Summary
Здесь мы вводим и описываем нерадиоактивный и неинвазивный метод оценки синтеза белка de novo in vivo, используя нематоды caenorhabditis elegans и восстановление флуоресценции после фотоблейлинга (FRAP). Этот метод можно комбинировать с генетическими и/или фармакологическими экранами для выявления новых модуляторов синтеза белка.
Abstract
Поддержание здорового протеома имеет важное значение для клеток и организма гомеостаза. Возмущение баланса между белково-трансляционным контролем и деградацией провоцирует множество возрастных заболеваний. Снижение механизмов контроля качества протеостаза является отличительной чертой старения. Биохимические методы обнаружения синтеза белка de novo по-прежнему ограничены, имеют ряд недостатков и не могут быть выполнены в живых клетках или животных. Caenorhabditis elegans, будучи прозрачным и легко генетически модифицированных, является отличной моделью для мониторинга темпов синтеза белка с помощью методов визуализации. Здесь мы представляем и описываем метод измерения синтеза белка de novo in vivo с использованием восстановления флуоресценции после фотоотливания (FRAP). Трансгенные животные, выражаюющие флуоресцентные белки в определенных клетках или тканях, облучаются мощным источником света, что приводит к фотоотбелу флуоресценции. В свою очередь, оценка восстановления флуоресценции означает новый синтез белка в клетках и/или тканях, представляющих интерес. Таким образом, сочетание трансгенных нематод, генетических и/или фармакологических вмешательств вместе с живой визуализацией скорости синтеза белка может пролить свет на механизмы, ососредуемые возрастной крах протеостаза.
Introduction
Синтез и деградация белка имеет важное значение для организма гомеостаза. Множество возрастных заболеваний вызваны дефектным производством белка1,,2. Для того, чтобы измерить глобальные темпы перевода белка, Существуют биохимические методы, такие как рибосомное профилирование, которое включает в себя глубокое секвенирование рибосомно-защищенных фрагментов мРНК для мониторинга экспрессии, а такжесинтеза нового белка 3. Этот метод, помимо того, что он является косвенным считыванием переводческих ставок, поскольку увеличение ассоциации РНК с рибосомами не обязательно означает увеличение перевода, имеет технические недостатки, такие, как высокая стоимость и требование большого количества исходного материала. С другой стороны, методы, основанные на протеомике, позволяют напрямую количественно оценить белок путем метаболического профилирования импульса, за которымследует анализ масс-спектрометрии 4,,5. Однако это полуколичеспособный подход с ограниченным временным разрешением, который не может быть легко использован in vivo. Кроме того, маркировка белка может быть неравномерно распределена в животных / тканей, представляющих интерес. Важно отметить, что оба эти метода могут скрывать специфические или клеточные изменения в ставках перевода белка у целых животных или тканей, соответственно.
Caenorhabditis elegans является простой в использовании модель организма, который может быть выращен в больших количествах6. Кроме того, его генетическая подмена и прозрачность позволяют живую визуализацию в vivo. Этот протокол описывает методологию обнаружения показателей синтеза белка с помощью восстановления флуоресценции после фотоблейлинга (FRAP). Мы пользуемся трансгенной экспрессией флуоресцентных белков, либо во всем организме, либо в определенных тканях/клетках. Трансгенные животные могут либо выразить GFP с помощью промоутера гена, который широко / глобально выражается или ткани конкретных промоутер для целевых конкретных типов клеток. Этот метод может быть распространен на конкретного промоутера для изучения темпов синтеза белка конкретного белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Как транскрипционные, так и трансляционные синтезы флюорофоров могут быть использованы для оценки перевода белка de novo в нескольких тканях. Скорость синтеза белка может быть оценена для нескольких белковых семейств, локализованных в различных клеточных отсеках, включая цитоплазму, митохондрии иядро 7. Следующие штаммы используются для мониторинга глобальных и нейронных темпов синтеза белка, N2; Ex«pife-2GFP, pRF4», ife-2 (ok306); Ex«pife-2GFP, pRF4», N2; Ex«punc-119GFP, pRF4», edc-3 (ok1427); Ex«punc-119GFP, pRF4», N2; Экс-psod-3GFP; pRF4
1. Поддержание, синхронизация и подготовка трансгенных нематод для мониторинга синтеза белка de novo
- Используйте рассечение стереомикроскопа для оценки стадий развития и роста дикого типа (wt) и трансгенных нематод мутантов.
