Summary
ここでは、光漂白後の線虫 カエノールハブディティス・エレガン スおよび蛍光回復(FRAP)を利用して、インビボでのデノボタンパク合成を評価するための非放射性および非侵襲的な方法を紹介し、説明する。この方法は、タンパク質合成の新しいモジュレーターを識別するために、遺伝的および/または薬理学的スクリーンと組み合わせることができます。
Abstract
細胞および体性恒常性に不可欠なタンパク質を維持することは、健康なプロテオームを維持する必要があります。タンパク質の翻訳対照と分解のバランスの摂動は、多くの年齢関連疾患を引き起こします。プロテオスタシスの品質管理機構の低下は老化の特徴である。デノボタンパク質合成を検出する生化学的方法は依然として限定的であり、いくつかの欠点を有し、生きた細胞または動物では行うことができない。 カエノハブディティス・エレガンスは、 透明で遺伝子組み換えが容易であり、イメージング技術を用いてタンパク質合成速度を監視する優れたモデルです。ここでは、光漂白後の蛍光回収(FRAP)を利用した生体内でのデノボタンパク質合成を測定する方法について紹介する。特定の細胞または組織で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物は、蛍光光化をもたらす強力な光源によって照射される。次に、蛍光回復の評価は、目的の細胞および/または組織における新しいタンパク質合成を意味します。したがって、遺伝子導入線種、遺伝的および/または薬理学的介入とタンパク質合成速度の生画像化の組み合わせは、年齢依存性プロテオスタシス崩壊を媒介するメカニズムに光を当てることができる。
Introduction
タンパク質合成と分解は、生体恒常性に不可欠です。多数の年齢関連疾患が、欠陥タンパク質産生11,22によって引き起こされている。世界的なタンパク質翻訳速度を測定するために、リボソームプロファイリングなどの生化学的手法があり、リボソーム保護されたmRNA断片の深いシーケンシングを伴い、発現をモニタリングし、新しいタンパク質合成3を監視する。この方法は、翻訳速度の間接読み出しであることに加え、リボソームへのRNA関連の増加は必ずしも翻訳の増加を意味するわけではないので、高コストおよび大量の出発材料の要件などの技術的な欠点を有する。一方、プロテオミクスベースの方法は、パルス代謝プロファイリングによる直接タンパク質定量を可能にし、続いて質量分析分析44、55を行う。しかし、これは、生体内で簡単に使用できない限られた時間分解能を持つ半定量的なアプローチです。さらに、タンパク質の標識は、対象の動物/組織に不均等に分布することができる。重要なことに、これらの方法は、それぞれ動物全体または組織におけるタンパク質翻訳速度における組織特異的または細胞特異的な変動を隠すことができる。
カエノハブディティス・エレガンス は、6個の数で成長させることができる使いやすいモデル生物です。さらに、その遺伝的異常性および透明性は、生体内での生画像化を可能にする。このプロトコルは、光漂白後の蛍光回復(FRAP)を用いてタンパク質合成速度を検出する方法論を説明する。私たちは、生物全体または特定の組織/細胞における蛍光タンパク質のトランスジェニック発現を利用します。トランスジェニック動物は、遺伝子のプロモーターを用いてGFPを発現するか、特定の細胞タイプを標的とする組織特異的プロモーターを発現させる。この技術は、特定のタンパク質のタンパク質合成速度を調べるために特定のプロモーターに拡張することができる。
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Protocol
注:蛍光体への転写および翻訳融合の両方を使用して、いくつかの組織におけるデノボタンパク質翻訳を評価することができます。タンパク質合成速度は、細胞質、ミトコンドリアおよび核7を含む異なる細胞コンパートメントに局在する複数のタンパク質ファミリーについて評価することができる。次の株は、グローバルおよび神経タンパク質合成速度を監視するために使用されます, N2;Ex[pife-2GFP,pRF4]、ife-2(ok306) ife-2(ok306)元[pife-2GFP, pRF4], N2;Ex[punc-119GFP, pRF4]、 edc-3 (ok1427)。元[punc-119GFP, pRF4], N2;元[psod-3GFP; pRF4]
