Summary
هنا، نقدم ونصف طريقة غير نشطة وغير فاشية لتقييم تخليق البروتين في الجسم الحي، وذلك باستخدام الخيطية Caenorhabditis elegans والانتعاش fluorescence بعد photobleaching (FRAP). ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع الشاشات الوراثية و / أو الدوائية لتحديد التعديلات الجديدة من تخليق البروتين.
Abstract
الحفاظ على البروتيوم صحية أمر ضروري للخلايا والكائنات الحية التوازن. إن االتوازن بين التحكم في البروتينات الترانسية وتدهورها يُحرّض على العديد من الأمراض المرتبطة بالعمر. ويعتبر تراجع آليات مراقبة الجودة في البروتوستاسيس سمة مميزة للشيخوخة. لا تزال الطرق الكيميائية الحيوية للكشف عن تخليق البروتينات من جديد محدودة ، ولها عيوب عديدة ولا يمكن تنفيذها في الخلايا الحية أو الحيوانات. Caenorhabditis elegans ، كونها شفافة وتعديلها وراثيا بسهولة ، هو نموذج ممتاز لرصد معدلات تخليق البروتين باستخدام تقنيات التصوير. هنا، نقدم ونصف طريقة لقياس تخليق البروتين في الجسم الحي باستخدام الفلوريسينت الانتعاش بعد photobleaching (FRAP). الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في خلايا أو أنسجة محددة هي المشعة من قبل مصدر الضوء القوي مما يؤدي إلى الفلورسينس photobleaching. بدوره, تقييم الفلوريسنس الانتعاش يدل على تخليق البروتين الجديد في الخلايا و / أو الأنسجة ذات الاهتمام. وبالتالي، فإن الجمع بين الديدان الخيطية المعدلة وراثيا، والتدخلات الوراثية و/ أو الدوائية جنبا إلى جنب مع التصوير الحي لمعدلات تخليق البروتين يمكن أن يلقي الضوء على آليات التوسط في انهيار البروتيوستا المعتمد على العمر.
Introduction
تخليق البروتين وتدهوره أمر ضروري للتحلل الكائنات الحية. وهناك العديد من الأمراض المرتبطة بالعمر بتحريض من إنتاج البروتين المعيب1,2. من أجل قياس معدلات ترجمة البروتين العالمية، وهناك تقنيات البيوكيميائية مثل التنميط الريبوسومي، الذي ينطوي على التسلسل العميق لشظايا الحمض النوويrna محمية الريبوسوم لرصد التعبير وكذلك تخليق البروتين رواية3. هذا الأسلوب، بالإضافة إلى كونه قراءة غير مباشرة لمعدلات الترجمة، كما زيادة رنا جمعية لا يعني بالضرورة زيادة الترجمة، لديها عيوب تقنية، مثل التكلفة العالية وشرط كمية كبيرة من المواد الأولية. من ناحية أخرى، الأساليب القائمة على البروتيوميكس تسمح لكمّ البروتين المباشر عن طريق التوصيف الأيضي النبضي متبوعاً بتحليل قياس الطيف الكتلي4،5. ومع ذلك، هذا هو نهج شبه كمية مع دقة زمنية محدودة التي لا يمكن استخدامها بسهولة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يتم توزيع التوسيم للبروتين بشكل غير متساو في الحيوان/الأنسجة ذات الاهتمام. والأهم من ذلك، يمكن لكل من هاتين الطريقتين إخفاء اختلافات خاصة بالأنسجة أو الخلايا في معدلات ترجمة البروتين في الحيوانات أو الأنسجة بالكامل، على التوالي.