- День 1: Используйте червя выбрать и передать 10 L4 личинок WT и мутант трансгенных животных, несущих желаемого флуоресцентного репортера на Nematode Рост СМИ (NGM) пластин, посеянных с Escherichia coli (OP50) (Таблица 1).
- Сделайте выбор червя путем прикреплять провод платины в конические конца стеклянной пипетки Pasteur путем плавления стекла на месте контакта на горелке Bunsen. Затем разровняйте конец платиновой проволоки в форму шпателя с помощью любого инструмента (например, клеща или легкого молотка).
- Привить одну колонию бактерий кишечной палочки (OP50) в колбу, содержащую 50 мл жидкой среды Luria-Bertani (LB) и расти в течение 10 часов при 37 градусах Цельсия в трясущемся инкубаторе (200 об/мин; Таблица 1). Затем, семена NGM пластин с 200 йл бактериальной культуры. Инкубировать семенами пластин при комнатной температуре на ночь, чтобы рост бактериального газона.
- Инкубировать и выращивать нематод при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию.
- День 5: Пластины содержат смешанную популяцию трансгенных червей. Выберите и перенесите 15 личинок L4 из каждой деформации на свежесеянные пластины OP50-NGM.
- День 6: Выполните анализ FRAP и контролировать скорость синтеза белка на 1 день взрослой жизни.
- Подготовка и использование циклохэксимида, содержащего ngM пластины в качестве положительного контроля:
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте стоковое раствор циклохексимида путем разбавления в воде до концентрации 10 мг/мл. Держите фондовый раствор на уровне 4 градусов по Цельсию.- Убейте бактерии, обнажая семенами пластин NGM в течение 15 минут с ультрафиолетовым светом (222 МК/см2 интенсивности).
- Добавьте циклохексимид поверх бактериальных семенных пластин до 500 мкг/мл окончательной концентрации в объеме агара.
- Разрешить пластины высохнуть при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Передача трансгенных нематод, выражающих psod-3GFP на транспортное средство и циклохэксимидсодержащие пластины.
- Инкубировать животных в течение 2 ч при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию.
2. FraP анализ с использованием трансгенных животных, выражаюющих соматическиеткани репортеров р ife-2GFPи р sod-3GFP
ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг глобальной скорости синтеза белка во всем теле животного. Эти транскрипционные репортеры представляют различные уровни выражения и повсеместно выражаются в нескольких соматических тканях, включая кишечник, глотку и мышцы стенок тела.
- Выберите и перенесите 1-дневных взрослых трансгенных животных на отдельные ngM пластины, посеянные с падением 20 йл OP50 в центре.
- Снимите крышку и поместите каждую пластину под 20-х объектив эпифлюоресценции микроскопа.
- Сосредоточьтесь и захватит эталонное изображение перед фотоотбелом (до отбеливателя).
- Photobleach каждый образец в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остановить фотоотбеливание, когда флуоресцентный сигнал угасает до 30 - 50% интенсивности по отношению к предварительному отбеливанию изображения. Интенсивность света и продолжительность периода отбеливания должны быть соответствующим образом скорректированы для конкретного флюорофора, стадии животного происхождения и клеток или тканей, которые находятся под обследованием. Следует экспериментально определить соответствующую продолжительность облучения, необходимую для достижения адекватной степени фотооблечивания, для различных образцов. - Захват изображения после фотоотбела (отбеливатель).
- Храните животных в отдельных пластинах NGM и дайте им восстановиться.
- Изображение и записывать восстановление каждого флуоресцентного репортера каждые 1 час, по крайней мере 6 часов на флуоресценции стереомикроскоп.
- Кроме того, выполните флуоресцентную оценку восстановления с помощью эпифлюоресцентного микроскопа (например, AxioImager No2).