1. デノボタンパク質合成をモニタリングするためのトランスジェニック線虫の維持、同期および調製
- 解剖用実体顕微鏡を用いて、野生型(wt)および変異型トランスジェニック線虫の発生段階および成長を評価する。
- 1日目:望ましい蛍光レポーターを運ぶwtおよび変異型トランスジェニック動物の10L4幼虫を、エシェリヒア・コリ(OP50)を播種したプレートに選択して移送するワームピックを使用する(表1)。
- ブンゼンバーナーの接触部位でガラスを溶かして、ガラス製のパスツールピペットの先細り端にプラチナワイヤーを取り付けて、ワームピックを行います。次に、任意の工具(例えば、ピンサーまたはライトハンマー)を使用して、白金線の端部をヘラ状に平らにする。
- 大 腸菌 (OP50)の単一コロニーを、ルリア・ベルタニ(LB)液体培地50mLを含むフラスコに接種し、37°Cで10時間、揺れインキュベーター(200rpm)で増殖する。 表 1)。次いで、細菌培養の200 μLでNGMプレートをシードします。細菌の芝生の成長を可能にするために、室温で一晩で播種プレートをインキュベートします。
- 線虫を20°Cの標準温度でインキュベートし、成長させる。
- 5日目:プレートには、トランスジェニックワームの混合集団が含まれています。選択し、新しく播種OP50-NGMプレート上の各株の15 L4幼虫を転送します。
- 6日目:成人期の1日目にFRAPアッセイを行い、タンパク質合成率を監視する。
- 正のコントロールとしてNGMプレートを含むシクロヘキシミドを準備し、使用します。
注:水に希釈して10mg/mLの濃度に希釈することにより、シクロヘキシミドのストック溶液を調製してください。ストック液を4°Cに保つ。- 播種したNGMプレートをUV光(222 μW/cm2 強度)で15分間曝露して細菌を殺す。
- 細菌種プレートの上にシクロヘキシミドを加えて、寒天体積の500 μg/mLの最終濃度にします。
- プレートを室温で30分間乾燥させます。
- 車載およびシクロヘキシミド含有プレート上でpsod-3GFP を発現するトランスジェニック線虫を転写する。
- 20°Cの標準温度で2時間の動物をインキュベートする。
2. 体細胞組織レポーターpie-2GFPおよびpsod-3GFPを発現するトランスジェニック動物を用いたFRAPアッセイ
注:動物の体全体のグローバルタンパク質合成速度を監視します。これらの転写レポーターは、異なる発現レベルを提示し、腸、咽頭および体壁筋肉を含む複数の体細胞組織で遍在的に発現している。
- 1日成のトランスジェニック動物を、中央に20 μL OP50ドロップで播種した個々のNGMプレートに移します。
- 蓋を取り外し、各プレートを20倍の対物レンズの下に置きます。
- フォトブリーチ(プレ漂白)の前に、参照画像に焦点を当ててキャプチャします。
- 各サンプルを10分間フォトブリーチします。
注:蛍光シグナルが、漂白前画像に対して30~50%の強度に消光した場合は、フォトブラチを停止します。光強度と漂白期間の期間は、検査中の特定のフルオロフォア、動物のステージおよび細胞または組織に応じて調整する必要があります。適切な光漂白の範囲に達するために必要な照射の適切な持続時間は、異なる標本のために、実験的に決定されるべきである。 - フォトブリーチ(漂白)後に画像をキャプチャします。
- 動物を個々のNGMプレートに保管し、回復させます。
- 蛍光体顕微鏡で1時間毎に1時間毎に各蛍光レポーターの回収を画像化し記録する。
- あるいは、蛍光顕微鏡(例えば、AxioImager Z2)を用いて蛍光回収評価を行う。
- 動物の移動、触接感度、生殖能力、生存期間を次の3日間にわたって監視することで、動物一人当たりの動物の健康状態を慎重に評価します。光漂白後の損傷の兆候を示す線虫は、さらなる分析から除外された。
3. サンプルを取り付け、汎神経細胞質GFP、punc-119GFPを発現するトランスジェニック線虫を用いてFRAPアッセイを行う
注:神経環が位置するヘッド領域で標的フォトブリーチすることにより、汎神経細胞タンパク質合成を監視します。
