Summary
यहां प्रस्तुत एक ध्वनिक विभाजक का उपयोग कर चो सेल संस्कृति के प्राथमिक स्पष्टीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग शेक फ्लास्क संस्कृतियों या बायोरिएक्टर फसल के प्राथमिक स्पष्टीकरण के लिए किया जा सकता है और परफ्यूजन बायोरिएक्टर संचालन के दौरान सेल ब्लीड सामग्री के निरंतर स्पष्टीकरण के लिए संभावित आवेदन है।
Abstract
प्राथमिक स्पष्टीकरण काटा सेल संस्कृति तरल पदार्थ के भीतर चिकित्सीय उत्पादों से कोशिकाओं के प्रारंभिक हटाने के लिए एक biomanufacturing प्रक्रिया में एक आवश्यक कदम है। जबकि अपकेंद्रित्र या निस्पंदन जैसे पारंपरिक तरीकों को सेल हटाने के लिए व्यापक रूप से लागू किया जाता है, इन प्रक्रियाओं के लिए उपकरण में बड़े पैरों के निशान होते हैं और ऑपरेशन में संदूषण जोखिम और फिल्टर फाउलिंग शामिल हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, प्राथमिक स्पष्टीकरण के लिए निरंतर जैव प्रक्रिया योजनाओं के लिए पारंपरिक तरीके आदर्श नहीं हो सकते हैं। इस प्रकार, ध्वनिक (ध्वनि) तरंगों का उपयोग करके एक वैकल्पिक आवेदन कोशिका संस्कृति तरल पदार्थ से लगातार कोशिकाओं को अलग करने के लिए जांच की गई थी। इस अध्ययन में प्रस्तुत एक सीओ सेल बायोरिएक्टर फसल से मोनोक्लोनल IgG1 एंटीबॉडी युक्त संस्कृति तरल पदार्थ के प्राथमिक जुदाई के लिए एक बेंच पैमाने पर ध्वनिक तरंग विभाजक (एडब्ल्यूएस) का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है। प्रतिनिधि डेटा एडब्ल्यूएस से प्रस्तुत किए जाते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि प्रभावी सेल स्पष्टीकरण और उत्पाद वसूली कैसे प्राप्त करें। अंत में, निरंतर बायोप्रोसेसिंग में एडब्ल्यूएस के लिए संभावित अनुप्रयोगों पर चर्चा की जाती है। कुल मिलाकर, यह अध्ययन चो सेल संस्कृतियों के लिए प्राथमिक स्पष्टीकरण में एडब्ल्यूएस के कार्यान्वयन के लिए एक व्यावहारिक और सामान्य प्रोटोकॉल प्रदान करता है और आगे निरंतर जैव प्रक्रिया में इसकी आवेदन क्षमता का वर्णन करता है।
Introduction
स्रावित चिकित्सीय प्रोटीन से जुड़ी बायोमैन्यूफैक्चरिंग प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम काटा सेल कल्चर फ्लूइड (एचसीसीएफ) से बायोमास को हटाना है। परंपरागत रूप से, बायोमैन्यूफैक्चरर्स ने अपकेंद्रित्र को अपनाया है जिसके बाद मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1 के उत्पादन में उनके प्राथमिक स्पष्टीकरण विधियों के रूप में गहराई से निस्पंदन कियाजाताहै। हालांकि, अपकेंद्रित्र कोशिकाओं पर उच्च कतरनी तनाव का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एचसीएफ में सेलुलर मलबे में वृद्धि हो सकती है। इससे निस्पंदन के दौरान फ़िल्टर फाउलिंग हो सकती है और इसके परिणामस्वरूप अतिरिक्त संदूषक पोस्टफिल्ट्रेशन हो सकते हैं जो बाद में डाउनस्ट्रीम क्रोमेटोग्राफी दक्षता को कम कर सकते हैं1,2,3. इसके अलावा, एक निश्चित प्रक्रिया के लिए अपकेंद्री का अनुकूलन महंगा हो सकता है और इसे साफ-जगह और स्टरलाइज-इन-प्लेस सिस्टम के लिए अतिरिक्त कनेक्शन की आवश्यकता हो सकती है जो स्केलेबिलिटी के लिए एक सीमित कारक भी हो सकता है। गहराई फिल्टर का उपयोग अपकेंद्रित्र की सीमाओं के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं और एकल उपयोग प्रौद्योगिकी4का लाभ भी उठा सकते हैं। हालांकि, गहराई फिल्टर मुख्य रूप से माध्यमिक स्पष्टीकरण के रूप में उपयोग किया जाता है क्योंकि वे उच्च कोशिका संस्कृति घनत्वका सामनानहीं कर सकते 5 . वैकल्पिक रूप से, कतरनी तनाव को कम करने के लिए स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन (TFF) सेल अवधारण उपकरणों को नियोजित किया गया है, लेकिन झिल्ली ध्रुवीकरण और खराब फसल पैदावार6जैसी चुनौतियों का अनुभव हो सकता है। अपकेंद्रित्र के उपयोग के साथ-साथ गहराई से निस्पंदन या टीएफएफ के उपयोग से उत्पन्न होने वाले उपरोक्त मुद्दे एचसीसीएफ की प्राथमिक स्पष्टीकरण प्रक्रिया में सुधार के लिए एक अवसर पैदा करते हैं।