- Тщательно оцените здоровье животных на одно животное, отслеживая их передвижение, сенсорную чувствительность, репродуктивную способность и выживание в течение следующих 3 дней. Нематоды с признаками повреждения после фотоблейинга были исключены из дальнейшего анализа.
3. Монтаж образцов и выполнить анализ FRAP с использованием трансгенных нематод, выражаюющих пан-нейронально цитоплазмической GFP, рunc-119GFP
ПРИМЕЧАНИЕ: Монитор пан-нейронального синтеза белка путем целевого фотоотчета в области головы, где нервное кольцо находится.
- Подготовка 2% агарозы колодки.
- Добавьте 10 мкл капли буфера M9 в центр агарозной площадки.
- Передача 5 трансгенных нематод, выражаюющих пан-нейронально цитоплазмический GFP в каплю буфера M9.
- Используйте ресницы для распространения жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные отображают уменьшенные движения в течение 2 минут из-за поглощения M9 в агар. - Изменение положения нематод, чтобы избежать перекрытия с помощью "ресницы" забрать.
- Поместите образец под 40-х объектив эпифлюоресценции микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте обложку. - Сосредоточьтесь и захватит эталонное изображение (до отбеливателя).
- Фотоотчет целевой области интереса в течение 90 секунд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остановить фотоотбеливание, когда флуоресцентный сигнал угасает до 30 - 50% интенсивности по отношению к предварительному отбеливанию изображения. Интенсивность света и продолжительность периода отбеливания должны быть соответствующим образом скорректированы для конкретного флюорофора, стадии животного происхождения и клеток или тканей, которые находятся под обследованием. Следует экспериментально определить соответствующую продолжительность облучения, необходимую для достижения адекватной степени фотооблечивания, для различных образцов. - Захват изображения после фотоотбела (отбеливатель).
- Добавьте 10 мкл капли буфера M9 на фотоотлив нематод.
- Пусть животные выздоравливают в течение 5 минут.
- Используйте "ресницы" забрать или пипетки для передачи нематод на отдельные пластины NGM посеяны с 20 йл OP50 падение в центре.
- Захват изображения каждого образца каждые 1 час под стереомикроскопом эпифлюоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Граф t'0 для времени восстановления после фотоотчета.
4. Анализ данных изображений, полученных во время анализа FRAP
- Проанализируйте приобретенные изображения с помощью программного обеспечения (например, Фиджи).
- Открытые изображения с программным обеспечением.
- Выберите команду Сплит-каналов через меню высадки изображений и цветов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите изображение зеленого канала. - Используйте инструмент Freehand Selection, чтобы вручную установить флуоресцентную область интереса (например, все тело, голову, кишечник).
- Выберите команду измерения с помощью меню «Анализ падения» для измерения означает интенсивность пикселей в области, интересной для каждой точки времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процент восстановления флуоресценции рассчитывается с помощью эталонных изображений, снятых после фотоотливания.
5. Отчетный статистический анализ
- Используйте по крайней мере 20 - 25 нематод каждого штамма и / или условие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Три биологические репликации должны быть выполнены. - Выполните тест студента t-(сравнение двух групп) или ANOVA (сравнение между несколькими группами) для статистического анализа с P lt; 0.05 как значительное использование программного обеспечения статистического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя представленную здесь процедуру, для оценки скорости синтеза белка в соответствии с соответствующими протоколами использовались трансгенные нематоды дикого типа и мутантные нематоды, выражают следующие соматические репортеры, pife-2GFP, psod-3GFP и punc-119GFP. В частности, дикий тип и ife-2 мутантных червей, выражаюющих цитоплазмические GFP на протяжении всей их соматических тканей с помощью ife-2 промоутер были сравнены раньше, сразу после фотоотверга и 5 часов после восстановления. Репрезентативные изображения и количественная оценка показывают, что животные дикого типа полностью восстанавливаются, в то время как мутанты ife-2 уменьшили способность квосстановлению (рисунок 1A). Таким образом, черви дикого типа инициируют биосинтез белка de novo после фотоблейинга, в то время как черви, не имеющие фактора инициации перевода мРНК IFE-2, не в состояниисделать это,указывая, что скорость восстановления флуоресценции иллюстрирует скорость синтеза белка in vivo 7 . Кроме того, циклохэксимид, специфический ингибитор перевода мРНК, может быть использован в качестве положительного контроля для ингибирования перевода белка. Действительно, циклохэксимид обработанных трансгенных животных, выражаюющих цитоплазмические GFP под sod-3 промоутер, не восстановить их флуоресценции при фотоблехинге (Рисунок 1B).
