Summary
在这里，我们介绍和描述一种非放射性和非侵入性的方法，以评估体内的去新蛋白合成，利用线虫 卡诺 哈布迪炎和荧光漂白后恢复（FRAP）。该方法可与遗传和/或药理学屏幕相结合，识别蛋白质合成的新调制器。
Abstract
保持健康的蛋白质组对细胞和有机体平衡至关重要。蛋白质转化控制和降解之间的平衡的扰动引发了许多与年龄相关的疾病。蛋白位虫质量控制机制的减少是老龄化的一个标志。检测新蛋白合成的生化方法仍然有限，有几个缺点，不能在活细胞或动物中进行。 卡诺哈布迪蒂斯，透明 和容易转基因，是一个极好的模型，以监测蛋白质合成率使用成像技术。在这里，我们介绍并描述了一种利用光漂白后荧光回收（FRAP）测量体内新蛋白合成的方法。在特定细胞或组织中表达荧光蛋白的转基因动物被强大的光源照射，从而产生荧光光漂白。反过来，荧光恢复的评估意味着新的蛋白质合成在细胞和/或组织感兴趣。因此，将转基因线虫、遗传和/或药理干预与蛋白质合成率的活成像相结合，可以揭示调解年龄依赖性蛋白酶崩溃的机制。
Introduction
蛋白质的合成和降解对于有机体平衡至关重要。许多与年龄相关的疾病是由有缺陷的蛋白质生产1，2,引起的。为了测量全球蛋白质的转化率，有生化技术，如核糖体分析，其中包括核糖体保护mRNA片段的深度测序，以监测表达以及新的蛋白质合成3。这种方法除了间接读出转化率外，因为增加RNA与核糖体的关联并不一定意味着翻译增加，因此具有技术缺点，例如成本高和大量起始材料的需求。另一方面，基于蛋白质组学的方法允许通过脉冲代谢分析直接蛋白质定量，然后进行质谱分析4，5。,5然而，这是一种半定量方法，具有有限的时间分辨率，在体内不容易使用。此外，蛋白质的标签可以在感兴趣的动物/组织中不均匀分布。重要的是，这两种方法可以分别隐藏整个动物或组织中蛋白质转化率的组织特异性或细胞特异性变异。
卡诺哈布迪蒂斯埃利 根是一种易于使用的模型生物体，可以大量生长6。此外，其遗传的适用性和透明度允许在体内进行活成像。该协议描述了光漂白（FRAP）后使用荧光回收检测蛋白质合成率的方法。我们利用荧光蛋白的转基因表达，无论是整个生物体还是特定的组织/细胞。转基因动物可以使用基因的启动子表达GP，该基因被广泛/全球表达，或者使用组织特异性启动子来靶向特定细胞类型。此技术可以扩展到特定启动子，以检查特定蛋白质的蛋白质合成率。
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Protocol
注：对荧光团的转录和转化融合都可用于评估多个组织中的诺沃蛋白转化。蛋白质合成率可以评估多个蛋白质家族，本地化在不同的细胞隔间，包括细胞质，线粒体和核7。以下菌株用于监测全球和神经元蛋白合成率，N2;Ex[pife-2GFP， pRF4]， ife-2 （ok306）;Ex[pife-2GFP， pRF4]， N2;Ex[punc-119GFP， pRF4]， edc-3 （ok1427）;Ex[punc-119GFP, pRF4], N2;Ex[psod-3Gfp; prf4]
1. 转基因线虫的维护、同步和制备，用于监测新蛋白合成
- 使用解剖立体显微镜评估野生型（wt）和突变转基因线虫的发育阶段和生长。
- 第1天：使用蠕虫采摘选择并转移10L4幼虫的wt和突变转基因动物携带所需的荧光报告器到线虫生长介质（NGM）板种子与Escherichia大肠杆菌（OP50）（表1）。
- 通过将 Bunsen 燃烧器接触现场的玻璃熔化，将铂丝连接到玻璃巴斯德移液器的锥形端，进行蠕虫采摘。然后，使用任何工具（例如钳子或轻锤），将铂丝的端部分平展成铲子形状。
