Summary
여기서, 우리는 선충 표백 후 선충근 및 형광 회복을 활용하여 생체 내에서 드 노보 단백질 합성을 평가하는 비방사성 및 비침습적 방법을 소개하고 설명합니다(FRAP). 이 방법은 단백질 합성의 새로운 변조기를 확인하기 위하여 유전 및/또는 약리학 스크린과 결합될 수 있습니다.
Abstract
건강한 프로테아메를 유지하는 것은 세포와 유기체 항상성에 필수적입니다. 단백질 번역 제어와 저하 사이의 균형의 왜곡은 연령 관련 질병의 무리를 선동. 프로테오스타증 품질 관리 메커니즘의 감소는 노화의 특징입니다. 드 노보 단백질 합성을 검출하는 생화학적 방법은 여전히 제한되어 있으며, 몇 가지 단점이 있으며 살아있는 세포 나 동물에서 수행 할 수 없습니다. 투명하고 쉽게 유전자 변형되는 Caenorhabditis elegans는 이미징 기술을 사용하여 단백질 합성 속도를 모니터링하는 훌륭한 모델입니다. 여기서, 우리는 광표백 후 형광 회복을 이용한 생체 내 드 노보 단백질 합성을 측정하는 방법을 소개하고 설명한다(FRAP). 특정 세포 또는 조직에서 형광단백질을 발현하는 형질전환 동물은 광표백의 결과로 강력한 광원에 의해 조사된다. 차례로, 형광 회복의 평가는 관심의 세포 및/또는 조직에 있는 새로운 단백질 합성을 의미합니다. 따라서, 단백질 합성 비율의 살아있는 화상 진찰과 더불어 형질 전환선색선골, 유전 및/또는 약리학적 인 내정간섭의 조합은 나이 의존적인 proteostasis 붕괴를 중재하는 기계장치에 빛을 비출 수 있습니다.
Introduction
단백질 합성 및 분해는 유기체 항상성에 필수적입니다. 다양한 연령 관련 질병은 결함이 있는 단백질 생산1,,2에의해 선동된다. 글로벌 단백질 번역 율을 측정하기 위해, 리보솜 보호 mRNA 단편의 깊은 시퀀싱을 수반하는 리보솜 프로파일링과 같은 생화학적 기술이 있으며, 이는 새로운 단백질 합성3뿐만아니라 발현을 모니터링한다. 이 방법은, 번역 속도의 간접적인 판독이외에, 리보솜에 대한 증가된 RNA 협회가 반드시 증가된 번역을 의미하지 않기 때문에, 높은 비용 및 다량의 시작 물질의 요구 사항과 같은 기술적 단점이 있다. 한편, 프로테오믹스 기반 방법은 맥박 대사 프로파일링에 의한 직접 단백질 정량화를 허용한 후 질량 분석 분석4,,5. 그러나, 이것은 생체 내에서 쉽게 사용할 수 없는 제한된 시간적 해상도를 가진 반정적 접근법이다. 더욱이, 단백질의 라벨링은 관심있는 동물/조직에 불평등하게 분배될 수 있다. 중요하 군데, 이 두 가지 방법은 조직별 또는 세포별 변이를 전체 동물 또는 조직에서 각각 은폐할 수 있다.
Caenorhabditis elegans는 대량으로 재배 할 수있는 사용하기 쉬운 모델 유기체입니다6. 추가적으로, 그것의 유전 편의성과 투명성은 생체 내의 살아있는 화상 진찰을 허용합니다. 이 프로토콜은 광표백 후 형광 복구를 사용하여 단백질 합성 속도를 검출하는 방법론을 설명합니다(FRAP). 우리는 전체 유기체 또는 특정 조직/세포에서 형광 단백질의 형질전환 발현을 이용합니다. 형질전환 동물은 유전자의 프로모터를 사용하여 GFP를 발현할 수 있는데, 이는 광범위/전 세계적으로 표현되거나 특정 세포 유형을 표적으로 하는 조직 별 프로모터이다. 이 기술은 특정 단백질의 단백질 합성 비율을 검토하기 위하여 특정 프로모터로 확장될 수 있습니다.