Caenorhabditis elegans هو كائن سهل الاستخدام نموذج يمكن زراعته في أعداد كبيرة6. بالإضافة إلى ذلك، تسمح قابلية الوراثية والشفافية للتصوير الحي في الجسم الحي. يصف هذا البروتوكول منهجية الكشف عن معدلات تخليق البروتين باستخدام استرداد الفلوريسنس بعد التحسس الضوئي (FRAP). نحن نستفيد من التعبير المعدلة وراثيا من البروتينات الفلورية، إما في الكائن الحي كله أو في أنسجة محددة / خلايا. ويمكن للحيوانات المحورة وراثيا إما أن تعبر عن GFP باستخدام مروج للجينات، التي يتم التعبير عنها على نطاق واسع/ على الصعيد العالمي أو مروج خاص بالأنسجة لاستهداف أنواع محددة من الخلايا. ويمكن توسيع هذه التقنية إلى المروج محددة لدراسة معدلات تخليق البروتين من بروتين معين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يمكن استخدام كل من الإندماجات النسخية والترجمة إلى الفلوروفوريس لتقييم ترجمة البروتينات في العديد من الأنسجة. يمكن تقييم معدلات تخليق البروتين لعائلات بروتينية متعددة تُترجم في مقصورات خلوية مختلفة، بما في ذلك السيتوبلازم والميتوكوندرياونواست 7. وتستخدم السلالات التالية لرصد معدلات تخليق البروتين العالمي والخلايا العصبية, N2; السابقين[فife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; السابق[p-119GFP، pRF4]، edc-3 (ok1427)؛ السابقات[p-119GFP, pRF4], N2; السابق[فSOD-3GFP؛ pRF4]
1- صيانة وتزامن وإعداد الديدان الخيطية المعدلة وراثياً لرصد تخليق البروتينات من جديد
- استخدم منظار مجسم مُنشط لتشريحه لتقييم مراحل النمو ونمو النوع البري (wt) والنيمات الخيطية المتحولة وراثياً.
- اليوم 1: استخدام قطف دودة لتحديد ونقل 10 يرقات L4 من wt والحيوانات المتحولة وراثيا متحولة تحمل المراسل الفلورسنت المطلوب على Nematode نمو وسائل الإعلام (NGM) لوحات بذر مع Escherichia القولونية (OP50)(الجدول 1).
- جعل اختيار دودة عن طريق ربط سلك البلاتين في نهاية مدبب من ماصة باستور الزجاج عن طريق ذوبان الزجاج في موقع الاتصال على الموقد بونسن. ثم، تسطيح نهاية السلك البلاتيني في شكل ملعقة باستخدام أي أداة (على سبيل المثال، مطرقة خفيفة أو دبابيس).
- تلقيح مستعمرة واحدة من البكتيريا القولونية E. (OP50) في قارورة تحتوي على 50 مل من لوريا-بيرتاني (LB) السائل المتوسط وتنمو لمدة 10 ساعات في 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز (200 دورة في الدقيقة; الجدول 1). ثم، بذور لوحات NGM مع 200 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية. احتضان لوحات بذر في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها للسماح لنمو الحديقة البكتيرية.
- احتضان وتنمو الديدان الخيطية في درجة الحرارة القياسية من 20 درجة مئوية.
- اليوم الخامس: تحتوي الأطباق على مجموعة مختلطة من الديدان المعدلة وراثياً. اختيار ونقل 15 يرقات L4 من كل سلالة على لوحات OP50-NGM المصنفة حديثا.
- اليوم 6: أداء مقايسة FRAP ومراقبة معدل تخليق البروتين في اليوم 1 من مرحلة البلوغ.
- إعداد واستخدام cycloheximide التي تحتوي على لوحات NGM كتحكم إيجابي:
ملاحظة: إعداد محلول الأسهم من السيكلويكسيميد عن طريق تخفيف في الماء إلى تركيز 10 ملغ / مل. حافظ على حلول الأسهم عند 4 درجة مئوية.- قتل البكتيريا عن طريق تعريض لوحات NGM المصنفة لمدة 15 دقيقة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (222 μW/cm2 شدة).