- 将大肠杆菌（OP50）E. coli的单个菌群接种到含有50 mL的Luria-Bertani（LB）液体介质的烧瓶中，在37°C的摇床（200 rpm;表 1.然后，用200μL的细菌培养剂播种NGM板。在室温下孵育种子板过夜，使细菌草坪生长。
- 在20°C的标准温度下孵育和生长线虫。
- 第5天：板块中含有转基因蠕虫的混合种群。在新鲜种子OP50-NGM盘上选择并转移每种菌株的15个L4幼虫。
- 第6天：在成年的第1天进行FRAP测定并监测蛋白质合成率。
- 准备和使用含有NGM板的环氧胺作为正控：
注：在水中稀释至浓度为10mg/mL，准备环氧酰胺的库存溶液。将库存溶液保持在 4 °C。- 通过暴露种子的NGM板15分钟与紫外线（222 μW/厘米2强度）杀死 细菌。
- 在细菌种子板上加入环氧胺，在总和量中达到500微克/mL的最终浓度。
- 让板在室温下干燥 30 分钟。
- 转移转基因线虫，在车辆和含环氧胺的板上表达psod-3GFP。
- 在20°C的标准温度下孵育动物2小时。
2. 使用转基因动物表达躯体组织记者 pife-2 Gfp和 psod -3 Gfp 的Frap 测定
注：监测整个动物体内的全球蛋白质合成率。这些转录记者呈现不同的表达水平，并无处不在地表达在多个躯体组织，包括肠道，咽和体壁肌肉。
- 挑选并转移1天成人转基因动物到个别NGM板种子与20μL OP50下降的中心。
- 取下盖子，将每个板放在荧光显微镜的 20 倍客观透镜下。
- 在光漂白（预漂白）之前对参考图像进行对焦和捕获。
- 光漂白每个样品10分钟。
注：当荧光信号淬火至 30 ~ 50% 的强度时，停止光漂白。根据被检查的特定荧光团、动物阶段和细胞或组织，应相应地调整光强度和漂白周期的持续时间。对于不同的试样，需要适当的辐照持续时间，以达到足够的光漂白程度。 - 光漂白（漂白）后捕获图像。
- 将动物放在单独的NGM盘子中，让它们恢复。
- 在荧光立体显微镜下，每1小时成像并记录每个荧光测量仪的恢复情况，至少6小时。
- 或者，使用荧光显微镜（例如，AxioImager Z2）进行荧光恢复评估。
- 仔细评估每只动物的健康，通过监测其运动，触摸敏感性，生殖能力和生存在未来3天。光漂白后出现损伤迹象的线虫被排除在进一步分析之外。
3. 安装样品并使用表达泛神经细胞质 GFP 的转基因线虫进行 FRAP 测定，punc-119GFP
注：通过神经环位于的头部区域定向光漂白来监测泛神经元蛋白合成。
- 准备2%的加糖垫。
- 将 M9 缓冲液滴到红糖垫的中心添加 10 μL 滴。
- 将5个表达泛神经细胞质GP的转基因线虫转移到一滴M9缓冲液中。
- 用睫毛传播液体。
注：由于 M9 吸收剂进入阿加，动物在 2 分钟内显示的运动减少。 - 使用"睫毛"选择更改线虫位置以避免重叠。
- 将样品放在荧光显微镜的 40 倍客观透镜下。
注：请勿使用盖玻片。 - 对焦并捕获参考图像（预漂白）。
- 将目标感兴趣区域光漂白 90 秒。
注：当荧光信号淬火至 30 ~ 50% 的强度时，停止光漂白。根据被检查的特定荧光团、动物阶段和细胞或组织，应相应地调整光强度和漂白周期的持续时间。对于不同的试样，需要适当的辐照持续时间，以达到足够的光漂白程度。 - 光漂白（漂白）后捕获图像。
- 在光漂白线虫上添加 10 μL 滴 M9 缓冲液。
- 让动物恢复5分钟。
- 使用"睫毛"拾取器或移液器将线虫转移到单个 NGM 板，在中心放置 20 μL OP50 滴。
- 每 1 小时在荧光立体显微镜下每 1 小时捕获一次每个样本的图像。
注：在光漂白后恢复时间计数 t=0。