Мы также применили этот метод, чтобы определить, как органы обработки мРНК (P органов) влияют на скорость переводабелка 8. Дикий тип и edc-3(ok1427) мутант нематод, выражаюх GFP пан-нейронально были рассмотрены на их способность к восстановлению на целевых фотоотверга в области головы. Восстановление флуоресценции гораздо медленнее у EDC-3 дефицитных животных по сравнению с диким типом(рисунок 1C). Это указывает на то, что EDC-3-опосредованная оборот мРНК препятствует синтезу новых белков и в конечном итоге подавляет инициирование переводабелка 9.
Рисунок 1: In vivo оценка синтеза белка de novo в C. elegans. (A) АНАЛИЗ FRAP как в диком типе, так и в IFE-2 с недостаточными нематодами, выражают цитоплазмический GFP под протератом ife-2. Трансгенные животные подвергаются фотоотечению всего животного. Сигнал GFP уменьшается до 30-50% от начальной интенсивности. Флуоресценция записывается до фотоотбела (до отбеливателя), после окончания периода фотоотбеливания (10 мин; отбеливатель) и 5 часов после восстановления. (B)Лечение циклохексимида препятствует восстановлению флуоресценции трансгенных животных, выражаюющих цитоплазмический GFP под пропагандой сода-3. Трансгенные животные подвергаются фотоотечению целых животных. Сигнал GFP уменьшается до 30-50% от начальной интенсивности. Флуоресценция записывается перед фотоотбелом (до отбеливания), после окончания периода фотоотбелки (10 мин; отбеливатель) и 5 часов после восстановления (A, B: AxioImager No2 микроскоп; объектив: 20x, численная диафрагма 0.8; источник света высокой мощности, HBO 100; 100 Вт ртутной дуги лампы; возбуждение / выбросов фильтр наборы, Зейс Set 38 Endow GFP сдвиг бесплатно). Шкала баров, 500 мкм. (C) EDC-3 недостаточно нематод дисплей снизился де Ново скорость синтеза белка в нейрональных клетках. Сигнал флуоресценции как дикого типа, так и edc-3(ok1427) животных, выражаюющих пан-нейронально цитоплазмический GFP измеряется до фотоотбела (до отбеливателя), а также после периода фотоотбеливания (90 сек; отбеливатель). Трансгенные животные подвергаются фотоотвергам в области головы (нервное кольцо). Сигнал GFP уменьшается до 30-50% от начальной интенсивности (AxioImager No2; объектив: 40x, численная диафрагма 0.75; 30% люминесцентная мощность источника люминесцентного освещения (FI система освещения X-Cite 120 XL FL PC, 120W металлическая галогенидная лампа) и полностью открытая радужная оболочка). Средняя интенсивность пикселей восстановления флуоресценции измеряется с интервалом в один час. 20 животных были количественно на штамм в каждом из трех независимых экспериментов. Данные представляют собой среднее S.E.M., q P lt; 0.05, неоплаченный т-тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Реагента | Рецепт | |
| 2% Подушечки Агарозы | 1. Взвешивание 0,5 г фагерозы в цилиндрическом стакане | |
| 2. Добавить 25 мл буфера M9 | ||
| 3. Нагрейте в микроволновой печи до кипения. Вытащить, перемешать кончиком пипетки и снова закипеть. Повторяйте, пока агароза не растворится. | ||
| 4. Поместите пустой слайд микроскопа на скамейке. | ||
| 5. Положите каплю (50 мкл) свежего 2% раствора агарозы в середине слайда. | ||
| 6. Возьмите второй слайд микроскопа и поместите его на вершине капли агарозы. Аккуратно нажмите вниз, чтобы сгладить падение. | ||
| 7. Пусть агароза затвердеет в течение 30 секунд и аккуратно удалить верхний слайд микроскопа. | ||
| 8. Немедленно приступить к подготовке образца, так как агарозные прокладки начнут высыхать в течение примерно 5 минут. | ||
| Совет: Оставьте верхний слайд микроскопа в качестве крышки, чтобы сохранить влажность дольше (1 час). Таким образом, несколько агарозных колодок могут быть подготовлены и использованы быстро во время экспериментов. | ||