- أضف cycloheximide على رأس الألواح البكتيرية إلى 500 ميكروغرام / مل التركيز النهائي في حجم agar.
- السماح لتجف لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- نقل الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التي تعبر عن صsod-3GFP على السيارة واللوحات التي تحتوي على السيكلوهيكسميد.
- احتضان الحيوانات لمدة 2 ساعة في درجة الحرارة القياسية من 20 درجة مئوية.
2- مقايسة FRAP باستخدام محورة وراثياً تعبر عن مراسلي الأنسجة الجسدية pife-2GFP وpsod-3GFP
ملاحظة: مراقبة معدل تخليق البروتين العالمي في جسم الحيوان بأكمله. يقدم هؤلاء المراسلون النسخيون مستويات تعبير مختلفة ويعبرون عنها في كل مكان في أنسجة جسدية متعددة ، بما في ذلك الأمعاء والبلعوم وعضلات جدار الجسم.
- اختيار ونقل الحيوانات المعدلة وراثيا لمدة يوم واحد الكبار إلى لوحات NGM الفردية بذر مع 20 ميكرولتر OP50 قطرة في المركز.
- إزالة الغطاء ووضع كل لوحة تحت عدسة الهدف 20x من مجهر epifluorescence.
- التركيز والتقاط صورة مرجعية قبل photobleaching (قبل التبييض).
- Photobleach كل عينة لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: أوقف الاضاءة الضوئية عندما يتم إخماد إشارة الفلورسنت إلى 30 – 50٪ كثافة نسبة إلى صورة ما قبل التبييض. وينبغي تعديل شدة الضوء ومدة فترة التبييض وفقا لذلك بالنسبة للفلوروفور، ومرحلة الحيوان، والخلايا أو الأنسجة قيد الفحص. وينبغي أن تحدد تجريبياً المدة المناسبة للإشعاع اللازم للوصول إلى مدى كافٍ من الخفقان الضوئي، بالنسبة لعينات مختلفة. - التقاط صورة بعد photobleaching (التبييض).
- إبقاء الحيوانات في لوحات NGM الفردية والسماح لهم لاسترداد.
- صورة وتسجيل الانتعاش من كل مراسل الفلورسنت كل 1 ساعة لمدة 6 ساعات على الأقل في مضان المجسم.
- بدلاً من ذلك، قم بإجراء تقييم الفلورسنت للاستعادة باستخدام مجهر الظهارة (على سبيل المثال AxioImager Z2).
- تقييم بعناية صحة الحيوان لكل من خلال رصد الحركة، والحساسية للمس، والقدرة الإنجابية والبقاء على قيد الحياة على مدى الأيام 3 المقبلة. واستبعدت من التحليلات الإضافية حالات النماتودا التي تظهر عليها علامات التلف بعد الاحتراق الضوئي.
3. تركيب العينات وأداء اختبار FRAP باستخدام النيماتودا المعدلة وراثيا التعبير عن عموم العصبية cytoplasmic GFP، فunc-119GFP
ملاحظة: مراقبة عموم العصبية تخليق البروتين عن طريق photobleaching المستهدفة في منطقة الرأس، حيث يقع حلقة العصب.
- إعداد 2٪ منصات agarose.
- أضف قطرة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 إلى مركز لوحة agarose.
- نقل 5 الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التعبير عن عموم الخلايا العصبية سيتوبلازميك GFP في قطرة من M9 العازلة.
- استخدم رمشًا لنشر السائل.
ملاحظة: الحيوانات تعرض حركات مخفضة خلال دقيقتين بسبب امتصاص M9 في agar. - تغيير موضع الخيطية لتجنب التداخل باستخدام اختيار "رمش".
- ضع العينة تحت عدسة 40x الهدف من مجهر epifluorescence.
ملاحظة: لا تستخدم غطاء. - التركيز والتقاط صورة مرجعية (ما قبل التبييض).