4. FRAP测定期间图像捕获的数据分析
- 使用软件（例如斐济）分析获取的图像。
- 使用软件打开图像。
- 通过"图像和颜色"下拉菜单选择"拆分通道"命令。
注：保留绿色通道图像。 - 使用 "手绘选择 "工具手动设置感兴趣的荧光区域（例如全身、头部、肠道）。
- 通过" 分析 "下 拉 菜单选择"测量"命令，以测量每个时间点所感兴趣区域的均值像素强度。
注：荧光恢复百分比使用光漂白后捕获的参考图像计算。
5. 报告统计分析
- 使用至少20~25个线虫的每个菌株和/或条件。
注：应进行三次生物复制。 - 使用统计 分析软件执行学生 t-测试（两组之间的比较）或 ANOVA（多个组之间的比较）进行统计分析 ，P < 0.05 具有重要意义。
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Representative Results
利用此处介绍的程序，使用野生型和突变转基因线虫表示以下体细胞学记者，pife-22GFP，psod-3-3GFP和 punc-119GFP，根据各自的方案评估蛋白质合成速率。特别是，野生型和 ife-2突变蠕虫使用ife-2促进器在其躯体组织中表达细胞质 GFP，在光漂白后和恢复后 5 小时立即进行比较。代表性图像和定量显示，野生类动物完全恢复，而如果e-2突变体的恢复能力下降（图1A）。因此，野生型蠕虫在光漂白后启动去新蛋白生物合成，而缺乏mRNA翻译启动因子 IFE-2 的蠕虫则无法这样做，这表明荧光回收率说明了体内蛋白质合成的速率。此外，环氧胺是mRNA转化的特定抑制剂，可作为蛋白质转化抑制的阳性对照。事实上，在sod-3启动子下表达细胞质 GFP 的环氧胺处理转基因动物，在光漂白时不会恢复荧光（图 1B）。
我们还应用这种方法来检测mRNA处理体（P体）如何影响蛋白质转化率8。野生类型和edc-3（ok1427）突变线虫表达GP泛神经元检查其恢复能力在目标光漂白在头部区域。与野生类型相比，EDC-3缺陷动物的荧光恢复速度要慢得多（图1C）。这表明EDC-3中位mRNA的周转阻碍新的蛋白质合成，并最终抑制蛋白质转化启动9。
图1：在体内对 C.elegans中新蛋白合成的体内评估。（A） 野生类型和 IFE-2 缺陷线虫的 FRAP 分析，在 ife-2 的启动子下表达细胞质 GFP。转基因动物受到全动物光漂白。GFP 信号降低到初始强度的 30-50%。荧光在光漂白前（漂白前）记录，在光漂白期结束（10分钟;漂白剂）和恢复后5小时记录。（B） 环氧乙酰胺治疗抑制转基因动物在 sod-3促进剂下表达细胞质 GFP 的荧光恢复。转基因动物受到整个动物的光漂白。GFP 信号降低到初始强度的 30-50%。荧光在光漂白前（漂白前）记录，在光漂白期结束（10分钟） 之后记录荧光; 漂白剂）和回收后5小时（A、B：AxioImager Z2显微镜;物镜：20倍，数值孔径0.8;大功率光源，HBO 100;100瓦汞弧灯;激励/发射过滤器集，蔡司集38捐赠GP无移位）。比例杆，500μm。（C） EDC-3 缺陷线虫显示神经元细胞中新蛋白合成率降低。野生类型和 edc-3（ok1427） 动物表达泛神经细胞质 GFP 的荧光信号在光漂白（前漂白）之前以及光漂白期（90 秒;漂白剂）之后测量。转基因动物在头部区域（神经环）受到光漂白。GFP 信号减至初始强度的 30-50%（AxioImager Z2;物镜：40倍，数值孔径 0.75;荧光光源的 30% 发光功率（FI 照明系统 X-Cite 120 XL FL PC、120W 金属卤素灯）和完全打开的虹膜）。荧光恢复的平均像素强度以一小时的时间间隔测量。在三个独立的实验中，每个菌株都对20个动物进行了量化。数据表示平均 S.E.M.，***P < 0.05，未配对 的 t-test。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 试剂 | 食谱 | |