- 2%アガロースパッドを準備します。
- アガロースパッドの中央にM9バッファの10 μLのドロップを追加します。
- 汎ニューロン細胞質GFPを発現する5つのトランスジェニック線虫をM9バッファーの低下に移す。
- まつげを使って液体を広げます。
注:動物は寒天へのM9吸光度のために2分以内に動きを減らします。 - 「まつげ」ピックを使用して重なり合わないように線虫の位置を変更します。
- このサンプルを、蛍光顕微鏡の40倍の対物レンズの下に置きます。
注: カバースリップは使用しないでください。 - 参照画像(プレ漂白剤)に焦点を合わせ、キャプチャします。
- 対象となる対象領域を 90 秒間フォトブリュチします。
注:蛍光シグナルが、漂白前画像に対して30~50%の強度に消光した場合は、フォトブラチを停止します。光強度と漂白期間の期間は、検査中の特定のフルオロフォア、動物のステージおよび細胞または組織に応じて調整する必要があります。適切な光漂白の範囲に達するために必要な照射の適切な持続時間は、異なる標本のために、実験的に決定されるべきである。 - フォトブリーチ(漂白)後に画像をキャプチャします。
- フォトブリーチ線虫にM9バッファを10μLドロップします。
- 動物は5分間回復しましょう。
- 「まつげ」ピックまたはピペットを使用して、ネマトデスを中央に20 μL OP50ドロップで播種した個々のNGMプレートに移します。
- 各サンプルの画像を、1時間ごとに、蛍光体型顕微鏡で撮影します。
メモ:フォトブリーチ後の回復時間として t=0 をカウントします。
4. FRAPアッセイ中に撮影した画像のデータ解析
- 取得した画像をソフトウェア(フィジーなど)を使用して分析します。
- ソフトウェアで画像を開きます。
- [画像と色] ドロップダウン メニューから [チャンネルの分割] コマンドを選択します。
注: 緑色のチャンネルイメージを保持します。 - フリーハンド選択ツールを使用して、対象の蛍光領域(全身、頭部、腸など)を手動で設定します。
- [分析]ドロップダウン メニューから[計測]コマンドを選択して、各時間ポイントの対象領域の平均ピクセル強度を測定します。
注:蛍光回復の割合は、光漂白後に撮影した参照画像を使用して計算されます。
5. 統計分析の報告
- 各株および/または条件の少なくとも20 - 25線虫を使用してください。
注: 3 つの生物学的複製を実行する必要があります。 - 統計的解析ソフトウェアを使用して有意なP< 0.05を用いた統計分析のために、P学生t-検定(2つのグループ間の比較)またはANOVA(複数グループ間の比較)を実行します。
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Representative Results
ここで示した手順を用いて、以下の体細胞レポーターを発現する野生型および変異型トランスジェニック線虫、pife-22GFP、psodsod-3GFPおよびpunc-119GFPを、それぞれのプロトコルに従ってタンパク質合成率を評価するために使用した。特に、ヒス2プロモーターを用いて体細胞組織全体に細胞質GFPを発現する野生型およびife-2変異型ワームを、前に、光漂白後5時間後に比較した。代表的な画像と定量化は、野生型動物が完全に回復し、ife-2変異体が回復能力を低下させたことを示している(図1A)。このように、野生型ワームは、mRNA翻訳開始因子IFE-2を欠くワームがそうすることができない間に光漂白後にデノボタンパク質生合成を開始し、蛍光回復率が生体内7におけるタンパク質合成の速度を示すことを示す。また、mRNA翻訳の特異的阻害剤であるシクロヘキシミドは、タンパク質翻訳抑制の陽性対照として使用することができる。実際、シクロヘキシミド処理したトランスジェニック動物は、sod-3プロモーター下で細胞質GFPを発現し、光漂白時に蛍光を回復しない(図1B)。