- Photobleach المنطقة المستهدفة من الفائدة لمدة 90 ثانية.
ملاحظة: أوقف الاضاءة الضوئية عندما يتم إخماد إشارة الفلورسنت إلى 30 – 50٪ كثافة نسبة إلى صورة ما قبل التبييض. وينبغي تعديل شدة الضوء ومدة فترة التبييض وفقا لذلك بالنسبة للفلوروفور، ومرحلة الحيوان، والخلايا أو الأنسجة قيد الفحص. وينبغي أن تحدد تجريبياً المدة المناسبة للإشعاع اللازم للوصول إلى مدى كافٍ من الخفقان الضوئي، بالنسبة لعينات مختلفة. - التقاط صورة بعد photobleaching (التبييض).
- إضافة قطرة 10 ميكرولتر من M9 العازلة على الديدان الخيطية photobleached.
- دع الحيوانات تتعافى لمدة 5 دقائق.
- استخدام "رمش" أو ماصة لنقل الديدان الخيطية إلى لوحات NGM الفردية بذر مع 20 ميكرولتر OP50 قطرة في المركز.
- التقط صورة لكل عينة كل ساعة تحت منظار مُيكروسكوب epifluorescence.
ملاحظة: عدد t = 0 لوقت الاسترداد بعد photobleaching.
4- تحليل البيانات عن التقاط الصور أثناء عملية تقييم الموارد الحرجية من أجل حماية الغابات
- تحليل الصور المكتسبة باستخدام البرمجيات (مثل فيجي).
- فتح الصور مع البرنامج.
- حدد الأمر تقسيم القنوات عبر القائمة المنسدلة الصورة والألوان.
ملاحظة: احتفظ بصورة القناة الخضراء. - استخدم أداة التحديد اليدوي لتعيين منطقة الفلورسنت ذات الاهتمام (على سبيل المثال، الجسم بأكمله، الرأس، الأمعاء).
- حدد الأمر القياس عبر القائمة المنسدلة تحليل لقياس متوسط كثافة البيكسل للمنطقة التي تهم لكل نقطة زمنية.
ملاحظة: يتم حساب النسبة المئوية لاسترداد الفلوريسين باستخدام الصور المرجعية التي تم التقاطها بعد التحسس الضوئي.
5 - تقرير التحليل الإحصائي
- استخدام ما لا يقل عن 20 - 25 الديدان الخيطية من كل سلالة و / أو شرط.
ملاحظة: يجب إجراء ثلاثة النسخ المتماثلة البيولوجية. - إجراء اختبار t-الطالب(مقارنة بين مجموعتين) أو ANOVA (مقارنة بين مجموعات متعددة) للتحليل الإحصائي مع P < 0.05 كـ الهامة باستخدام برنامج التحليل الإحصائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الإجراء المعروض هنا، تم استخدام النوع البري والنيمات الخيطية المتحولة المتحولة المتحولة التي تعبر عن المراسلين الجسديين التاليين، pife-22GFP، psod-3GFP وpunc-119GFP، لتقييم معدلات تخليق البروتين وفقًا للبروتوكولات ذات الصلة.sod على وجه الخصوص ، تم مقارنة نوع البرية والديدان متحولة ife-2 التي تعبر عن GFP السيتوبلازمية في جميع أنحاء الأنسجة الجسدية باستخدام المروج ife-2 قبل ذلك ، مباشرة بعد الضوئي و5 ساعات بعد الانتعاش. تظهر الصور التمثيلية والكمية أن الحيوانات من النوع البري تسترد تمامًا بينما تتضاءل طفرات ife-2 (الشكل 1A). وهكذا، والديدان نوع البرية بدء دي نوفو بروتين التركيب الحيوي بعد photobleaching بينما الديدان تفتقر إلى تحويل ميرنا عامل بدء IFE-2 غير قادرة على القيام بذلك، مما يدل على أن معدل الانتعاش fluorescence يوضح معدل تخليق البروتين في الجسم الحي7. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام السيكلوهيكسيميد، وهو مثبط محدد لترجمة الرنا، كتحكم إيجابي في تثبيط ترجمة البروتين. في الواقع ، cycloheximide المعالجة الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن cytoplasmic GFP تحت المروج sod -3 ، لا استرداد الفلوريسنس بهم على photobleaching (الشكل 1B).