| LB жидкая среда | 1. Растворите 10 г бактотриптона, 5 г экстракта дрожжей Bacto, 5 г NaCl в 1 л дистиллированной воды и автоклава. | |
| Буфер M9 | 1. Растворите 3 г KH2PO4, 6 г Na2HPO4, и 5 г NaCl в 1 л дистиллированной воды и автоклава. | |
| 2. Дайте остыть и добавьте 1 мл 1 МГСО4 (стерильный). | ||
| 3. Храните буфер M9 при 4 градусах Цельсия. | ||
| Нематод среднего роста (NGM) агар пластин | 1. Смешайте 3 г NaCl, 2,5 г бактопептона, 0,2 г стрептомицина, 17 г агара и добавьте 900 мл дистиллированной воды. Автоклаве. | |
| 2. Дайте остыть до 55-60 градусов по Цельсию. | ||
| 3. Добавить 1 мл раствора холестеринового бульона, 1 мл 1 M CaCl2, 1 мл 1 M MgSO 4 ,1мл раствора нестатина, 25 мл стерильного 1 М фосфатного буфера, рН 6.0, и дистиллированной стерильной воды до 1 л. | ||
| 4. Pipette 10 мл среднего на чашку Петри и оставить для затвердеть. | ||
| 5. Храните тарелки при 4 градусов по Цельсию до тех пор, пока они не будут использованы. | ||
Таблица 1: Рекомендуемые рецепты используемых реагентов. Здесь изложены все рецепты реагентов, используемые в представленном протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модуляция синтеза белка имеет важное значение для организма гомеостаза. Во время старения, глобальный, а также специфический синтез белка возмущен. Недавние исследования показывают тот факт, что баланс перевода белка непосредственно контролирует старение и старение не просто побочный продукт процесса старения. В частности, основные компоненты механизма перевода, такие как эукариотический инициационный фактор 4E (eIF4E), который облегчает ограничение мРНК во время начала перевода, и, таким образом, скорость перевода белка, зависящего от ограничения, вызывает окислительный стресс и ускоряет процессстарения 1. Кроме того, нейрон-специфический EDC-3, который взаимодействует с органами обработки мРНК, P органов и увеличивает скорость мРНК decapping, также ускоряет процессстарения 8. В частности, подавление EDC-3 позволяет секвестр IFE-2 в P органов, в конечном счете, снижение уровня перевода белка, задержки нейрональногостарения 9.
FRAP это метод, первоначально разработанный для исследования динамики белка, локализации, взаимодействия и активности с неинвазивными флуоресцентными пометками с использованием живой визуализации in vivo, что делает его мощным инструментом для изучения показателей синтеза белка в режимереального времени 8,10. Тем не менее, есть определенные критические шаги, которые требуют внимания и устранения неполадок. Мы предоставляем альтернативные решения этих потенциальных препятствий или ограничений, с которыми мы столкнулись в ходе экспериментальной процедуры.
Один вопрос касается червя движения, как червь может избежать источника света во время фотоотливания. Этот вопрос может быть частично преодолен с помощью трансгенных животных, выражаюющих аллель rol-6(su1006), который заставляет животных двигаться в синуситной манере. Таким образом, фотоотлив животных может выполняться непрерывно. Кроме того, экспериментатор может следить за движением червя, который движется за пределами плоскости зрения гораздо медленнее. Тем не менее, агар колодки также могут быть использованы в качестве альтернативы полностью обездвижить животных.
Оптимальная продолжительность фотоблейинга является дополнительным критическим фактором, который должен быть определен и стабилен на протяжении всех экспериментов. Недостаточное фотоотлив из-за нецелесочетаемого фотоотверга или короткой продолжительности можно столкнуться. Это может быть превзойдено за счет увеличения а) цели увеличения и численного диафрагмы, b) интенсивности света и/или (с) продолжительности фотоотчета.