また、この方法を応用して、mRNA処理体(P体)がタンパク質翻訳速度に与える影響を検出する8.野生型およびedc-3(ok1427)GFP汎ニューロンを発現する変異線虫は、頭部領域における標的光漂白時の回復能力について検討した。EDC-3欠乏動物では、野生型に比べて蛍光回復がかなり遅い(図1C)。これは、EDC-3媒介性mRNAのターンオーバーが新規タンパク質合成を妨げ、最終的にはタンパク質翻訳開始を抑制することを示す9。
図1: C. エレガンスにおけるデノボタンパク質合成のインビボ評価 .(a) イ フェ-2のプロモーター下で細胞質GFPを発現する野生型とIFE-2欠損線虫の両方におけるFRAP解析。トランスジェニック動物は、全動物の光漂白を行う。GFP信号は初期強度の30-50%に減少する。蛍光は、光漂白(漂白前)の前に記録され、光漂白期間の終了(10分;漂白剤)および回復後5時間後に記録される。(B)シクロヘキシミド治療は 、sod-3のプロモーター下で細胞質GFPを発現するトランスジェニック動物の蛍光回復を阻害する。トランスジェニック動物は、動物全体の光漂白を行う。GFP信号は初期強度の30-50%に減少する。蛍光は、フォトブリーチング(漂白前)の前に記録され、光漂白期間の終了(10分;漂白剤)および5時間後の回復後(A、B:AxioImager Z2顕微鏡;対物レンズ:20倍、数値開口0.8;高出力光源、HBO100;100ワット水銀ランプ、エクスサイシング/放出フィルター、100ワット水銀ランプ、エクスサイション/放出フィルター、100ワット水銀ランプ、エクスサイオン排源フィルター、100ワット水銀ランプ、エクス/エミッションフィルター)を終了します。スケールバー、500μm。(C) EDC-3欠損線虫は、神経細胞におけるデノボタンパク質合成率の低下を示す。野生型と脳細胞質GFPを発現する edc-3(ok1427) 動物の蛍光シグナルは、光漂白(プレ漂白)の前に、また光漂白期間(90秒;漂白剤)に従って測定される。トランスジェニック動物は、頭部領域(神経環)で光漂白を行う。GFP信号は、初期強度の30〜50%に減少します(AxioImager Z2;対物レンズ:40倍、開口0.75;蛍光灯光源の30%発光パワー(FI照明システムX-Cite 120 XL FL PC、120Wメタルハロゲン化ランプ)と完全開き虹彩。蛍光回復の平均画素強度は、1時間間隔で測定される。3つの独立した実験のそれぞれで20匹の動物を株当たり定量した。データは、平均 S.E.M.、***P < 0.05、ペアになっていない t-test を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | レシピ | |
| 2%アガロースパッド | 1. 円筒形ガラスビーカーで0.5 gのファガロースの重量を量る | |
| 2. M9バッファの25 mLを追加 | ||
| 3. 沸騰に近づくまで電子レンジで熱します。取り出し、ピペットチップでかき混ぜ、再び沸騰させます。アガロースが溶解するまで繰り返します。 | ||
| 4. ベンチに空の顕微鏡スライドを置きます。 | ||
| 5. スライドの中央に、新鮮な2%アガロース溶液の滴(〜50μL)を入れます。 | ||
| 6. 2つ目の顕微鏡スライドを取り、アガロースドロップの上に置きます。落としを平らにするためにそっと押し下げます。 | ||
| 7. アガロースを30秒間硬化させ、上顕微鏡をそっと取り出します。 | ||
| 8. アガロースパッドは約5分以内に乾燥を開始するので、すぐにサンプル調製を進めます。 | ||
| ヒント: 上部顕微鏡スライドをカバーとして、湿度を長く保つ(〜1時間) のままにしておきます。したがって、いくつかのアガロースパッドは、実験中に迅速に調製し、使用することができる。 | ||
| LB液体媒体 | 1. バクトトリプコン10g、バクト酵母エキス5g、1L蒸留水とオートクレーブでNaClの5gを溶解する。 | |
| M9 バッファ | 1. KH2PO4の3g、Na22HPO4の6g、及び5g NaClを1 L蒸留水とオートクレーブに溶解する。 | |
| 2. 冷却し、1 M MgSO4 (滅菌) の 1 mL を追加します。 | ||
| 3. M9バッファーを4°Cに保存します。 | ||
| 線虫成長培地(NGM)寒天プレート | 1. 3 g の NaCl、2.5 g のバクトペプトン、0.2 g のストレプトマイシン、寒天 17 g、蒸留水 900 mL を加えます。オートクレーブ。 | |