كما قمنا بتطبيق هذه الطريقة للكشف عن كيفية أجهزة معالجة مرنا (P bodies) تؤثر على معدل ترجمة البروتين8. تم فحص نوع البرية وedc-3 (ok1427) الديدان الخيطية متحولة التي تعبر عن GFP عموم العصبية لقدرتها على الانتعاش على photobleaching المستهدفة في المنطقة الرأس. انتعاش Fluorescence أبطأ بكثير في الحيوانات EDC-3 نقص بالمقارنة مع نوع البرية(الشكل 1C). وهذا يشير إلى أن EDC-3-بوساطة دوران مرنا يعوق تخليق البروتين الرواية ويقمع في نهاية المطاف بدء ترجمة البروتين9.
الشكل 1: في تقييم الجسم الحي من تخليق البروتين في دي نوفو في C. elegans. (أ)تحليل FRAP في كل من نوع البرية وIFE-2 نقص النيماتودا التعبير عن cytoplasmic GFP تحت المروج IFE-2. تتعرض الحيوانات المعدلة وراثياً للضواقعة الحيوانية بالكامل. يتم تقليل إشارة GFP إلى 30-50٪ من الكثافة الأولية. يتم تسجيل الفلوريسنس قبل التحسس الضوئي (ما قبل التبييض) ، بعد نهاية فترة التبييض الضوئي (10 دقائق ؛ التبييض) و 5 ساعات بعد الاسترداد. (B) Cycloheximide العلاج يمنع انتعاش الفلوريسنس الحيوانات المعدلة وراثيا التعبير عن GFP السيتوبلازمي تحت المروج من sod-3. تتعرض الحيوانات المعدلة وراثيا إلى الاحتراق الضوئي للحيوانات بأكملها. يتم تقليل إشارة GFP إلى 30-50٪ من الكثافة الأولية. يتم تسجيل الفلوريسنس قبل الاحتراق الضوئي (ما قبل التبييض)، بعد نهاية فترة الاحتراق الضوئي (10 دقائق؛ التبييض) و 5 ساعات بعد الانتعاش (A، B: AxioImager Z2 المجهر؛ عدسة الهدف: 20x، الفتحة العددية 0.8؛ مصدر الضوء عالي الطاقة، HBO 100؛ 100 واط مصباح قوس الزئبق؛ الإثارة / مجموعات مرشح الانبعاثات، مجموعة زيس 38 هب GFP التحول الحرة). قضبان مقياس، 500μm. (C) EDC-3 نقص في عرض النيماتودا انخفض دي نوفو معدلات تخليق البروتين في الخلايا العصبية. يتم قياس إشارة الفلوريسنس من كل من النوع البري وedc-3 (ok1427) الحيوانات التي تعبر عن عموم الخلايا العصبية سيتوبلازمك GFP قبل photobleaching (قبل التبييض) وكذلك بعد فترة photobleaching (90sec؛ التبييض). تتعرض الحيوانات المعدلة وراثيا لphotobleaching في منطقة الرأس (العصب). يتم تقليل إشارة GFP إلى 30-50٪ من الكثافة الأولية (AxioImager Z2؛ العدسة الموضوعية: 40x، الفتحة العددية 0.75؛ 30٪ قوة مضيئة لمصدر الإضاءة الفلورسنت (FI نظام الإضاءة X-Cite 120 XL FL PC، مصباح الهالوجينيدات المعدنية 120W) والقزحية المفتوحة بالكامل). يتم قياس متوسط كثافة البيكسل من الاستعادة الفلورية على فترات زمنية ساعة واحدة. تم تحديد 20 حيوانًا لكل سلالة في كل تجربة من التجارب المستقلة الثلاث. تمثل البيانات يعني S.E.M., ***P < 0.05, غيرمُعَد t-test. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكاشف | وصفه | |
| 2% منصات أغاروز | 1. تزن 0.5 ز fagarose في كوب الزجاج أسطواني | |
| 2. إضافة 25 مل من M9 العازلة | ||