ध्वनिक पृथक्करण को एक ऐसी तकनीक के रूप में पेश किया गया था जिसका उपयोग उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन उत्पादों के साथ कोशिका संस्कृतियों से स्रावित प्रोटीन की कटाई के लिए किया जा सकता है7,8. ध्वनिक पृथक्करण बहुआयामी खड़ी तरंगों के प्रचार और प्रतिबिंब के माध्यम से प्राप्त किया जाता है जो निलंबित तरल पदार्थों और बनाए गए कणों के साथ बातचीत करते हैं9,10। ये कण तीन बलों का अनुभव करते हैं: द्रव ड्रैग, गुरुत्वाकर्षण और ध्वनिक विकिरण। जब प्रत्येक ताकत समान रूप से एक दूसरे के खिलाफ होती है, संतुलन तक पहुंचती है, तो कणों को निलंबित कर दिया जाता है और अल्ट्रासोनिक स्टैंडिंग वेव10के भीतर फंस जाता है। एक सेल संस्कृति निलंबन में, कोशिकाओं को खड़े तरंगों के इस दबाव नोड विमान के भीतर आयोजित किया जाता है, नोड कोशिकाओं के रूप में बढ़ता है, और अंततः सेलुलर नोड्स के ये समूह गुरुत्वाकर्षण बल9से गिरते हैं। इन तलछट कोशिकाओं को फिर मीडिया से हटा दिया जाता है, जो स्पष्ट मीडिया को आगे डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए पंप करने की अनुमति देता है। अलग - अलग करने की विधि के रूप में अल्ट्रासोनिक तरंगों का उपयोग लिपिड कणों और लाल रक्त कोशिकाओंके पृथक्करण से लेकर स्तनधारी परफ्यूजन सेल संस्कृति12तक जैविक अनुप्रयोगों में परिणत होना शुरू हो गया है । अपकेंद्री, गहराई निस्पंदन, या TFF से बचने के द्वारा लागत, श्रम, और सेलुलर तनाव को कम करने के लिए अपनी सापेक्ष क्षमताओं के साथ, बायोमैन्यूफैक्चरर ध्वनिक जुदाई का उपयोग करने के संभावित अनुप्रयोगों की खोज कर रहे हैं।
यह अध्ययन चो सेल संस्कृति के स्पष्टीकरण के लिए एक बेंचटॉप ध्वनिक तरंग विभाजक (एडब्ल्यूएस) के संचालन के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल प्रदान करता है, प्रतिनिधि डेटा प्रस्तुत करता है, और यह दर्शाता है कि प्रभावी सेल स्पष्टीकरण और उत्पाद वसूली कैसे प्राप्त की जाए।
Protocol
1. एडब्ल्यूएस की तैयारी
नोट: यह प्रोटोकॉल एक एसीस्टोफोरेटिक चैंबर का उपयोग करके विकसित किया गया था। हालांकि, बेंच-स्केल एडब्ल्यूएस में पांच टर्बिडिटी प्रोब हैं जो जरूरत पड़ने पर सीरीज में 4 एक्सोस्टोफोरेटिक चैंबर्स ऑपरेट कर सकते हैं ।
- एफ, 1, 2, 3, 4 (जैसे, चित्रा 1c में टर्बिडिटी जांच 1 और चित्रा 2एमें पोर्ट 1) और चैंबर पावर बीएनसी केबल्स को एडब्ल्यूएस सिस्टम के पीछे 1, 2, 3, 4(चित्रा 2b)के रूप में लेबल किए गए अपने संबंधित बंदरगाहों में कनेक्ट करें।
नोट: चैंबर पावर बीएनसी केबल(चित्रा 3c)के दूसरे छोर को एसी्टोस्टोफोरेटिक चैंबर(चित्रा 3 डी)के पीछे से न जोड़ें जब चैंबर तरल पदार्थ से भर जाए। यदि कक्ष में कोई तरल पदार्थ नहीं है, तो यह कक्ष में पीजो ट्रांसड्यूसर को नुकसान पहुंचाएगा और अब कार्य नहीं करेगा। - टर्बिडिटी मीटर और थर्मामीटर आवास में टर्बिडिटी जांच डालें और शिकंजाकसें (चित्रा 1c और चित्रा 3)।
- फीड पंप(चित्रा 1बी से1 सी)के माध्यम से फीड टर्बिडिटी पोर्ट(चित्रा 4a)के इनपुट से फीड ट्यूबिंग को कनेक्ट करें।
- फीड टर्बिडिटी पोर्ट(चित्रा 4b)के आउटपुट से वाई-टयूबिंग को एसीस्टोटोहोरेटिक चैंबर(चित्रा 4c)के इनलेट पोर्ट्स से कनेक्ट करें ।
- स्टेज1 पंप के माध्यम से एसीटोफोरेटेटिक चैंबर(चित्रा 4डी)के अपशिष्ट बंदरगाह से स्टेज 1 टयूबिंग को सेल संग्रह पोत(चित्रा 1डी 1e से 1fके माध्यम से) से कनेक्ट करें।
- प्रोब1 टर्बिडिटी पोर्ट (चित्रा4f)के इनपुट के लिए एसीटोफोरेटिक चैंबर(चित्रा 4e)के रिसते बंदरगाह से टयूबिंग को कनेक्ट करें।