| 2. 55~60°Cに冷却します。 | ||
| 3. 1 mLのコレステロールストック溶液、1 M CaCl2の1 mL、1 M MgSO4の1 mL、ナイスタチンストック溶液の1 mL、25 mLの無菌1 Mリン酸緩衝液、pH 6.0、および1 Lまでの蒸留無菌水を加える。 | ||
| 4. ピペット 10 mL のペトリ皿あたり培地を固めます。 | ||
| 5. 使用するまで4°Cでプレートを保管します。 | ||
表1:試薬用の推奨レシピ 提示されたプロトコルで使用されるすべての試薬のレシピは、ここに概説されています。
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Discussion
タンパク質合成変調は、生体恒常性に不可欠です。老化の間に, グローバルだけでなく、特定のタンパク質の合成が摂動されます。.最近の研究では、タンパク質翻訳バランスが老化と老化を直接制御することは、単なる老化過程の副産物ではないことが明らかになっている。特に、真核生物開始因子4E(eIF4E)のような翻訳機械のコア成分は、翻訳開始時にmRNAキャッピングを容易にし、したがってキャップ依存性タンパク質翻訳の速度を促進し、酸化ストレスを誘導し、老化プロセス1を加速する。また、ニューロン特異的EDC-3は、mRNA処理体と相互作用し、P体がmRNAデパッピングの速度を増加させ、また、老化プロセス8を加速する。具体的には、EDC-3抑制は、P体へのIFE-2隔離を可能にし、最終的にはタンパク質翻訳レベルを低下させ、ニューロンの老化を遅らせる9。
FRAPは、生体内でのライブイメージングを用いた非侵襲的蛍光タグ付けとのタンパク質ダイナミクス、局在化、相互作用および活性を調査するために最初に開発された技術であり、リアルタイム88,1010でタンパク質合成速度を研究するための強力なツールとなっています。ただし、注意とトラブルシューティングを必要とする特定の重要な手順があります。実験手順の際に遭遇する可能性のある障害や制限に代わるソリューションを提供します。
1つの問題は、ワームが光の漂白中に光源を逃れることができるので、ワームの動きに関するものです。この問題は、動物が正弦状に動く原因となる rol-6(su1006) アリールを発現するトランスジェニック動物を使用することで部分的に克服することができる。このようにして、動物の光の漂白を連続的に行うことができる。さらに、実験者は、視界の外を移動するワームの動きにはるかに遅く従うことができます。それにもかかわらず、寒天パッドは、動物を完全に固定化する代替手段としても使用することができる。
光漂白の最適な持続時間は、実験を通じて決定し、安定し続けるべき追加の重要な要因です。対象のないフォトブリーチや短時間でフォトブリーチが不十分です。これは、(a)倍率の目的と数値開口、(b)光強度および/または(c)フォトブリーチ持続時間を増加させることによって上回ることができます。
有意な蛍光回復が検出されない場合、変更できる潜在的なパラメータがあります。光の漂白が過剰である場合は、検体損傷が発生したため、光の漂白時間を短縮します。ワームの損傷は、タッチ感度、移動、産卵、咽頭ポンプおよび生殖能力などの生命特性を観察することによって評価することができる。タンパク質翻訳回復の動態が遅い場合は、回復期間を長くしてください。タンパク質合成回復は、異なるタンパク質ファミリー間で異なり、レポーター融合長7に依存する。
プロモーター活性は、タンパク質合成の運動に影響を与える可能性があります。.反応中にプロモーターが不活性である場合は、使用するプロモーターを変更します。プロモーターの活動は、光損傷などのストレス状態で変化する可能性があります。安定した活動プロモーターを使用して、グローバル (例えば let-858, ife-2 , sod-3)または組織特異的 (例えば体壁筋肉) を監視する。 myo-3, UNC-54;咽頭: myo-2;汎神経細胞: unc-119, rab-3;メカノ感覚ニューロン: mec-4;腸: vha-6, ges-1) タンパク質翻訳率.