| 3. سخني في ميكروويف حتى قريب من الغليان. أخرج، يُحرّك مع طرف ماصة ويغلي مرة أخرى. كرر حتى يتم حل agarose. | ||
| 4. ضع شريحة المجهر فارغة على مقاعد البدلاء. | ||
| 5. ضع قطرة (~ 50 ميكرولتر) من محلول agarose الطازج 2٪ في منتصف الشريحة. | ||
| 6. اتخاذ شريحة المجهر الثاني ووضعها على رأس قطرة agarose. اضغط بلطف لأسفل لتسطيح قطرة. | ||
| 7. اسمحوا agarose تصلب لمدة 30 ثانية وإزالة بلطف الشريحة المجهر الأعلى. | ||
| 8. المضي قدما على الفور مع إعداد العينة، منذ منصات agarose ستبدأ التجفيف في غضون 5 دقائق تقريبا. | ||
| نصيحة: اترك الشريحة العليا المجهر كغطاء للحفاظ على الرطوبة لفترة أطول (~ 1 ساعة). وهكذا، يمكن إعداد عدة منصات agarose واستخدامها بسرعة خلال التجارب. | ||
| LB سائل المتوسطة | 1. تذوب 10 غرام من Bactotryptone، 5 غرام من استخراج الخميرة Bacto، 5 غرام من NaCl في 1 لتر الماء المقطر والأوتكلاف. | |
| M9 المخزن المؤقت | 1. حل 3 غرام من KH2PO4،6 غرام مننا 2HPO4،و 5 ز NaCl في 1 لتر الماء المقطر والأوتوكلاف. | |
| 2. تُترك باردة وأضيف 1 مل من 1 م مغسو4 (معقمة). | ||
| 3. مخزن M9 العازلة في 4 درجة مئوية. | ||
| نمو النيماتودا متوسطة (NGM) لوحات أجار | 1. مزيج 3 غرام من NaCl، 2.5 غرام من bactopeptone، 0.2 غرام من ستريبتوميسين، 17 غرام من أجار وإضافة 900 مل من الماء المقطر. أوتوكلاف. | |
| 2. السماح بارد إلى 55-60 درجة مئوية. | ||
| 3. إضافة 1 مل من محلول مخزون الكوليسترول، 1 مل من 1 م CaCl2،1 مل من 1 M MgSO4،1 مل من محلول الأسهم النيستاتين، 25 مل من معقمة 1 م عازلة الفوسفات، pH 6.0، والمياه المقطرة المعقمة تصل إلى 1 لتر. | ||
| 4. Pipette 10 مل من المتوسط في طبق بيتري ويترك لترسيخ. | ||
| 5. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية حتى استخدامها. | ||
الجدول 1: الوصفات الموصى بها للكاشف المستخدم. جميع وصفات الكواشف المستخدمة في البروتوكول المقدمة هي مبينة هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتين التوليف التشكيل ضروري للجسم المثلي الكائنات الحية. أثناء الشيخوخة، العالمية وكذلك تخليق البروتين محددة هو مضطرب. وتكشف الدراسات الحديثة عن حقيقة أن توازن ترجمة البروتين يتحكم مباشرة في الشيخوخة والشيخوخة ليس مجرد نتيجة ثانوية لعملية الشيخوخة. على وجه الخصوص، المكونات الأساسية لآلية الترجمة مثل عامل بدء eukaryotic 4E (e) ، الذي يسهل مسمر الرنا في وضع حد أقصى أثناء بدء الترجمة ، وبالتالي فإن معدل ترجمة البروتين المعتمد على الغطاء ، يحفز الإجهاد التأ المؤسّد ويسرع عملية الشيخوخة1. وعلاوة على ذلك، والخلايا العصبية EDC-3 محددة، والتي تتفاعل مع هيئات معالجة مرنا، P الهيئات ويزيد من معدل الميرنا decapping، كما يسرع عملية الشيخوخة8. على وجه التحديد، قمع EDC-3 يسمح لعزل IFE-2 في الهيئات P، والحد في نهاية المطاف من مستويات ترجمة البروتين، وتأخير الشيخوخة العصبية9.