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Protocol
참고: 형광에 대한 전사 및 번역 융합을 모두 사용하여 여러 조직에서 드 노보 단백질 번역을 평가할 수 있습니다. 단백질 합성 비율은 세포질, 미토콘드리아 및 핵7을포함하여 다른 세포 구획에서 국소화된 다중 단백질 가족을 위해 평가될 수 있습니다. 다음 균주는 글로벌 및 뉴런 단백질 합성 율을 모니터링 하는 데 사용 됩니다., N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2 (ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3 (ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. 드 노보 단백질 합성을 모니터링하기위한 트랜스 제닉 선충의 유지 보수, 동기화 및 준비
- 해부 스테레오 현미경을 사용하여 야생 유형 (wt) 및 돌연변이 형선선선선색의 발달 단계와 성장을 평가합니다.
- 1일차: 벌레 선택을 사용하여 원하는 형광 기자를 운반하는 wt 및 돌연변이 형질전환 동물의 10L4 애벌레를 대장균(OP50)으로 Escherichia 시드한 선충화 성장 미디어(NGM) 플레이트에 선택하여 전송한다(표1).
- 분젠 버너의 접촉 부위에 유리를 녹여 유리 파스퇴르 파이펫의 테이퍼 끝에 백금 와이어를 부착하여 웜 픽을 합니다. 그런 다음 모든 도구(예: 핀서 또는 라이트 해머)를 사용하여 백금 와이어의 끝을 주걱 모양으로 평평하게 만듭니다.
- 대장균(OP50) E. coli 박테리아의 단일 콜로니를 루리아-베르타니(LB) 액체 배지의 50mL를 함유한 플라스크로 접종하고 흔들리는 인큐베이터에서 37°C에서 10시간 동안 성장한다(200rpm; 표 1). 그런 다음 세균 배양의 200 μL을 가진 NGM 플레이트를 시드. 세균 잔디의 성장을 허용 하기 위해 하룻밤 실온에서 씨앗 접시를 배양.
- 20°C의 표준 온도에서 선충을 배양하고 성장시다.
- 5일차: 플레이트에는 형질전환벌레의 혼합된 집단이 포함되어 있습니다. 갓 시드 된 OP50-NGM 플레이트에 각 변형의 15 L4 애벌레를 선택하고 전송합니다.
- 6일차: FRAP 분석 작업을 수행하고 성인1일째에 단백질 합성률을 모니터링합니다.
- NGM 플레이트를 포함하는 사이클로헤시미드를 준비하고 긍정적인 컨트롤로 사용하십시오.
참고: 10 mg/mL의 농도로 물에 희석하여 사이클로헨드의 스톡 솔루션을 준비하십시오. 재고 용액을 4 °C로 유지하십시오.- UV 빛 (222 μW /cm2 강도)으로 15 분 동안 시드 NGM 플레이트를 노출하여 박테리아를 죽입니다.
- 식기 부피의 500 μg/mL 최종 농도에 세균 시드 플레이트 위에 사이클로헨시미드를 추가합니다.
- 플레이트가 실온에서 30분 동안 건조되도록 허용합니다.
- 차량 및 사이클로헤시미드 함유 플레이트에 psod-3GFP를 발현하는 트랜스제닉 선충을 전송합니다.
- 20°C의 표준 온도에서 2시간 동안 동물을 배양한다.
2. 체세포 조직을 표현하는 트랜스제닉 동물을 이용한 FRAP 분석 기자 pife-2GFP 및 psod-3GFP
참고: 동물 몸 전체에서 글로벌 단백질 합성 률을 모니터링합니다. 이 전사 기자는 다른 발현 수준을 제시하고 장, 인두 및 바디 월 근육을 포함하여 다중 체세포 조직에서 유비쿼터스로 표현됩니다.