- प्रोब1 टर्बिडिटी पोर्ट(चित्रा 4जी)से फसल ट्यूबिंग को उत्पाद संग्रह पोत(चित्रा 1सी से 1जी) सेकनेक्ट करें।
2. एचसीएफ के साथ सिस्टम प्राइम
नोट: यह प्रोटोकॉल रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम (6 एमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ ActiCHO P) में सुसंस्कृत चो-K1 कोशिकाओं का उपयोग करके विकसित किया गया था, जो मॉडल IgG1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी VRC0113 का उत्पादन करता है और अन्य सेल लाइनों और उत्पादों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एचसीसीएफ को एक मिलाते हुए फ्लास्क या बायोरिएक्टर प्रक्रिया से चो-के 1 संस्कृतियों के 7-8 दिनों के अंत में प्राप्त किया गया था।
- एडब्ल्यूएस के पीछे और सामने पावर स्विच चालू करके एडब्ल्यूएस चालू करें।
- कंप्यूटर चालू करें और संबंधित सॉफ्टवेयर (सामग्रीकी तालिका देखें) के लिए डेस्क आइकन पर डबल-क्लिक करें। 'रीडिंग'पैनल से डाटा रिकॉर्डिंग(चित्रा 5)शुरू करने के लिए'स्टार्ट टेस्ट'बटन दबाएं। एक बार डेटा रिकॉर्डिंग शुरू होने के बाद, एकत्र किए गए सभी डेटा को निर्यात योग्य स्प्रेडशीट में तब तक दर्ज किया जाएगा जब तक कि परीक्षण बंद नहीं हो जाता ।
- एचसीएफ पोत में फीड ट्यूबिंग एंड कनेक्ट करें उभारा जा रहा है ।
- फीड पंप की स्क्रीन पर'कंट्रोल'स्क्रीन पर पंप रेट डालकरफीड पंपशुरू करें और कीबोर्ड पर'एंटर'दबाएं। सुनिश्चित करें कि"पंप दिशा तीर आइकन"(दक्षिणावर्त या पलटवार) को ग्रे बॉक्स में फीड पंप इमेज के दाईं ओर सही ढंग से चुना गया है ताकि पोत से एचसीसीएफ को एसीस्टोफोमेटिक चैंबर में पंप किया जा सके। फीड पंप इमेज के तहत ग्रे बॉक्स के भीतर'टर्न ऑन'शब्दों के बगल में'त्रिकोण आइकन'पर क्लिक करें'स्टार्ट'पंप(चित्रा 6a)।
नोट: अधिकतम पंप दर 10 एल/एच (१६७ एमएल/मिनट) है, लेकिन यह सिफारिश की है कि नाममात्र प्रवाह दर, ६० एमएल/मिनट, इस कदम के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए जल्दी से जुदाई शुरू करने से पहले चैंबर overfilling जोखिम के बिना ट्यूबिंग और चैंबर भरें । - एक्टोटॉपहोरेटिक कक्ष के भरने के दौरान"प्रतिशत कटौती पैनल"(चित्रा 5c)को देख कर फ़ीड टर्बिडिटी मापों की निगरानी करें। यदि एचसीसीएफ पोत में पर्याप्त रूप से मिलाया जा रहा है तो चैंबर की लोडिंग के दौरान टर्बिडिटी मान लगातार बने रहेंगे ।
- एक बार तरल एसीओस्टोफोरेटिक चैंबर के पीछे पीजो ट्रांसड्यूसर से ऊपर हो जाने के बाद, पंप को रोकने के लिए फीड पंप इमेज के नीचे ग्रे बॉक्स के भीतर"बंद"दबाएं। बीएनसी पावर केबल(चित्रा 3सी)को एसीस्टोटोफोरेटिक चैंबर(चित्रा 3डी) सेकनेक्ट करें।
नोट: प्रत्येक एसी्टोस्टोफोरेटिक कक्ष की पाट मात्रा लगभग 190 एमएल है।
3. एडब्ल्यूएस का संचालन
- एक बार जब एसीओटोफोरेटिक चैंबर भर जाता है और बीएनसी पावर केबल को एसी्टोटोहोरेटिक चैंबर के पीछे से जोड़ा जाता है, तो फीड पंप की दर को वांछित ऑपरेटिंग दर(चित्रा 6a और टेबल 1)में बदल दें। किसी दिए गए प्रक्रिया के लिए आदर्श ऑपरेटिंग मापदंडों की पहचान करने के लिए कई फ़ीड पंप दरों का परीक्षण किया जाना चाहिए।
- पावर मॉड्यूल में बार को 10 डब्ल्यू(चित्रा 6d)में फिसलने और स्टेज 1 बॉक्स (चित्रा6c)के दाईं ओर"टर्न ऑन"आइकन दबाकर स्टेज1 पीजो पावर चालू करें। जैसा कि निर्माता द्वारा सुझाव दिया गया है, चो कोशिकाओं के लिए अनुशंसित पावर सेटिंग 10 डब्ल्यू का उपयोग करें। इससे ऑपरेशन के लिए 2 मेगाहर्ट्ज की एक तय फ्रीक्वेंसी जेनरेट होगी। कई सेकंड के बाद, कोशिकाओं को acoustophoretic कक्ष(चित्रा 7a)में लहर नोड्स पर झुरमुट दिख शुरू हो जाएगा ।