FRAP هي تقنية وضعت في البداية للتحقيق في ديناميات البروتين ، والتوطين ، والتفاعلات والنشاط مع وضع علامات الفلورسنت غير الغازية باستخدام التصوير الحي في الجسم الحي ، مما يجعلها أداة قوية لدراسة معدلات تخليق البروتين في الوقت الحقيقي8،10. ومع ذلك، هناك بعض الخطوات الهامة التي تتطلب الانتباه واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. نحن نقدم حلولا بديلة لهذه العقبات المحتملة أو القيود التي تواجهها خلال الإجراء التجريبي.
قضية واحدة تتعلق حركة الديدان كما يمكن للدودة الهروب من مصدر الضوء أثناء photobleaching. ويمكن التغلب على هذه المسألة جزئيا باستخدام المعدلة وراثيا التعبير عن رول-6 (su1006) allele، والذي يسبب الحيوانات للتحرك بطريقة الجيوب الأنفية. بهذه الطريقة، يمكن القيام بالوبلاخ الحيواني بشكل مستمر. وعلاوة على ذلك، يمكن للمجرب متابعة حركة الدودة التي تتحرك خارج مستوى الرؤية أبطأ بكثير. ومع ذلك، يمكن أيضا منصات أجار يمكن استخدامها كبديل لشل تماما الحيوانات.
المدة المثلى للضوبليك هو عامل حاسم إضافي يجب تحديده والاحتفاظ به مستقرًا طوال التجارب. يمكن مصادفة عدم كفاية التحسس الضوئي بسبب عدم استهدافه أو قصر المدة. ويمكن تجاوز ذلك بزيادة (أ) هدف التكبير والفتحة العددية، (ب) شدة الضوء و/أو (ج) مدة الإنارة الضوئية.
إذا لم يتم الكشف عن استرداد الفلوريسنس كبير، هناك المعلمات المحتملة التي يمكن تغييرها. إذا كان التحسس الضوئي مفرطًا ، فقلّل من مدة التحسس الضوئي عند حدوث تلف للعينة. يمكن تقييم الأضرار التي لحقت الدودة من خلال مراقبة سمات الحياة مثل حساسية اللمس ، و الحركة ، ووضع البيض ، والضخ البلعوم والقدرة الإنجابية. إذا كانت حركية استعادة ترجمة البروتين بطيئة، اسمح لفترة أطول للتعافي. البروتين توليف الانتعاش يختلف بين الأسر البروتين المختلفة ويعتمد على مراسل الانصهار طول7.
يمكن أن يؤثر نشاط المروج على حركية تخليق البروتين. إذا كان المروج غير نشط أثناء الاسترداد، قم بتغيير المروج المستخدم. قد يتم تغيير نشاط المروج عند ظروف الإجهاد، مثل الندم الضوئي. استخدام المروجين النشاط مستقرة لرصد إما العالمية (على سبيل المثال let-858، ife-2، sod-3)أو الأنسجة الخاصة (على سبيل المثال، عضلات جدار الجسم؛ ميو-3، unc-54؛ البلعوم: ميو-2; عموم العصبية: unc-119, راب-3; الخلايا العصبية mechanosensory: mec-4; الأمعاء: vha-6، ges-1)معدلات ترجمة البروتين.