- 1일 성기 형질전환 동물을 중앙에 20μL OP50 드롭으로 시드한 개별 NGM 플레이트로 선택하고 이송합니다.
- 뚜껑을 제거하고 각 플레이트를 에피플루오렌스 현미경의 20배 객관적 렌즈 아래에 놓습니다.
- 포토표백(사전 표백제)전에 참조 이미지를 집중하고 캡처합니다.
- 10 분 동안 각 샘플을 표백합니다.
참고: 형광 신호가 표백 전 이미지에 비해 30 ~ 50 % 강도로 담금질 될 때 광표백을 중지합니다. 표백 기간의 빛 강도 및 기간은 검사 중인 특정 불소, 동물 단계 및 세포 또는 조직에 대해 그에 따라 조정되어야 합니다. 다른 표본에 대한, 광 표백의 적절한 범위에 도달하는 데 필요한 조사의 적절한 기간은 실험적으로 결정되어야한다. - 포토표백(표백제) 후 이미지를 캡처합니다.
- 개별 NGM 접시에 동물을 유지하고 복구 할 수 있습니다.
- 형광 스테레오 현미경에서 적어도 6 시간 동안 각 형광 기자의 회복을 이미지 및 기록합니다.
- 대안적으로, 형광 현미경(예를 들어, AxioImager Z2)을 사용하여 형광 회복 평가를 수행한다.
- 다음 3일 동안 운동, 터치 감도, 생식 능력 및 생존을 모니터링하여 동물당 동물 건강을 신중하게 평가합니다. 석광 표백 후 손상의 흔적을 나타내는 선충은 추가 분석에서 제외되었다.
3. 시료를 장착하고 팬 뉴런 세포질 GFP, punc-119GFP를 발현하는 형질전환 선충을 사용하여 FRAP 분석기를 수행합니다.
참고: 신경 고리가 있는 헤드 부위의 표적 광표백에 의해 범신경 단백질 합성을 모니터링합니다.
- 아가로즈 패드 2%를 준비합니다.
- 아가로즈 패드의 중앙에 M9 버퍼 10 μL 방울을 추가합니다.
- 팬 뉴런 세포질 GFP를 발현하는 5개의 형질선선충을 M9 버퍼한 방울로 옮긴다.
- 속눈썹을 사용하여 액체를 퍼뜨리시면 됩니다.
참고: 동물은 Agar에 M9 흡수력으로 인해 2분 이내에 감소된 움직임을 표시합니다. - 선충 위치를 변경하여 "속눈썹" 선택을 사용하여 겹치지 않도록 합니다.
- 시료를 과형 현미경의 40배 객관적렌즈 아래에 놓는다.
참고: 커버슬립을 사용하지 마십시오. - 참조 이미지(사전 표백제)에 초점을 맞추고 캡처합니다.
- 90초 동안 대상 관심 영역을 포토블리치합니다.
참고: 형광 신호가 표백 전 이미지에 비해 30 ~ 50 % 강도로 담금질 될 때 광표백을 중지합니다. 표백 기간의 빛 강도 및 기간은 검사 중인 특정 불소, 동물 단계 및 세포 또는 조직에 대해 그에 따라 조정되어야 합니다. 다른 표본에 대한, 광 표백의 적절한 범위에 도달하는 데 필요한 조사의 적절한 기간은 실험적으로 결정되어야한다. - 포토표백(표백제) 후 이미지를 캡처합니다.
- 광표백 선충에 M9 버퍼 10 μL 방울을 추가합니다.
- 동물이 5 분 동안 회복하도록하십시오.
- "속눈썹" 선택 또는 파이펫을 사용하여 선충을 중앙에 20 μL OP50 드롭으로 시드된 개별 NGM 플레이트로 전송합니다.
- 상피 성 피관기 현미경으로 1 시간마다 각 샘플의 이미지를 캡처합니다.
참고: 광표백 후 복구 시간에 대해 t=0을 계산합니다.