| 2% 阿加罗斯垫 | 1. 在圆柱形玻璃烧杯中，重量为 0.5 g o 法加罗斯 | |
| 2. 添加 25 mL 的 M9 缓冲器 | ||
| 3. 在微波炉中加热，直到接近沸腾。拿出来，用移液器尖搅拌，再煮沸。重复，直到糖溶解。 | ||
| 4. 将空显微镜幻灯片放在长凳上。 | ||
| 5. 在幻灯片中间滴（±50 μL）新鲜2%的阿加罗斯溶液。 | ||
| 6. 拿第二张显微镜幻灯片，放在加糖滴的顶部。轻轻按下以压平掉落。 | ||
| 7. 让红糖硬化 30 秒，轻轻取下顶部显微镜幻灯片。 | ||
| 8. 立即进行样品制备，因为加糖垫将在大约 5 分钟内开始干燥。 | ||
| 提示： 将顶部显微镜幻灯片作为盖，以延长湿度（± 1 小时）。因此，在实验过程中可以快速准备和使用几种阿加罗斯垫。 | ||
| LB 液体介质 | 1. 溶解 10 g 的巴托特里酮，5 克巴托酵母提取物，5 克 NaCl 在 1 L 蒸馏水和自动处理。 | |
| M9 缓冲区 | 1. 在1L蒸馏水和自动处理中溶解3克KH2PO4、6克Na2HPO4和5g NaCl。 | |
| 2. 冷却并添加 1 mL 的 1 M MgSO4 （无菌）。 | ||
| 3. 将 M9 缓冲液存放在 4 °C。 | ||
| 线虫生长介质 （NGM） 阿加板 | 1. 混合3克NaCl，2.5克巴托普酮，0.2克链霉素，17克加糖，加入900 mL的蒸馏水。高压 釜。 | |
| 2. 冷却至55-60°C。 | ||
| 3. 加入1 mL胆固醇库存溶液，1 m L 1 M CaCl2，1mL 1 M MgSO4，1mL 的尼他汀库存溶液，25 mL 无菌 1 M 磷酸盐缓冲液，pH 6.0，蒸馏无菌水高达 1 L。 | ||
| 4. 每培养皿10 mL的培养，并留下凝固。 | ||
| 5. 将盘子存放在 4 °C 下，直到使用。 | ||
表1：常用试剂的推荐配方。 此处概述了所述协议中使用的所有试剂配方。
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Discussion
蛋白质合成调制对机体平衡至关重要。在衰老期间，全球和特定的蛋白质合成受到干扰。最近的研究表明，蛋白质转化平衡直接控制衰老和衰老不仅仅是衰老过程的副产品。特别是，真核启动因子4E（eIF4E）等翻译机制的核心成分，在翻译启动过程中促进mRNA封顶，从而降低依赖帽的蛋白质转化率，诱发氧化应激，加速衰老过程1。此外，神经元特异性EDC-3，它与mRNA处理体、P体相互作用，并增加mRNA衰脱率，也加速了衰老过程8。具体来说，EDC-3抑制允许 IFE-2 封存到P体，最终降低蛋白质转化水平，延缓神经元老化9。
FRAP是一种最初开发的技术，用于研究蛋白质动力学，定位，相互作用和活动与非侵入性荧光标记使用活成像在体内，使它成为一个强大的工具，研究蛋白质合成率实时8,8，10。但是，某些关键步骤需要注意和故障排除。我们为实验过程中遇到的这些潜在障碍或限制提供替代解决方案。