- एक बार जब कोशिकाएं एसी्टोस्टोहोरेटिक चैंबर(चित्रा 7b)के नीचे बसना शुरू कर देती हैं, तो सेल घनत्व और फीड पंप दर(चित्रा 6b)के आधार पर स्टेज1 पंप को उचित दर के साथ शुरू करें। निर्माता के अनुकूलन और स्थिर-राज्य ऑपरेशन स्प्रेडशीट के आधार पर, चरण 1 पंप दर की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके पैक सेल द्रव्यमान और फ़ीड प्रवाह दर के आधार पर की जा सकती है
- पैक किए गए सेल द्रव्यमान की गणना करने के लिए, खाली 15 एमएल ट्यूब (या अपकेंद्रित्र के साथ संगत अन्य ट्यूब) के साथ एक पैमाने को धड़ाल करें। फीड मटेरियल से ट्यूब भरें और ट्यूब के कुल वजन को फीड से रिकॉर्ड करें। 3,700 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए ट्यूब सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को एक अलग कंटेनर में डिसेंट करें। सेल गोली के साथ ट्यूब के वजन को मापें। फ़ीड सामग्री का पैक सेल द्रव्यमान प्रतिशत = (डिकेंसेंट ट्यूब वजन/भरा ट्यूब वजन) x 100%।
- स्टेज 1 टर्बिडिटी के टर्बिडिटी प्रोफाइल की निगरानी करें क्योंकि एसी्टोस्टोफोरेटिक चैंबर से ओवरफ्लो टर्बिडिटी प्रोब1(चित्रा 8)में प्रवेश करता है।
- सेल पृथक्करण जारी रहने के साथ ही सेल हटाने की क्षमता
बढ़ेगी। - इसके अलावा, फ़ीड और स्टेज 1 के बीच तापमान अंतर की निगरानी करें क्योंकि यह सेल पृथक्करण जारी रहने के साथ -साथ बढ़ेगा(चित्र 9)। उच्च कोशिका घनत्व फ़ीड का उपयोग किए जाने पर तापमान बढ़ सकता है लेकिन आम तौर पर फ़ीड प्रवाह दर में फेरबदल करके कम किया जा सकता है।
नोट: कई एसी्टोस्टोफोरेटिक कक्षों का उपयोग करते समय, कोई भी क्रमिक रूप से पिछले एसी्टोस्टोफोरेटिक चैंबर से ट्यूबिंग को वर्तमान एसी्टोस्टोफोरेटिक चैंबर के इनपुट से टर्बिडिटी जांच के माध्यम से जोड़ सकता है। इसके अलावा, एक मंच पंपों के माध्यम से एसीटोफोरेटिक कक्षों के नीचे से सेल संग्रह जहाजों के लिए मंच टयूबिंग कनेक्ट कर सकते हैं । यदि आवश्यक हो तो इष्टतम सेल हटाने दक्षता के लिए श्रृंखला में कुल चार एसी्टोस्टॉपहोरेटिक कक्षों को जोड़ा जा सकता है।
4. एडब्ल्यूएस समाप्त करना
- जब रन खत्म हो जाता है, तो पंपों को रोकने के लिए क्रमशः फीड पंप और स्टेज 1 पंप छवियों के तहत ग्रे बॉक्स के भीतर बंद हो कर फीड और स्टेज1 पंप को दबाकर बंद करें।
- स्टेज 1 बॉक्स के दाईं ओर बंद करके चैंबर में बिजली बंद करें और बीएनसी पावर केबल को डिस्कनेक्ट करें।
- आगे स्पष्टीकरण और शुद्धिकरण प्रक्रियाओं के लिए एकत्र उत्पाद फसल सामग्री लें, जैसे गहराई निस्पंदन और क्रोमेटोग्राफी विधियों। सेल हार्वेस्ट सामग्री को त्यागें।
- कचरे को खाली बर्तन में रखकर एसीटोफोरेटिक चैंबर में बचे हुए तरल पदार्थ को छान लें, एसीटोटॉपहोरेटिक चैंबर इनलेट से टयूबिंग को डिस्कनेक्ट करें और बंदरगाहों को पार करें और पंप हेड से अपशिष्ट ट्यूबिंग को छोड़ दें।
- टयूबिंग को फिर से कनेक्ट करें, अपशिष्ट ट्यूबिंग को पंप हेड में वापस रखें, और 60 एमएल/मिनट की फीड पंप दर और 60 एमएल/मिनट की चरण1 पंप दर का उपयोग करके फीड ट्यूबिंग के अंत से डीआई पानी के माध्यम से प्रवाहित करें। 15-20 मिनट के लिए जारी रखें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
- 15-20 मिनट के लिए फ़ीड पंप का उपयोग कर ट्यूबिंग और चैंबर के माध्यम से 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) पंप करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
- 15-20 मिनट के लिए फ़ीड पंप का उपयोग करके ट्यूबों और कक्ष को साफ करने के लिए डीआई पानी के साथ सफाई प्रक्रिया दोहराएं। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
- टर्बिडिटी जांच और एसीोस्टोफोरेटिक कक्षों से टयूबिंग को अलग करें और 70% आईपीए के साथ क्षेत्र को साफ करें।
- टर्बिडिटी जांच को अलग करें और 70% आईपीए के साथ टर्बिडिटी जांच के अंदर साफ करें। सभी भागों को सूखने दें और फिर अगले उपयोग के लिए फिर से इकट्ठा करें।
नोट: एसीोस्टोफोरेटिक कक्षों को एकल उपयोग के लिए निर्मित किया जाता है, लेकिन इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में यदि इसे ठीक से संभाला और साफ किया जाता है तो पुन: उपयोग किया जा सकता है।
Representative Results
जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है, एडब्ल्यूएस का उपयोग 12.4 x 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर एचसीसीएफ को स्पष्ट करने के लिए किया गया था, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है । फ़ीड पंप 3.5 एमएल/मिनट (5 एल/डे) के लिए सेट किया गया था, जो 10-20 एल संस्कृति के लिए प्रकल्पित उपयुक्त सीमा के भीतर एक सेल ब्लीड रेट का प्रतिनिधित्व करता है। जैसे ही एचसीसीएफ एडब्ल्यूएस चैंबर में प्रवेश किया, फीड टर्बिडिटी जांच से टर्बिडिटी माप लगातार बने रहे, लगभग 1,000-1100 एनटीयू, और प्रोब1 टर्बिडिटी जांच से माप लगभग 40-50 एनटीयू(चित्रा 8)बने रहे। दो माप, सेल हटाने दक्षता का उपयोग करना
गणना की गई और औसत 95% था। यह पाया गया कि 40-50 एनटीयू का एक टर्बिडिटी माप न्यूनतम टर्बिडिटी स्तर प्राप्त किया गया था और इस प्रकार श्रृंखला में एक अतिरिक्त एडब्ल्यूएस कक्ष से आगे कोई अलगाव व्यवहार्य नहीं था।
जबकि एडब्ल्यूएस कम प्रवाह दरों पर उच्च दक्षता के साथ अलग हो सकता है, चैंबर के भीतर एक लंबे समय के लिए HCCF रखने के कारण तापमान बढ़ जाती है, जो एक विचार होना चाहिए जब कम प्रवाह दरों का चयन । चित्र 9 एसी्टोलोफोरेटिक कक्ष में प्रवेश करने से पहले एचसीसीएफ के तापमान अंतर का एक उदाहरण है और 3.5 एमएल/न्यूनतम की फ़ीड प्रवाह दर पर ध्वनिक अलगाव के बाद, जिसने ध्वनिक कक्ष के भीतर लंबे समय के कारण तापमान में >6 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि दिखाई।
उच्च कोशिका घनत्व फसल (यानी, >20 x 106 कोशिकाओं/एमएल) को चलाते समय एक और महत्वपूर्ण विचार टर्बिडिटी जांच का संतृप्ति है । फ़ीड टर्बिडिटी जांच के लिए टर्बिडिटी माप 4,400 एनटीयू(चित्रा 10)पर संतृप्त हो गया, जिसके परिणामस्वरूप सेल हटाने दक्षता की गणना में कम अनुमान लगाया जा सकता है।
सेल स्पष्टीकरण पर विभिन्न फ़ीड दरों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, सेल हटाने दक्षता को विभिन्न फ़ीड दरों पर मापा गया था। जैसा कि चित्रा 11में दिखाया गया है, सेल हटाने की दक्षता ~100% से 57% तक काफी कम हो गई क्योंकि फ़ीड पंप दर बढ़ गई। सामान्य तौर पर, फ़ीड पंप दर जितनी धीमी होती है, सेल स्पष्टीकरण उतना ही बेहतर होता है। हालांकि, प्रत्येक आवेदन के लिए फ़ीड दर के अनुकूलन की सिफारिश की जाती है।
चित्रा 1: एडब्ल्यूएस सेटअप। एक बार पंप सॉफ्टवेयर(ए)के साथ चालू हो जाने केबाद, एचसीसीएफ को फीड टर्बिडिटी जांच (सी) के माध्यम से फीड टर्बिडिटी जांच(सी)के माध्यम से एडब्ल्यूएस चैंबर(डी)के माध्यम से मोड़ा गया था। कक्ष के अंदर, ध्वनिक बलों लहरों के नोड्स में प्रवाह से कोशिकाओं फंस गया और झुरमुट का कारण बना । कम उछाल के कारण कोशिकाओं को गुरुत्वाकर्षण बल के माध्यम से छोड़ दिया, और कोशिकाओं को एक उत्पाद फसल कीबोतल(जी)के लिए कक्ष के रिस रहा बंदरगाह के माध्यम से जांच 1 टर्बिडिटी जांच(सी)के लिए बाहर निकल गया, जबकि चरण 1 पंप(ई)के माध्यम से एसी्टोफोरेटिक चैंबर के अपशिष्ट बंदरगाह से हटा दिया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: एडब्ल्यूएस सिस्टम का पीछा। टर्बिडिटी जांच और कक्ष टर्बिडिटी प्रोब ईथरनेट(ए)और चैंबर पावर बीएनसी(बी)केबल के माध्यम से एडब्ल्यूएस सिस्टम के पीछे अपने-अपने बंदरगाहों से जुड़े हुए हैं। इसके अलावा, कंप्यूटर पीसी ईथरनेट केबल(सी)के माध्यम से जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: टर्बिडिटी जांच और आवास। प्रत्येक टर्बिडिटी जांच(ए)को संबंधित टर्बिडिटी मीटर और थर्मामीटर आवास(बी)में ठीक से डाला जाना चाहिए और शिकंजा के साथ कड़ा किया जाना चाहिए। चैंबर में पीजो ट्रांसड्यूसर तरल पदार्थ से भरे होने के बाद ही चैंबर पावर बीएनसी केबल(सी)को एसीओटोफोरेटिक चैंबर(डी)के पीछे से जोड़ा जाना चाहिए। जांच निम्नलिखित के रूप में इंगित की जाती है: एफ = फ़ीड टर्बिडिटी, 1 = प्रोब1 टर्बिडिटी, और 2, 3, और 4 अप्रयुक्त जांच हैं (या प्रक्रिया को क्रमबद्ध करने के लिए उपयोग किया जा सकता है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4: टर्बिडिटी आवास और एसीस्टोफोरेटिक चैंबर के बीच कनेक्शन। फीड ट्यूबिंग फीड पंप के माध्यम से फीड टर्बिडिटी पोर्ट(ए)के इनपुट से जुड़ा हुआ है। फीड टर्बिडिटी पोर्ट(बी)का आउटपुट वाई-ट्यूबिंग के माध्यम से एसीओटोफोरेटिक चैंबर(सी)के इनलेट बंदरगाहों से जुड़ा हुआ है। स्टेज 1 टयूबिंग को स्टेज1 पंप के माध्यम से एक सेल संग्रह पोत के माध्यम से एसीटोफारेटिक चैंबर(डी)के अपशिष्ट बंदरगाह से जोड़ा जाता है। एसीओटोफोरेटिक चैंबर(ई)का रिसता बंदरगाह प्रोब1 टर्बिडिटी पोर्ट(एफ)के इनपुट से जुड़ा हुआ है। हार्वेस्ट ट्यूबिंग प्रोब1 टर्बिडिटी पोर्ट (जी) से उत्पाद संग्रह पोत से जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: ध्वनिक विभाजक सॉफ्टवेयर में रीडिंग पैनल। कार्यक्रम में दो पैनल हैं,"रीडिंग"और"नियंत्रण"। 'रीडिंग'पैनल के भीतर, टर्बिडिटी(ए),तापमान(बी),और प्रतिशत कमी(सी)पर नजर रखी जाती है। डाटा रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए'स्टार्ट टेस्ट'बटन(डी)पर क्लिक करना होगा, जिससे बटन का रंग हरा हो जाएगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: कार्यक्रम में पैनल को नियंत्रित करता है। 'नियंत्रण' पैनल के भीतर,पंपोंको चालू या बंद किया जा सकता है, और पंपिंग की दर को फ़ीड(ए)और अन्य चरणों (बी) के लिए बदला जासकता है। इसके अलावा, पीजो ट्रांसड्यूसर पर चैंबर पावर को चालू या बंद(ग)चालू किया जा सकता है और स्लाइड बार(डी)के साथ बदला जा सकता है। प्रयोगों ने 10 डब्ल्यू का उपयोग किया, क्योंकि यह निर्माता द्वारा अनुशंसित चो कोशिकाओं के लिए अनुशंसित शक्ति सेटिंग है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: एडब्ल्यूएस चैंबर। एक बार कोशिकाओं कक्ष के अंदर थे, ध्वनिक बलों तरंगों के नोड्स में कोशिकाओं फंस गया और क्लस्टर (क) के लिए कोशिकाओं का कारण बना । ये सेल क्लस्टर आकार में वृद्धि हुई जब तक वे अपने उछाल खो दिया है और अंततः गुरुत्वाकर्षण बल (ख) द्वारा नीचे बसे । इसके बाद, बसे हुए कोशिकाओं को स्टेज 1 पंप के माध्यम से एसीटोफोरेटिक चैंबर के अपशिष्ट बंदरगाह से सेल हार्वेस्ट बोतल (सी) में हटा दिया गया। उत्पाद रिसते बंदरगाह (डी) के माध्यम से कक्ष से बाहर निकला जबकि एचसीसीएफ लगातार इनलेट बंदरगाहों (ई) के माध्यम से चैंबर भर दिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 8: ३.५ एमएल/मिनट की फीड पंप दर के साथ 12 x 106 सेल/एमएल चो सेल कल्चर के लिए टर्बिडिटी माप । फ़ीड टर्बिडिटी (नीला) लगभग 1,000 एनटीयू था और चरण से बाहर निकलने में 1 टर्बिडिटी मीटर (नारंगी) 40-60 एनटीयू था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 9: ३.५ एमएल/मिनट की फीड पंप दर के साथ 12 x 106 सेल/एमएल चो सेल कल्चर के लिए तापमान माप । फ़ीड तापमान (नीला) लगभग 21 डिग्री सेल्सियस था और चरण से बाहर निकलने में तर हो गया था 1 टर्बिडिटी मीटर (नारंगी) लगभग 27 डिग्री सेल्सियस था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 10: उच्च सेल घनत्व नमूने के लिए टर्बिडिटी माप उदाहरण। जब कोशिका घनत्व >20 x 106 कोशिकाओं/एमएल था, फ़ीड टर्बिडिटी माप ४,४०० NTU के अधिकतम मूल्य पर संतृप्त किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप सेल हटाने दक्षता का अनुमान ण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 11: सेल हटाने दक्षता तुलना। जैसे-जैसे फीड रेट बढ़ता गया, सेल सेपरेशन कम होता गया। इसलिए, जैसे-जैसे फ़ीड दर बढ़ी, सेल स्पष्टीकरण दक्षता में कमी आई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| प्राचल | विनिर्देश |
| प्रवाह दर | 0 - 10 L/h |
| प्रेशर रेंज | 0 - 2 बार (0 - 30 साई) |
| फ़ीड तरल पदार्थ तापमान | 0 - 40 डिग्री सेल्सियस (32 - 104 डिग्री एफ) |
| ऑपरेटिंग तापमान | 0 - 40 डिग्री सेल्सियस (32 - 104 डिग्री एफ) |
तालिका 1: ऑपरेटिंग स्थितियां। प्रवाह दर, दबाव सीमा, फ़ीड तरल पदार्थ, और ऑपरेटिंग तापमान के लिए एडब्ल्यूएस निर्माता से अनुशंसित ऑपरेटिंग स्थितियां।
Discussion
वर्णित एक सीएचई सेल लाइन के एचसीसीएफ से एक मॉडल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के प्राथमिक स्पष्टीकरण में बेंच-स्केल एडब्ल्यूएस के कार्यान्वयन के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल है। जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, प्राथमिक स्पष्टीकरण में एडब्ल्यूएस के उपयोग के परिणामस्वरूप प्रभावी सेल स्पष्टीकरण और उत्पाद वसूली हुई। इसके अलावा, रखरखाव और परिचालन आवश्यकताओं और पैमाने पर क्षमता के निम्न स्तर प्राथमिक स्पष्टीकरण में व्यापक आवेदन क्षमता की अनुमति देते हैं ।
महत्वपूर्ण बात, प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि कोशिकाओं के पृथक्करण के लिए फ़ीड पंप दर महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, टर्बिडिटी माप में उच्च सेल घनत्व का पता लगाने में सीमाओं के कारण, एडब्ल्यूएस सिस्टम का उपयोग करते समय कार्यशील सेल घनत्व पर विचार करने के लिए एक और कारक है। क्योंकि उच्च सेल घनत्व फ़ीड सामग्री चलाते समय टर्बिडिटी जांच संतृप्त हो जाएगी, इसलिए फ़ीड सामग्री के सेल घनत्व को मापकर सेल पृथक्करण दक्षता की गणना करना सबसे अच्छा हो सकता है और सेल संस्कृति द्रव को ऑफलाइन स्पष्ट किया जा सकता है। स्पष्टीकरण के सटीक ऑफ़लाइन माप के साथ, इन समस्याओं को हल करने में विचार किया जा सकता है कि एक प्रक्रिया रणनीति श्रृंखला में कई कक्षों का उपयोग करने के लिए है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल मुख्य रूप से एक कक्ष का उपयोग करने पर केंद्रित है, यह प्रणाली कोशिकाओं के अनुक्रमिक स्पष्टीकरण के लिए तीन अतिरिक्त कक्षों को संचालित कर सकती है जो कोशिकाओं की स्थिति को न्यूनतम रूप से प्रभावित कर सकती हैं और परिणामस्वरूप उच्च उत्पाद वसूली हो सकती है। इसके अलावा, अन्य मापदंडों, जैसे एडब्ल्यूएस के लिए पावर और सेल रिमूवल फ्लो रेट, विशिष्ट सेल प्रकार या ऑपरेशन के तरीके के लिए आगे अनुकूलित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, एडब्ल्यूएस के कार्यान्वयन से पहले इन विचारों का उपयोग करके ऑपरेशन मापदंडों और रणनीति का अनुकूलन करने की सिफारिश की जाती है।
कई अनुप्रयोग क्षमताओं में, निरंतर जैव प्रक्रिया में एडब्ल्यूएस का उपयोग आशाजनक है। क्योंकि एडब्ल्यूएस अपकेंद्रण की जगह ले सकता है और फिल्टर सतह क्षेत्र14को काफी कम कर सकता है, एडब्ल्यूएस के उपयोग से बाद में छानने वाले निस्पंदन और क्रोमेटोग्राफी प्रक्रियाओं के लिए सेल-मुक्त सामग्री का निरंतर प्रवाह संभव होगा जो निरंतर बायोमैन्यूफैक्चरिंग के साथ संगत हैं। इस अनुकूलता और उच्च सेल घनत्व के लिए परफ्यूजन तकनीक की उपलब्धता (उदाहरण के लिए, >50 x10 6 कोशिकाओं/एमएल) और लंबी संस्कृति अवधि (जैसे, >14 दिन), एडब्ल्यूएस में प्राथमिक स्पष्टीकरण के अलावा एक उपन्यास सतत सेल रक्तस्राव रणनीति विकसित करने की क्षमता है।
कुछ मामलों में, कोशिका ब्लीडिंग सामग्री15, 16में स्थिर-राज्य ऑपरेशन के दौरान उत्पादित प्रोटीन का 30% तक हटा दियाजाताहै। इसके अलावा, हटाए गए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को मानक काटा गया सामग्री के साथ एकत्र करने के लिए कुछ गुणवत्ता विशेषताओं को पूरा किया जाना चाहिए। जब इन विनिर्देशों को पूरा नहीं किया जाता है, तो परिणाम ऐसी सामग्री की अस्वीकृति हो सकती है जो उत्पाद उपज को प्रभावित कर सकती है। इस तरह के उत्पाद के नुकसान की भरपाई के लिए, एडब्ल्यूएस का उपयोग करके सेल ब्लीडिंग सामग्री का एक सतत स्पष्टीकरण दीर्घकालिक परफ्यूजन प्रक्रिया17के दौरान स्थिर-राज्य की स्थिति में लागू किया जा सकता है। इस रणनीति से खून सामग्री में उत्पाद हानि कम हो सकती है और उत्पादित प्रोटीन का अधिक उपयोग हो सकता है। इसके अलावा, एडब्ल्यूएस का उपयोग करके निरंतर स्पष्टीकरण के बाद कोशिकाओं को संभावित रूप से उच्च सेल घनत्व और उत्पादकता के लिए वांछित होने पर बायोरिएक्टर में वापस जोड़ा जा सकता है। इस प्रकार, एडब्ल्यूएस के साथ सेल ब्लीडिंग सामग्री का निरंतर स्पष्टीकरण किसी दी गई प्रक्रिया में उपज और/या कम माध्यमिक फिल्टर सतह क्षेत्र को कम करने का अवसर प्रदान कर सकता है ।
संक्षेप में, एडब्ल्यूएस की उपयोगिता सरल प्राथमिक स्पष्टीकरण तक सीमित नहीं है, लेकिन निरंतर बायोप्रोसेसिंग में अनुप्रयोगों के लिए उपयोगिता हो सकती है जो विनिर्माण दर और परिचालन लचीलेपन में सुधार कर सकती है।
Disclosures
लेखकों को इस पांडुलिपि में वर्णित उत्पादों में कोई वित्तीय हितों की है और खुलासा करने के लिए और कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक इस पांडुलिपि की रचनात्मक समीक्षा के लिए निलाउ सारा आर्डेन और झेंग झाओ को स्वीकार करना चाहेंगे । लेखक इस परियोजना के दौरान आवश्यक इनपुट के लिए लिंडसे ब्राउन का शुक्रिया भी अदा करना चाहेंगे। इस काम के लिए आंशिक आंतरिक वित्तपोषण और समर्थन सीडीआर क्रिटिकल पाथ प्रोग्राम (सीए #1-13) और सीडीईआर विनिर्माण विज्ञान, उत्कृष्टता कार्यक्रम के नवाचार केंद्र (Berilla-CoE-19-49) द्वारा प्रदान किया गया था । इस परियोजना के भाग में जैव प्रौद्योगिकी उत्पादों, अमेरिका के खाद्य और औषधि प्रशासन के कार्यालय में इंटर्नशिप/अनुसंधान भागीदारी कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, अमेरिका के ऊर्जा और एफडीए विभाग के बीच एक interagency समझौते के माध्यम से विज्ञान और शिक्षा के लिए ओक रिज संस्थान द्वारा प्रशासित ।
यह प्रकाशन लेखक के विचारों को दर्शाता है और एफडीए के विचारों या नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं लगाया जाना चाहिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acoustophorectic chamber | Pall | CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit | |
| ActiCHO P | GE | SH31025.01 | powder medium |
| AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
| Cadence Acoustic Separator Software | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4 | |
| CHO-K1 cells | VRC | VRC01 | |
| Computer | Dell | Latitude 3470 | Windows 7, 64 bit OS |
| Isopropanol (70%) | LabChem | LC157605 | 20L prepped 70% IPA |
| L-glutamine | Corning | 25-005-CV | 200 mM stock solution |
| Masterflex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
| Masterflex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
| Tubing set | Pall | CAS-FP-K1 Tubing set | |
| Turbidity probe | Pall | CAS-TS-S1 (60500106) |
References
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