Если не обнаружено значительного восстановления флуоресценции, есть потенциальные параметры, которые могут быть изменены. Если фотоотлив является чрезмерным, уменьшить продолжительность фотоотливания, как образец повреждения произошло. Ущерб червю можно оценить, наблюдая за такими чертами жизни, как сенсорная чувствительность, передвижение, откладывание яиц, фарингальная накачка и репродуктивная способность. Если кинетики восстановления перевода белка медленно, позволяют более длительный период восстановления. Восстановление синтеза белка варьируется между различными семьями белков и зависит от репортера слияний длиной7.
Промоутерская активность может влиять на кинетику синтеза белка. Если промоутер неактивен во время восстановления, измените используемого промоутера. Промоутерская деятельность может быть изменена при стрессовых условиях, таких как фотодемаж. Используйте стабильные промоутеры активности для мониторинга либо глобальных (например, let-858, ife-2, sod-3), либо тканевых(например, мышц стенок тела; мио-3, unc-54; глотка: мио-2; пан-нейрональный: unc-119, раб-3; механосензорные нейроны: mec-4; кишечник: vha-6, ges-1) скорость перевода белка.
Если происходит неадекватное ингибирование перевода белка циклохексимидом, увеличение времени до инкубации нематод позволит преодолеть эту проблему. Предостережение, которое следует принимать во внимание, это использование трансгенных червей, переэкспрессивных белков. Использование трансгенных нематод, генерируемых CRISPR/Cas9, выражаюющих флуоресцентные помеченные белки, представляющие интерес на физиологических уровнях, обеспечит более точную картину кинетики белка и оборота.
Обнаруженные общие уровни белка являются результатом деградации белка и темпов синтеза. Деградация белка неизменно происходит на базальных уровнях во всех эукариотических клетках. Таким образом, темпы восстановления флуоресценции белка, которые измеряются в этом протоколе, не являются абсолютными, но по сравнению с условиями, сравниваемыми. По сути, измеряется восстановление флуоресценции при наличии деградации белка. Таким образом, предполагается, что все условия имеют равные темпы деградации белка после фотоблейкинга. Для измерения абсолютных показателей перевода белка следует использовать штаммы мутантных червей, не хватает белка. В частности, мутации в генах, таких как rpn-10 протеасомы или lgg-2 для аутофагии могут быть использованы в качестве контроля11. Кроме того, РНК нокдаун протеасомных и аутофагических белков могут быть выполнены. Кроме того, аутофагические субстраты, такие как S'ST-1:GFP, могут быть использованы для обнаружения вклада аутофагии деградации в экспериментальныхусловиях, выбранных 12.
В обоих экспериментальных условиях, этот метод FRAP является нерадиоактивной, неинвазивной, которая обнаруживает скорость синтеза белка de novo in vivo в различных тканях C. elegans. Это позволяет живую визуализацию до и во время фотоотчивания в настройках in vivo и последующего мониторинга животных в течение всей их жизни. Возмущение инициации перевода замедляет старение, поэтому измерение глобальных показателей синтеза белка FRAP может быть использовано в качестве прямого считывания процесса старения. Этот протокол может быть оптимизирован и использован в более широком масштабе для проверки генов и/или химических веществ, связанных с процессом старения или возрастными заболеваниями. Кроме того, общие или конкретные темпы деградации белка могут быть измерены путем фотоотбивания под разным генетическим фоном с использованием одного и того же протокола в сочетании с циклохексимидом. Поскольку перевод белка тормозится циклохексимидом, скорость деградации белка будет обнаружена. Этот протокол поможет лучше понять пути деградации белка в генетических моделях заболеваний агрегации белка13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Чаниотакиса М. и Кунакиса К. за видеозапись и редактирование. К.П. финансируется за счет гранта Греческого фонда исследований и инноваций (HFRI) и Генерального секретариата по исследованиям и технологиям (GSRT). N.T. финансируется за счет грантов Европейского исследовательского совета (ERC - GA695190 - MANNA), Рамочной программы Европейской комиссии и Министерства образования Греции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