一个问题涉及蠕虫运动，因为蠕虫可以在光漂白过程中逃离光源。这个问题可以通过使用转基因动物表达罗尔 -6（su1006） 等位基因，导致动物以正弦方式移动部分克服。这样，动物光漂白就可以连续进行。此外，实验者可以跟踪在视图平面外移动的蠕虫的移动速度要慢得多。然而，阿加垫也可以作为完全固定动物的替代品。
光漂白的最佳持续时间是在整个实验中应确定并保持稳定的附加关键因素。由于未目标光漂白或持续时间短，光漂白不足。可以通过增加（a） 放大目标和数值孔径，（b） 光照强度和/或 （c） 光漂白持续时间来超越这一点。
如果未检测到显著的荧光恢复，则存在可更改的潜在参数。如果光漂白过多，则减少光漂白持续时间，因为样品损坏已经发生。通过观察接触敏感性、运动、产卵、咽部抽水和生殖能力等生命特征，可以评估蠕虫的损伤。如果蛋白质转化恢复的动力学速度缓慢，则允许更长的恢复期。蛋白质合成恢复因蛋白质家族而异，取决于记者融合长度7。
促进剂活性会影响蛋白质合成的动力学。如果启动子在恢复过程中处于非活动状态，则更改使用的启动子。促进活动可能会在压力条件（如照片伤害）时改变。使用稳定的活动促进器监测全局（如let-858，ife-2，sod-3）或组织特异性（例如身体壁肌肉; sod-3myo-3， unc-54;咽部：myo-2;泛神经元：unc-119，rab-3;机械感觉神经元：mec-4;肠道：vha-6，ges-1）蛋白质转化率。
如果环氧胺的蛋白质转化抑制不足，增加线虫的预孵化时间将克服这一问题。一个需要注意的注意事项是使用转基因蠕虫过度表达蛋白质。使用CRISPR/Cas9生成的转基因线虫在生理水平上表达感兴趣的荧光标记蛋白，将更准确地显示蛋白质动力学和周转率。
检测到的总蛋白质水平是蛋白质降解和合成率的结果。蛋白质降解总是发生在所有真核细胞的基底水平。因此，本协议中测量的蛋白质荧光回收率不是绝对的，而是相对于所比较的条件。从本质上讲，在蛋白质降解的情况下，荧光恢复是测量的。因此，假定所有条件在光漂白后都有相等的蛋白质降解率。为了测量绝对蛋白质的转化率，应使用蛋白质降解缺乏突变蠕虫菌株。具体来说，基因突变，如rpn-10的蛋白酶体或lgg-2自噬可以用作对照11。或者，可以执行蛋白酶和自噬蛋白的RNAi敲解。此外，自噬基质，如SQST-1：：GFP可用于检测自噬降解的贡献，在实验条件下选择12。
在两种实验环境中，这种 FRAP 技术都是非放射性的、非侵入性的，可检测 C. elegans 不同组织中体内的诺新蛋白合成率。它允许在体内环境中进行光漂白之前和期间进行实时成像，并随后监测动物的整个生命周期。翻译启动的扰动会降低衰老，因此，通过 FRAP 测量全球蛋白质合成速率可直接读取老化过程。该协议可以优化，并更大规模地用于筛选与衰老过程或与年龄相关的疾病相关的基因和/或化学物质。或者，总或特定的蛋白质降解率可以通过在不同的遗传背景下光漂白，使用相同的协议与环氧酰胺相结合来衡量。由于环氧酰胺抑制蛋白质转化，将检测出蛋白质降解的速度。该协议将有助于更好地了解蛋白质聚集性疾病遗传模型中的蛋白质降解途径13。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢查尼奥塔基斯 M. 和库纳基斯 K. 的录像录制和编辑。K.P. 由希腊研究和创新基金会（HFRI）和研究与技术总秘书处（GSRT）提供赠款。N.T. 的资金来自欧洲研究理事会 （ERC – GA695190 – MANNA）、欧盟委员会框架方案和希腊教育部的赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
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