シクロヘキシミドによる不十分なタンパク質翻訳阻害が起こると、線虫の前培養時間の増加がこの問題を克服するであろう。注意すべき注意点は、タンパク質を過剰発現させるトランスジェニックワームの使用です。CRISPR/Cas9で生成されたトランスジェニック線虫を使用して、生理学的レベルで目的の蛍光タグ付きタンパク質を発現させることで、タンパク質の動態とターンオーバーをより正確に把握できます。
検出されたタンパク質の総レベルは、そのタンパク質分解および合成速度の結果である。タンパク質分解は、すべての真核細胞の基底レベルで常に起こります。したがって、このプロトコルで測定されるタンパク質蛍光回復率は、絶対的ではなく、比較される条件に対して相対的である。本質的に、タンパク質分解の存在下での蛍光回復が測定される。したがって、全ての条件が、光漂白後のタンパク質分解率が等しいと仮定する。絶対タンパク質の翻訳速度を測定するためには、タンパク質分解欠損性変異型ワーム株を使用する必要があります。具体的には、オートファジー用のプロテアソームやlgg-2のrpn-10などの遺伝子の変異をコントロール11として用いることができる。あるいは、プロテアソームおよびオートファジータンパク質のRNAiノックダウンを行うことができる。さらに、SQST-1:::GFPのようなオートファジー基質は、12を選択した実験条件下でのオートファジー分解の寄与を検出するために使用することができる。
両方の実験設定において、このFRAP技術は非放射性、非侵襲的であり、C.エレガンスの異なる組織における生体内のデノボタンパク質合成率を検出する。それは、生体内の設定での光の消光の前および中に生撮像を可能にし、その生涯にわたって動物のその後の監視を可能にする。翻訳開始の摂動は老化を減速させるため、FRAPによるグローバルタンパク質合成速度の測定は、老化プロセスの直接の読み出しとして使用することができます。このプロトコルは、老化プロセスまたは加齢関連疾患に関連する遺伝子および/または化学物質をスクリーニングするために、より大きなスケールで最適化され、使用することができます。あるいは、総または特異的なタンパク質分解率は、シクロヘキシミドと組み合わせて同じプロトコルを使用して、異なる遺伝的背景下での光漂白によって測定することができる。シクロヘキシミドによってタンパク質の翻訳が阻害されると、タンパク質分解率が検出されます。このプロトコルは、タンパク質凝集性疾患の遺伝的モデルにおけるタンパク質分解経路をよりよく理解する上で役立つだろう。
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Disclosures
著者らは競合する利益を宣言しない。
Acknowledgments
チャニオタキス・Mとクナキス・Kのビデオ録画と編集に感謝します。K.P.は、ギリシャ研究イノベーション財団(HFRI)と研究技術総事務局(GSRT)からの助成金を受けています。N.T.は欧州研究評議会(ERC – GA695190 – MANNA)、欧州委員会枠組みプログラム、ギリシャ教育省からの助成金によって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
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