4. FRAP 분석 중에 캡처된 이미지의 데이터 분석
- 소프트웨어(예: 피지)를 사용하여 획득된 이미지를 분석합니다.
- 소프트웨어로 이미지를 엽니다.
- 이미지 및 색상 드롭다운 메뉴를 통해 분할 채널 명령을 선택합니다.
참고: 녹색 채널 이미지를 유지합니다. - Freehand 선택 도구를 사용하여 관심 있는 형광 영역(예: 전신, 머리, 내장)을 수동으로 설정합니다.
- 드롭다운 분석 메뉴를 통해 측정 명령을 선택하여 각 시간 지점에 대한 관심 영역의 평균 픽셀 강도를 측정합니다.
참고: 형광 회수의 백분율은 광표백 후 캡처된 참조 이미지를 사용하여 계산됩니다.
5. 통계 분석 보고서
- 적어도 사용 20 – 25 각 변형 및/또는 조건의 선충.
참고: 세 가지 생물학적 복제를 수행해야 합니다. - 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 유의한 P< 0.05를 사용한 통계 분석을 위해 학생 t-테스트(두그룹 간의 비교) 또는 ANOVA(여러 그룹 간의 비교)를 수행합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 절차를 이용하여, 다음과 같은 체세포 기자, pife-22GFP, psod-3GFP 및 punc-119GFP를 표현하는 야생형 및 돌연변이 형 선충을 각각의 프로토콜에 따라 단백질 합성 율을 평가하는 데 사용되었다. 특히, ife-2 프로모터를 이용하여 체세포 조직 전반에 걸쳐 세포질 GFP를 발현하는 야생형 및 ife-2 돌연변이 벌레는 포토블리싱 직후, 5시간 후 회복 후에 비교되었다. 대표적인 이미지와 정량화는 야생형 동물이 완전히 회복되는 반면 ife-2 돌연변이체는 회복 능력을 감소시켰다는 것을보여준다(그림 1A). 따라서, 야생형 벌레는 광표백 후 드노보 단백질 생합성을 개시하는 반면, mRNA 번역 개시인 IFE-2가 부족한 벌레는 그렇게 할 수 없으며, 형광 회복의 속도가 생체내에서단백질 합성의 속도를 나타낸다는 것을 나타낸다. 더욱이, mRNA 번역의 특정 억제제인 사이클로헤시미드는 단백질 번역 억제를 위한 양성 대조군으로 사용될 수 있다. 실제로, 소드-3 프로모터하에서 세포질 GFP를 발현하는 사이클로헤시미드 처리형 형질전환동물은, 광표백시 형광을 회복하지않는다(도 1B).
우리는 또한 mRNA 처리 바디 (P 바디)가 단백질 번역8의비율에 어떻게 영향을 미치는지 검출하기 위하여 이 방법을 적용했습니다. GFP 팬-뉴런을 발현하는 야생형 및 edc-3(ok1427) 돌연변이 선충은 헤드 부위의 표적 광표백시 회복 능력에 대해 검사하였다. 형광 회복은 EDC-3 결핍동물에서 야생형(도1C)에비해 훨씬 느립니다. 이는 EDC-3-매개 mRNA 회전율이 새로운 단백질 합성을 방해하고 궁극적으로 단백질 번역 개시9를억제한다는 것을 나타낸다.
도 1: C. elegans에서드 노보 단백질 합성의 생체 평가. (A) IFe-2의프로모터 하에 세포질 GFP를 발현하는 야생형 및 IFE-2 결핍선충 모두에서 FRAP 분석. 트랜스제닉 동물은 전체 동물 광표백을 받습니다. GFP 신호는 초기 강도의 30-50%로 감소됩니다. 형광은 광표백(사전 표백제) 전에 기록되며, 광표백 기간이 끝난 후(10분; 표백제) 및 5시간 후 회복이 가능합니다. (B)사이클로헤시미드 치료는 sod-3의발기인하에서 세포질 GFP를 발현하는 형질전환 동물의 형광 회복을 억제한다. 트랜스제닉 동물은 전체 동물 광표백을 받습니다. GFP 신호는 초기 강도의 30-50%로 감소됩니다. 형광은 광표백 기간(10분)의 끝에 따라 광표백(사전 표백제) 전에 기록됩니다. 표백제) 및 5시간 사후 복구(A, B: AxioImager Z2 현미경; 목표 렌즈: 20x, 수치 조리개 0.8; 고출력 광원, HBO 100; 100 와트 수은 아크 램프; 여기/방출 필터 세트, 자이스 세트 38 엔다우 GFP 시프트 무료). 스케일 바, 500μm. (C)EDC-3 결핍 선충 디스플레이 는 뉴런 세포에서 드 노보 단백질 합성 율을 감소시켰다. 야생형과 에드C-3(ok1427) 동물의 형광 신호는 광표백(pre-bleach)과 포토표백 기간(90초; 표백제)에 따라 광표백(pre-bleach)전에 측정된다. 트랜스제닉 동물은 머리 부위(신경 고리)에서 광표백을 받습니다. GFP 신호는 초기 강도의 30-50 %로 감소 (AxioImager Z2; 객관적인 렌즈: 40 x, 숫자 조리개 0.75; 형광 조명 소스의 30 % 발광 힘 (FI 조명 시스템 X 인용 120 XL FL PC, 120W 금속 할로겐 램프) 완전히 개방). 형광 회복의 평균 픽셀 강도는 1시간 간격으로 측정됩니다. 20마리의 동물은 3개의 독립적인 실험각각에서 균주당 정량화되었다. 데이터는 S.E.M., ***P&05, 페어링되지 t않은 t-test를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 제조 법 | |
| 아가로즈 패드 2% | 1. 원통형 유리 비커에 0.5 g o fagarose 무게 | |
| 2. M9 버퍼 25mL 추가 | ||
| 3. 끓는 때까지 전자 레인지에 가열합니다. 꺼내서 파이펫 끝으로 저어서 다시 끓입니다. 아가로즈가 용해될 때까지 반복합니다. | ||
| 4. 벤치에 빈 현미경 슬라이드를 놓습니다. | ||
| 5. 슬라이드 중간에 신선한 2 % 아가로즈 용액의 드롭 (~ 50 μL)을 넣습니다. | ||
| 6. 두 번째 현미경 슬라이드를 타고 아가로즈 드롭 위에 놓습니다. 부드럽게 아래로 눌러 방울을 평평하게합니다. | ||
| 7. 아가로즈가 30초 동안 굳어지고 상단 현미경 슬라이드를 부드럽게 제거하십시오. | ||
| 8. 아가로즈 패드가 약 5 분 이내에 건조하기 시작하기 때문에 즉시 샘플 준비를 진행합니다. | ||
| 팁: 습도를 더 오래 보존하기 위해 상단 현미경 슬라이드를 덮개로 둡니다(~ 1시간). 따라서, 몇몇 아가로즈 패드는 실험 중에 신속하게 제조및 사용될 수 있다. | ||
| LB 액체 매체 | 1. 바토트립톤 10g, 바토 효모 추출물 5g, 나Cl 5g을 증류수 1L 및 오토클레이브에 녹입니다. | |
| M9 버퍼 | 1. KH2PO4,Na2HPO46 g, 1 L 증류수 및 오토클레이브에 5 g NaCl을 용해하십시오. | |
| 2. 식히고 1 M MgSO4 (멸균)의 1 mL을 추가하십시오. | ||
| 3. 4 °C에서 M9 버퍼를 저장합니다. | ||
| 선충 성장 매체(NGM) 천판 | 1. NaCl 3 g, bactopeptone 2.5 g, 연쇄상 구균 0.2 g, 17 g의 천을 넣고 증류수 900mL를 추가합니다. 오토 클레이 브. | |
| 2. 55-60 °C로 식히십시오. | ||
| 3. 콜레스테롤 스톡 용액 1mL, M CaCl2mL1mL, 1m MgSO4,니스타틴 재고 용액 1mL, 멸균 1M 인산염 완충제, pH 6.0 및 증류멸수 최대 1L을 추가합니다. | ||
| 4. 페트리 접시 당 중간 크기의 파이펫 10 mL을 고화로 둡니다. | ||
| 5. 사용 될 때까지 4 °C에서 접시를 저장합니다. | ||
표 1: 사용 시약에 권장하는 레시피입니다. 제시된 프로토콜에 사용되는 모든 시약 레시피는 여기에 설명되어 있습니다.
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Discussion
단백질 합성 변조는 유기체 항상성에 필수적입니다. 노화 하는 동안, 글로벌 뿐만 아니라 특정 단백질 합성 혼란. 최근 연구에 따르면 단백질 번역 균형이 노화와 노화를 직접 제어하는 것은 단순히 노화 과정의 부산물이 아니라는 사실을 보여줍니다. 특히, 진핵 개시인자 4E(eIF4E)와 같은 번역 기계류의 핵심 성분은 번역 개시 시 mRNA 캡핑을 용이하게 하고, 따라서 캡 의존성 단백질 번역의 속도를 용이하게 하고, 산화 스트레스를 유도하고 노화 과정을 가속화한다1. 더욱이, mRNA 처리체, P바디와 상호작용하고 mRNA 절충의 비율을 증가시키는 뉴런 특이적 EDC-3도 노화 공정8을가속화한다. 구체적으로, EDC-3 억제는 IFE-2 분리를 P 체체로 분리하여 궁극적으로 단백질 번역 수준을 감소시키고, 뉴런 노화를 지연시키는9를허용한다.
FRAP는 생체 내 라이브 이미징을 사용하여 비침습적 형광 태깅을 통해 단백질 역학, 국소화, 상호 작용 및 활동을 조사하기 위해8처음 개발된 기술로,8,10에서단백질 합성율을 실시간으로 연구할 수 있는 강력한 도구이다. 그러나 주의와 문제 해결이 필요한 특정 중요한 단계가 있습니다. 당사는 실험 절차 중에 발생하는 이러한 잠재적 장애물이나 한계에 대한 대체 솔루션을 제공합니다.
한 가지 문제는 벌레가 광표백 중에 광원을 탈출할 수 있기 때문에 웜 이동에 관한 것입니다. 이 문제는 동물이 부비동성 방식으로 움직이게 하는 롤-6(su1006) 대립 유전자를 표현하는 형질 전환 동물을 사용하여 부분적으로 극복될 수 있다. 이러한 방식으로 동물 광표백은 지속적으로 수행될 수 있다. 또한, 실험자는 보기의 평면 밖으로 이동하는 웜의 움직임을 훨씬 느리게 따를 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 한천 패드는 동물을 완전히 고정하는 대안으로 사용할 수도 있습니다.
포토표백의 최적 지속 시간은 실험 전반에 걸쳐 결정되고 안정적으로 유지해야 하는 추가적인 중요 요소입니다. 대상 된 광표백 또는 짧은 기간으로 인해 부족한 광표백이 발생할 수 있습니다. 이는 배율 목표 및 수치 조리개, (b) 광 강도 및/또는 (c) 광표백 지속 시간을 증가시킴으로써 능가될 수 있다.
중요한 형광 복구가 감지되지 않으면 변경할 수 있는 잠재적인 매개 변수가 있습니다. 광표백이 과도하다면 표본 손상이 발생함에 따라 광표백 기간을 줄입니다. 벌레의 손상은 터치 감도, 운동, 계란 누워, 인두 펌핑 및 생식 능력과 같은 생명 특성을 관찰하여 평가 될 수 있습니다. 단백질 번역 회복의 운동학이 느린 경우에, 더 긴 복구 기간을 허용하십시오. 단백질 합성 회복은 단백질 제품군마다 다르며 기자 융합 길이7에따라 다릅니다.
프로모터 활동은 단백질 합성의 운동학에 영향을 미칠 수 있습니다. 프로모터가 복구 중에 비활성 상태인 경우 사용되는 프로모터를 변경합니다. 발기인 활동은 광손상과 같은 스트레스 조건에 따라 변경될 수 있습니다. 안정적인 활동 프로모터를 사용하여 글로벌(예: let-858, ife-2, sod-3)또는 조직별(예: 체벽 근육)을 모니터링합니다. myo-3, unc-54; 인두 : 묘 -2; 범뉴런: unc-119, rab-3; 메카노 감각 뉴런 : mec-4; 장: vha-6, ges-1)단백질 번역 율.
사이클로헤시미드에 의한 부적절한 단백질 번역 억제가 발생하면 선충의 배양 전 시간을 늘리면 이 문제를 극복할 수 있습니다. 고려해야 할 주의 사항은 단백질을 과발현하는 형질 전환벌레의 사용입니다. CRISPR/Cas9 생성 된 형질 전환선충을 사용하여 생리 학적 수준에서 관심있는 형광 태그 단백질을 표현하는 단백질 운동 및 회전율의 보다 정확한 그림을 제공 할 것입니다.
검출된 총 단백질 수준은 단백질 분해 및 합성 속도의 결과입니다. 단백질 분해는 모든 진핵 세포의 기저 수준에서 변함없이 발생합니다. 따라서, 이 프로토콜에서 측정되는 단백질 형광 회수율은 절대적이지 않고 비교되는 조건에 상대적이다. 본질적으로, 단백질 분해의 존재에서 형광 회복이 측정된다. 따라서, 모든 조건은 광표백 후 동등한 단백질 분해율을 가지고 있다고 가정한다. 절대 단백질 번역 율을 측정하기 위해 단백질 분해-결핍 돌연변이 벌레 균주를 사용해야 합니다. 구체적으로, 자가식용 프로테좀 또는 lgg-2의 rpn-10과 같은 유전자의 돌연변이는대조군(11)으로사용될 수 있다. 대안적으로, 프로테아소말 및 자가성 단백질의 RNAi 녹다운을 수행할 수 있다. 또한, SQST-1::GFP와 같은 자가기기판은 선택된 실험 조건 하에서 자가분해의 기여를 검출하는 데 사용될 수있다.
두 실험 환경에서, 이 FRAP 기술은 C. elegans에 있는 다른 조직에서 생체내 de novo 단백질 합성 비율을 검출하는 비 방사성, 비 침습적입니다. 그것은 생체 내 설정및 그들의 일생 동안 동물의 후속 감시에 있는 광표백의 전후 도중 살아있는 화상 진찰을 허용합니다. 번역 개시의 왜곡은 노화를 감속, 따라서 FRAP에 의해 글로벌 단백질 합성 속도를 측정하는 것은 노화 과정의 직접 읽기로 사용될 수있다. 이 프로토콜은 노화 과정 또는 노화 관련 질병과 관련된 유전자 및/또는 화학 물질을 선별하기 위해 더 큰 규모로 최적화및 사용될 수 있다. 대안적으로, 총 또는 특정 단백질 분해율은 사이클로헤시미드와 함께 동일한 프로토콜을 사용하여 다른 유전 배경하에서 광표백에 의해 측정될 수 있다. 단백질 번역이 사이클로헨시미드에 의해 억제됨에 따라 단백질 분해 속도가 검출됩니다. 이 프로토콜은 단백질 응집질환(13)의유전 적 모델에서 단백질 분해 경로를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것이다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
비디오 녹화 및 편집에 대한 차니오타키스 M. 및 쿠나키스 K. 감사드립니다. K.P.는 그리스 연구 혁신 재단(HFRI)과 연구 기술 총무사(GSRT)의 보조금으로 지원받고 있습니다. N.T.는 유럽 연구 위원회 (ERC – GA695190 – MANNA), 유럽 위원회 프레임 워크 프로그램 및 그리스 교육부의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
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