إذا حدث تثبيط غير كاف للترجمة البروتينية بواسطة cycloheximide، فإن زيادة وقت الحضانة قبل فترة الهيماتودادات ستتغلب على هذه المشكلة. تحذير الذي ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار هو استخدام الديدان المعدلة وراثيا مفرطة التعبير عن البروتينات. باستخدام CRISPR / Cas9 ولدت النيماتريد المعدلة وراثيا التعبير عن البروتينات الموسومة الفلورسنت من الفائدة في المستويات الفسيولوجية سوف توفر صورة أكثر دقة من حركيات البروتين ودوران.
مستويات البروتين الكلي المكتشفة هي نتيجة لتدهور البروتين ومعدلات التوليف. يحدث تدهور البروتين دائماً عند مستويات القاعدية في جميع الخلايا الكاتية. وهكذا، فإن معدلات استرداد البروتين المفلور، التي تقاس في هذا البروتوكول، ليست مطلقة ولكنها نسبية للظروف التي يجري مقارنتها. في جوهرها، يتم قياس انتعاش الفلوريس في وجود تدهور البروتين. لذلك، يفترض أن جميع الشروط لديها معدلات تدهور البروتين متساوية بعد photobleaching. ومن أجل قياس معدلات ترجمة البروتين المطلقة، ينبغي استخدام سلالات دودة متحولة تعاني من نقص في البروتين. على وجه التحديد، يمكن استخدام الطفرات في الجينات مثل rpn-10 من proteasome أو lgg-2 لautophagy كتحكم11. بدلا من ذلك، يمكن تنفيذ RNAi الضربة القاضية من البروتينات البروتياسومية وانتيفالجيك. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الركائز الأومائية مثل SQST-1:: GFP للكشف عن مساهمة التحلل الذاتي في ظل الظروف التجريبية المختارة12.
في كل من الإعدادات التجريبية، هذه التقنية FRAP غير المشعة، غير الغازية، الذي يكشف دي نوفو معدلات تخليق البروتين في الجسم الحي في الأنسجة المختلفة في C. elegans. فهو يسمح للتصوير الحي قبل وأثناء photobleaching في بيئة في الجسم الحي والرصد اللاحقة للحيوانات طوال حياتهم. يُبطّل التخبط في بدء الترجمة الشيخوخة، وبالتالي يمكن استخدام قياس معدلات تخليق البروتين العالمية من قبل FRAP كمطالعة مباشرة لعملية الشيخوخة. يمكن تحسين هذا البروتوكول واستخدامه على نطاق أوسع لفحص الجينات و/أو المواد الكيميائية المتعلقة بعملية الشيخوخة أو الأمراض المرتبطة بالعمر. وبدلاً من ذلك، يمكن قياس معدلات تدهور البروتين الكلي أو المحدد عن طريق التحسس الضوئي تحت خلفيات جينية مختلفة باستخدام نفس البروتوكول بالاقتران مع السيكلويكسيميide. كما يتم تثبيط ترجمة البروتين من قبل cycloheximide، سيتم الكشف عن معدل تدهور البروتين. سيساعد هذا البروتوكول في فهم أفضل مسارات تدهور البروتين في النماذج الوراثية لأمراض تجميع البروتين13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر تشانيوتاكيس م. وكوناكيس ك. لتسجيل الفيديو وتحريره. يتم تمويل شركة K.P. من منحة من المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار والأمانة العامة للبحوث والتكنولوجيا (GSRT). يتم تمويل N.T. من خلال منح من مجلس البحوث الأوروبي (ERC - GA695190 - MANNA) ، وبرامج إطار عمل المفوضية الأوروبية ، ووزارة التعليم اليونانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
