para a dose Dox, foram comparados dois métodos de administração: um longo curso de tratamento usando uma pequena dose, e tratamento de curto prazo com uma dose elevada. Os resultados mostram que a injeção contínua de Dox a 5 mg/kg por quatro semanas pode resultar em um modelo preciso de DCM, menor mortalidade de camundongos e menor tempo para estabelecimento modelo.

Em resumo, um modelo animal DCM de rato estável, confiável e econômico pode ser estabelecido com sucesso por injeção intraperitoneal de Dox. Esta pesquisa fornece um modelo ideal para estudar DCM. Contribuirá para revelar a patogênese da cardiomiopatia dilatada ou insuficiência cardíaca crônica e explorar novos medicamentos ou tratamentos para futuras aplicações clínicas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB