Здесь мы вводим и описываем нерадиоактивный и неинвазивный метод оценки синтеза белка de novo in vivo, используя нематоды caenorhabditis elegans и восстановление флуоресценции после фотоблейлинга (FRAP). Этот метод можно комбинировать с генетическими и/или фармакологическими экранами для выявления новых модуляторов синтеза белка.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка показателей синтеза белка de novo в Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поддержание здорового протеома имеет важное значение для клеток и организма гомеостаза. Возмущение баланса между белково-трансляционным контролем и деградацией провоцирует множество возрастных заболеваний. Снижение механизмов контроля качества протеостаза является отличительной чертой старения. Биохимические методы обнаружения синтеза белка de novo по-прежнему ограничены, имеют ряд недостатков и не могут быть выполнены в живых клетках или животных. Caenorhabditis elegans, будучи прозрачным и легко генетически модифицированных, является отличной моделью для мониторинга темпов синтеза белка с помощью методов визуализации. Здесь мы представляем и описываем метод измерения синтеза белка de novo in vivo с использованием восстановления флуоресценции после фотоотливания (FRAP). Трансгенные животные, выражаюющие флуоресцентные белки в определенных клетках или тканях, облучаются мощным источником света, что приводит к фотоотбелу флуоресценции. В свою очередь, оценка восстановления флуоресценции означает новый синтез белка в клетках и/или тканях, представляющих интерес. Таким образом, сочетание трансгенных нематод, генетических и/или фармакологических вмешательств вместе с живой визуализацией скорости синтеза белка может пролить свет на механизмы, ососредуемые возрастной крах протеостаза.
Введение
Синтез и деградация белка имеет важное значение для организма гомеостаза. Множество возрастных заболеваний вызваны дефектным производством белка1,,2. Для того, чтобы измерить глобальные темпы перевода белка, Существуют биохимические методы, такие как рибосомное профилирование, которое включает в себя глубокое секвенирование рибосомно-защищенных фрагментов мРНК для мониторинга экспрессии, а такжесинтеза нового белка 3. Этот метод, помимо того, что он является косвенным считыванием переводческих ставок, поскольку увеличение ассоциации РНК с рибосомами не обязательно означает увеличение перевода, имеет технические недостатки, такие, как высокая стоимость и требование большого количества исходного материала. С другой стороны, методы, основанные на протеомике, позволяют напрямую количественно оценить белок путем метаболического профилирования импульса, за которымследует анализ масс-спектрометрии 4,,5. Однако это полуколичеспособный подход с ограниченным временным разрешением, который не может быть легко использован in vivo. Кроме того, маркировка белка может быть неравномерно распределена в животных / тканей, представляющих интерес. Важно отметить, что оба эти метода могут скрывать специфические или клеточные изменения в ставках перевода белка у целых животных или тканей, соответственно.
Caenorhabditis elegans является простой в использовании модель организма, который может быть выращен в больших количествах6. Кроме того, его генетическая подмена и прозрачность позволяют живую визуализацию в vivo. Этот протокол описывает методологию обнаружения показателей синтеза белка с помощью восстановления флуоресценции после фотоблейлинга (FRAP). Мы пользуемся трансгенной экспрессией флуоресцентных белков, либо во всем организме, либо в определенных тканях/клетках. Трансгенные животные могут либо выразить GFP с помощью промоутера гена, который широко / глобально выражается или ткани конкретных промоутер для целевых конкретных типов клеток. Этот метод может быть распространен на конкретного промоутера для изучения темпов синтеза белка конкретного белка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Как транскрипционные, так и трансляционные синтезы флюорофоров могут быть использованы для оценки перевода белка de novo в нескольких тканях. Скорость синтеза белка может быть оценена для нескольких белковых семейств, локализованных в различных клеточных отсеках, включая цитоплазму, митохондрии иядро 7. Следующие штаммы используются для мониторинга глобальных и нейронных темпов синтеза белка, N2; Ex«pife-2GFP, pRF4», ife-2 (ok306); Ex«pife-2GFP, pRF4», N2; Ex«punc-119GFP, pRF4», edc-3 (ok1427); Ex«punc-119GFP, pRF4», N2; Экс-psod-3GFP; pRF4
1. Поддержание, синхронизация и подготовка трансгенных нематод для мониторинга синтеза белка de novo
- Используйте рассечение стереомикроскопа для оценки стадий развития и роста дикого типа (wt) и трансгенных нематод мутантов.
- День 1: Используйте червя выбрать и передать 10 L4 личинок WT и мутант трансгенных животных, несущих желаемого флуоресцентного репортера на Nematode Рост СМИ (NGM) пластин, посеянных с Escherichia coli (OP50) (Таблица 1).
- Сделайте выбор червя путем прикреплять провод платины в конические конца стеклянной пипетки Pasteur путем плавления стекла на месте контакта на горелке Bunsen. Затем разровняйте конец платиновой проволоки в форму шпателя с помощью любого инструмента (например, клеща или легкого молотка).
- Привить одну колонию бактерий кишечной палочки (OP50) в колбу, содержащую 50 мл жидкой среды Luria-Bertani (LB) и расти в течение 10 часов при 37 градусах Цельсия в трясущемся инкубаторе (200 об/мин; Таблица 1). Затем, семена NGM пластин с 200 йл бактериальной культуры. Инкубировать семенами пластин при комнатной температуре на ночь, чтобы рост бактериального газона.
- Инкубировать и выращивать нематод при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию.
- День 5: Пластины содержат смешанную популяцию трансгенных червей. Выберите и перенесите 15 личинок L4 из каждой деформации на свежесеянные пластины OP50-NGM.
- День 6: Выполните анализ FRAP и контролировать скорость синтеза белка на 1 день взрослой жизни.
- Подготовка и использование циклохэксимида, содержащего ngM пластины в качестве положительного контроля:
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте стоковое раствор циклохексимида путем разбавления в воде до концентрации 10 мг/мл. Держите фондовый раствор на уровне 4 градусов по Цельсию.- Убейте бактерии, обнажая семенами пластин NGM в течение 15 минут с ультрафиолетовым светом (222 МК/см2 интенсивности).
- Добавьте циклохексимид поверх бактериальных семенных пластин до 500 мкг/мл окончательной концентрации в объеме агара.
- Разрешить пластины высохнуть при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Передача трансгенных нематод, выражающих psod-3GFP на транспортное средство и циклохэксимидсодержащие пластины.
- Инкубировать животных в течение 2 ч при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию.
2. FraP анализ с использованием трансгенных животных, выражаюющих соматическиеткани репортеров р ife-2GFPи р sod-3GFP
ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг глобальной скорости синтеза белка во всем теле животного. Эти транскрипционные репортеры представляют различные уровни выражения и повсеместно выражаются в нескольких соматических тканях, включая кишечник, глотку и мышцы стенок тела.
- Выберите и перенесите 1-дневных взрослых трансгенных животных на отдельные ngM пластины, посеянные с падением 20 йл OP50 в центре.
- Снимите крышку и поместите каждую пластину под 20-х объектив эпифлюоресценции микроскопа.
- Сосредоточьтесь и захватит эталонное изображение перед фотоотбелом (до отбеливателя).
- Photobleach каждый образец в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остановить фотоотбеливание, когда флуоресцентный сигнал угасает до 30 - 50% интенсивности по отношению к предварительному отбеливанию изображения. Интенсивность света и продолжительность периода отбеливания должны быть соответствующим образом скорректированы для конкретного флюорофора, стадии животного происхождения и клеток или тканей, которые находятся под обследованием. Следует экспериментально определить соответствующую продолжительность облучения, необходимую для достижения адекватной степени фотооблечивания, для различных образцов. - Захват изображения после фотоотбела (отбеливатель).
- Храните животных в отдельных пластинах NGM и дайте им восстановиться.
- Изображение и записывать восстановление каждого флуоресцентного репортера каждые 1 час, по крайней мере 6 часов на флуоресценции стереомикроскоп.
- Кроме того, выполните флуоресцентную оценку восстановления с помощью эпифлюоресцентного микроскопа (например, AxioImager No2).
- Тщательно оцените здоровье животных на одно животное, отслеживая их передвижение, сенсорную чувствительность, репродуктивную способность и выживание в течение следующих 3 дней. Нематоды с признаками повреждения после фотоблейинга были исключены из дальнейшего анализа.
3. Монтаж образцов и выполнить анализ FRAP с использованием трансгенных нематод, выражаюющих пан-нейронально цитоплазмической GFP, рunc-119GFP
ПРИМЕЧАНИЕ: Монитор пан-нейронального синтеза белка путем целевого фотоотчета в области головы, где нервное кольцо находится.
- Подготовка 2% агарозы колодки.
- Добавьте 10 мкл капли буфера M9 в центр агарозной площадки.
- Передача 5 трансгенных нематод, выражаюющих пан-нейронально цитоплазмический GFP в каплю буфера M9.
- Используйте ресницы для распространения жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные отображают уменьшенные движения в течение 2 минут из-за поглощения M9 в агар. - Изменение положения нематод, чтобы избежать перекрытия с помощью "ресницы" забрать.
- Поместите образец под 40-х объектив эпифлюоресценции микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте обложку. - Сосредоточьтесь и захватит эталонное изображение (до отбеливателя).
- Фотоотчет целевой области интереса в течение 90 секунд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остановить фотоотбеливание, когда флуоресцентный сигнал угасает до 30 - 50% интенсивности по отношению к предварительному отбеливанию изображения. Интенсивность света и продолжительность периода отбеливания должны быть соответствующим образом скорректированы для конкретного флюорофора, стадии животного происхождения и клеток или тканей, которые находятся под обследованием. Следует экспериментально определить соответствующую продолжительность облучения, необходимую для достижения адекватной степени фотооблечивания, для различных образцов. - Захват изображения после фотоотбела (отбеливатель).
- Добавьте 10 мкл капли буфера M9 на фотоотлив нематод.
- Пусть животные выздоравливают в течение 5 минут.
- Используйте "ресницы" забрать или пипетки для передачи нематод на отдельные пластины NGM посеяны с 20 йл OP50 падение в центре.
- Захват изображения каждого образца каждые 1 час под стереомикроскопом эпифлюоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Граф t'0 для времени восстановления после фотоотчета.
4. Анализ данных изображений, полученных во время анализа FRAP
- Проанализируйте приобретенные изображения с помощью программного обеспечения (например, Фиджи).
- Открытые изображения с программным обеспечением.
- Выберите команду Сплит-каналов через меню высадки изображений и цветов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите изображение зеленого канала. - Используйте инструмент Freehand Selection, чтобы вручную установить флуоресцентную область интереса (например, все тело, голову, кишечник).
- Выберите команду измерения с помощью меню «Анализ падения» для измерения означает интенсивность пикселей в области, интересной для каждой точки времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процент восстановления флуоресценции рассчитывается с помощью эталонных изображений, снятых после фотоотливания.
5. Отчетный статистический анализ
- Используйте по крайней мере 20 - 25 нематод каждого штамма и / или условие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Три биологические репликации должны быть выполнены. - Выполните тест студента t-(сравнение двух групп) или ANOVA (сравнение между несколькими группами) для статистического анализа с P lt; 0.05 как значительное использование программного обеспечения статистического анализа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя представленную здесь процедуру, для оценки скорости синтеза белка в соответствии с соответствующими протоколами использовались трансгенные нематоды дикого типа и мутантные нематоды, выражают следующие соматические репортеры, pife-2GFP, psod-3GFP и punc-119GFP. В частности, дикий тип и ife-2 мутантных червей, выражаюющих цитоплазмические GFP на протяжении всей их соматических тканей с помощью ife-2
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Модуляция синтеза белка имеет важное значение для организма гомеостаза. Во время старения, глобальный, а также специфический синтез белка возмущен. Недавние исследования показывают тот факт, что баланс перевода белка непосредственно контролирует старение и старение не просто побочный продукт процесса старения. В частности, основные компоненты механизма перевода, такие как эукариотический инициационный фактор 4E (eIF4E), который облегчает ограничение мРНК во время начала перевода, и, таким образом, скорость перевода белка...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих интересов.
Благодарности
Мы благодарим Чаниотакиса М. и Кунакиса К. за видеозапись и редактирование. К.П. финансируется за счет гранта Греческого фонда исследований и инноваций (HFRI) и Генерального секретариата по исследованиям и технологиям (GSRT). N.T. финансируется за счет грантов Европейского исследовательского совета (ERC - GA695190 - MANNA), Рамочной программы Европейской комиссии и Министерства образования Греции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Агар | Сигма-Олдрич | 5040 | |
| Агарозный | биозим | 8,40,004 | |
| Агарозные подушечки 2% | |||
| Дегидрат хлорида кальция (CaCl<суб>2?2H<суб>2O) | Сигма-Олдрич | C5080 | |
| Холестерин | SERVA Электрофорез | 17101.01 | |
| циклогексимид | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Препарирующий стереомикроскоп | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Содержать животных при температуре 20 градусов; | |
| C Эпифлуоресцентный микроскоп | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 штамм | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Флуоресцентный препарирующий стереомикроскоп | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Чашки Грайнера Петри (60 x 15 мм) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4] | Тавернаракис | Содержание животных при температуре 20 градусов; Программное | |
| обеспечение для анализа изображений | Фиджи | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| фунта жидкая среда | |||
| M9 буфер | |||
| Сульфат магния (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Предметные стекла для микроскопа (75 x 25 x 1 мм) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Пакет программного обеспечения Excel | Microsoft Corporation, Redmond, США | ||
| N2; Ex[pife-2GFP; pRF4]Лаборатория | Тавернаракис | Содержание животных при температуре 20 градусов; C | |
| N2; Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Содержание животных при температуре 20 °deg; C | |
| N2; Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Содержание животных при температуре 20 градусов; C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Нематода питательная среда (NGM) агаровые пластины | |||
| Нистатин стоковый раствор | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Пептон | BD, Bacto | 211677 | |
| Фосфатный буфер | |||
| Хлорид натрия (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Стандартное оборудование для приготовления агаровых пластин (автоклав, чашки Петри и т.д.) | |||
| Стандартное оборудование для содержания червей (пикер из платиновой проволоки, инкубаторы и т.д.). | |||
| обеспечение для статистического анализа | GraphPad Software Inc., Сан-Диего, США | Программное обеспечение GraphPad Prism Пакет программного обеспечения | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Червячный кирка |
Ссылки
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547(2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823(2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648(2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
